CN110791462A

CN110791462A - 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

Info

Publication number: CN110791462A
Application number: CN201911291412.4A
Authority: CN
Inventors: 王健; 周旭波; 方培新; 王华萱
Original assignee: Jiangsu Ac Biotech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Ac Biotech Co ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110791462B

Abstract

一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ACA301，该枯草芽孢杆菌ACA301保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.16753。本发明中的枯草芽孢杆菌ACA301，菌种稳定性大大提高，在技术上取得了突破性的进展，采用该菌种发酵生产腺苷，产率和转化率具有相对较高水平，具有显著先进性，并且发酵原材料易得、培养条件粗放、控制工艺简单，适合进行工业化生产，具有较好的工业化应用前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

技术领域

本发明生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用。

背景技术

腺苷(Adenosine)，化学名6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，腺苷属于重要的核苷酸衍生物，是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物。作为一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢。腺苷在生物化学上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸(ATP)或腺苷双磷酸(ADP)形式转移能量，或是以环状腺苷单磷酸(cAMP)进行信号传递等。此外，腺苷还是一种抑制性神经传导物，在神经传递中起重要作用。腺苷被广泛应用于医药等行业，具有巨大的商业价值。

腺苷作为一种重要的核苷酸类衍生物，吸引了国内外大量研究人员投入腺苷发酵生产技术的研究。目前，腺苷发酵菌种对原材料、培养条件和控制工艺都要求较高，菌种稳定性差，发酵产率和转化率相对处于较低水平，原材料及能耗较大，生产成本偏高，造成国内外的腺苷生产厂家较少，生产的腺苷不能满足市场需求。我国原料丰富，市场巨大，对腺苷的需求也必将越来越大，因此，提高腺苷的生产能力及水平对我国国民经济发展起着重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACA301，该枯草芽孢杆菌ACA301保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.16753。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述枯草芽孢杆菌ACA301在发酵生产腺苷中的应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，包含如下步骤：

步骤1：菌种培养

将枯草芽孢杆菌ACA301菌种接种于无菌活化培养基中，28～40℃培养18～24小时至长出新鲜菌体，得到活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种；然后将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；

步骤2：将步骤1制得的对数生长期的菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，培养至30～72小时结束培养，得到腺苷发酵液；

步骤3：对步骤2得到的腺苷发酵液采用微膜过滤，得到菌体和微滤清液，菌体经过板框过滤得到菌体蛋白，将微滤清液通过超滤***得到超滤清液，然后对超滤清液进行脱色处理得到脱色液，将脱色液进行减压蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，过滤或离心分离去除母液，得到腺苷粗品，将腺苷粗品重新溶解，再经脱色处理，然后进行重结晶，对重结晶得到的腺苷晶体进行干燥，得到腺苷成品。

优选的技术方案为：每升所述无菌活化培养基包含葡萄糖1～10g、蛋白胨2～20g、牛肉膏2～20g、酵母浸粉2～20g、玉米浆5～30g、氯化钠1～10g、琼脂5～50g、微量元素1份。

优选的技术方案为：每升所述种子培养基包含葡萄糖1～20g、玉米浆1～30g、酵母粉0.1～10g、硫酸镁0.01～1g、磷酸二氢钾0.01～5g、微量元素1份。

优选的技术方案为：每升所述发酵培养基包含葡萄糖5～50g、玉米浆1～40g、酵母浸粉0.1～20g、磷酸氢二钾0.1～5g、硫酸镁0.01～2g、硫酸铵0.01～3g和微量元素1份。

优选的技术方案为：将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期时的菌种培养条件为：温度28～40℃，pH值6.5～7.5，溶氧≥10％，发酵罐的罐压为0.02～0.05MPa。

优选的技术方案为：步骤2的发酵培养控制条件：温度28～40℃，pH值6.5～7.5，溶氧≥10％，发酵罐的罐压0.02～0.10MPa，发酵过程中补糖，残糖含量控制在0.05～5.0％。

优选的技术方案为：步骤3中，微膜过滤的设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为8nm～100nm；超滤***截留分子量为800～5000D；对超滤清液进行脱色处理采用活性炭脱色、树脂脱色或纳滤脱色；蒸发浓缩结晶采用的设备为多效蒸发结晶器，浓缩真空度为-0.05～-0.09MPa，蒸发温度为50～85℃，浓缩比为3～8倍；冷却结晶的设备为冷结晶器，采用阶梯降温控制方式，最低温度为0～10℃，冷却结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液；重结晶后使用板框过滤机或离心机去除母液。

优选的技术方案为：微量元素包括铁、镁、锌、铜、锰、钠和钾。

优选的技术方案为：微量元素1份是指每升所述无菌活化培养基含有微量元素0.5-1.5g；每升所述种子培养基含有微量元素0.5-1.5g；每升所述发酵培养基含有微量元素0.5-1.5g。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1、本发明通过将枯草芽胞杆菌CICC10082进行诱变育种等改造工艺，筛选得到本申请中已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为CGMCCNo.16753的枯草芽孢杆菌ACA301。该菌株具有独特的生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和应用。

2、本发明中的枯草芽孢杆菌ACA301，菌种稳定性大大提高，在技术上取得了突破性的进展，采用该菌种发酵生产腺苷，产率和转化率具有相对较高水平，具有显著先进性，并且发酵原材料易得、培养条件粗放、控制工艺简单，适合进行工业化生产，具有较好的工业化应用前景。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

生物材料的保藏：一株枯草芽孢杆菌ACA301，其分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏时间为2018年11月19日，菌种保藏编号为CGMCC No.16753，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例1：一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

一株枯草芽孢杆菌ACA301，其分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏时间为2018年11月19日，菌种保藏编号为CGMCC No.16753。

所述枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，包含以下步骤：

(1)菌种培养，取保藏的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接种于无菌活化培养基中，34℃培养21小时至长出新鲜菌体，将种子培养基进行灭菌，冷却至40℃，pH调至7，将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度34℃，pH值7，溶氧为12％，罐压0.035MPa。

(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至40℃，pH调至7，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，培养至46小时结束培养，得到腺苷发酵液。发酵培养控制条件：温度34℃，pH值7，溶氧为11％，罐压0.06MPa，发酵过程中补糖，残糖含量控制在0.25％。

(3)提取纯化，将步骤(2)得到的腺苷发酵液依次通过微膜过滤去除菌体，得到微滤清液，菌体经过板框过滤得到菌体蛋白，将微滤清液通过超滤***去除蛋白等杂质，得到超滤清液，将超滤清液进行脱色处理得到脱色液，将脱色液进行减压蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步过滤或离心分离去除母液，得到腺苷粗品，将腺苷粗品重新溶解，使用活性炭或纳滤进行脱色处理，然后进行重结晶，将重结晶得到的腺苷晶体进行干燥，得到腺苷成品，重结晶分离出的母液加入超滤清液中。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中菌种活化培养基包含葡萄糖5.5g/L、蛋白胨11g/L、牛肉膏11g/L、酵母浸粉11g/L、玉米浆17.5g/L、氯化钠5.5g/L、琼脂27.5g/L、微量元素1份。微量元素是锌、铜、锰、钠、钠和钾等比例构成的混合物。微量元素1份是指每升所述无菌活化培养基含有微量元素1g。

其中菌种培养的培养基包含葡萄糖11.5g/L、玉米浆15.5g/L、酵母粉5.05g/L、硫酸镁0.55g/L、磷酸二氢钾2.55g/L、微量元素1份。微量元素为铁、镁按照1：1的质量比例构成的混合物。微量元素1份是指1g。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中发酵培养的培养基包含葡萄糖27.5g/L、玉米浆20.5g/L、酵母浸粉10.5g/L、磷酸氢二钾2.55g/L、硫酸镁1.05g/L、硫酸铵1.55g/L、微量元素1份。微量元素为铁。

微量元素1份是指每升所述发酵培养基含有微量元素1g。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中微膜过滤设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为50nm，超滤***截留分子量为3000D，脱色***为活性炭脱色或树脂脱色或纳滤脱色，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，浓缩真空度为-0.07MPa，蒸发温度为67℃，浓缩比为5倍，冷却结晶设备为冷结晶器，采用阶梯降温控制方式，最低温度为5℃，冷却结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液，腺苷粗品溶解后可使用活性炭或纳滤进行脱色，重结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液。

通过该种方式培养，采用30L发酵罐培养，发酵培养至60h，产腺苷55.48g/L，转化率20.95％。经过提取纯化，得到腺苷晶体748.9。

转化率计算公式＝(发酵液体积L×发酵产率g/L)/发酵总耗糖量g×100％。

实施例2：一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

(1)菌种培养，取保藏的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接种于无菌活化培养基中，28℃培养18小时至长出新鲜菌体，将种子培养基进行灭菌，冷却至40℃，pH调至6.5，将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度28℃，pH值6.5，溶氧为10％，罐压0.02MPa。

(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至40℃，pH调至6.5，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，培养至30小时结束培养，得到腺苷发酵液。发酵培养控制条件：温度28℃，pH值6.5，溶氧为10％，罐压0.02MPa，发酵过程中补糖，残糖含量控制在0.05％。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中菌种活化培养基包含葡萄糖1g/L、蛋白胨2g/L、牛肉膏2g/L、酵母浸粉2g/L、玉米浆5g/L、氯化钠1g/L、琼脂5g/L、微量元素1份。微量元素为钠和钾按照1：2的质量比例构成的混合物。

优选的技术方案为：微量元素1份是指每升所述无菌活化培养基含有微量元素0.5g。

其中菌种培养的培养基包含葡萄糖1g/L、玉米浆1g/L、酵母粉0.1g/L、硫酸镁0.01g/L、磷酸二氢钾0.01g/L、微量元素1份。微量元素是镁。每升所述种子培养基含有微量元素0.5g。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中发酵培养的培养基包含葡萄糖5g/L、玉米浆1g/L、酵母浸粉0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.01g/L、硫酸铵0.01g/L、微量元素1份。微量元素是锌。每升所述发酵培养基含有微量元素1.5g。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中微膜过滤设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为8nmnm，超滤***截留分子量为800D，脱色***为活性炭脱色或树脂脱色或纳滤脱色，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，浓缩真空度为-0.05MPa，蒸发温度为50℃，浓缩比为3倍，冷却结晶设备为冷结晶器，采用阶梯降温控制方式，最低温度为0℃，冷却结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液，腺苷粗品溶解后可使用活性炭或纳滤进行脱色，重结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液。

通过该种方式，采用50吨发酵罐培养，发酵培养至66h，产腺苷46.75g/L，转化率20.17％。经过提取纯化，得到腺苷晶体1.32吨，经过检测产品质量符合《中国药典》2015版标准。

实施例3：一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

本发明中所述枯草芽孢杆菌ACA301的诱变筛选方法如下：

以枯草芽胞杆菌CICC10082为出发菌，经过多次硫酸二乙酯(DES)化学诱变、紫外诱变，再经分离纯化，筛选获得具有底物抗性和遗传标记的腺苷高产菌株。

出发菌：枯草芽胞杆菌CICC10082

出发菌特性：G+，菌体不规则，运动。菌落圆形，表面光滑，低凸面，边缘缺刻状，灰白色，半透明。液体培养混浊。明胶液化。V.P阳性，M.R.阳性，H2S阳性，脲酶阴性，接触酶阳性，好氧。最适生长温度28～32℃，最高生长温度50℃，石蕊牛奶反应产碱、胨化，利用硝酸盐。

DES诱变处理方法：从新鲜斜面上接一环枯草芽孢杆菌入种子培养基30mL/500mL锥形瓶，在30～32℃、160r/min下培养12～18h；离心沉降10min(3000r/min)收集菌体细胞，用无菌生理盐水洗涤三次，然后用pH7.0～7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤一次后，将打散的菌体细胞悬液悬浮于30mL含有0.5～2.0mL硫酸二乙酯(DES)的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.2)中，32℃下震荡处理0.25～1h；反应后用硫代硫酸钠溶液终止反应，离心收集菌体细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入培养基中培养24小时，单菌落分离筛选。

紫外诱变处理方法：将在斜面培养基上生长20h的菌种接种到种子培养基中，培养16～18h，用0.1mol/L、pH7.0～7.2磷酸缓冲液洗涤三次后，稀释成浓度为10^8-9/ml细胞，制成菌悬液。吸取单细胞悬液5ml，置于预先干热灭菌处理的培养皿中，培养皿中再放入预先灭过菌的转子，用15瓦紫外灯照射，照射距离30cm，照射时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，适当稀释后涂布于平板，32℃恒温培养72h后，计算不同照射时间的致死率，以照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死曲线，根据致死曲线，选取致死率在70％～80％的照射时间进行多次紫外诱变处理，将诱变处理的菌体分离单菌落筛选。

腺嘌呤脱氨酶阴性菌株的筛选方法：根据代谢工程理论的指导，通过阻断AMP→IMP代谢途径才能使合成的腺苷大量积累，即选育缺失腺嘌呤脱氨酶的突变株。腺嘌呤脱氨酶可以解除8-氮鸟嘌呤对菌株的毒害作用，在培养基中添加50mg/L的8-氮鸟嘌呤(8-AG)，筛选在该培养基上不能生长的突变株，就获得了腺嘌呤脱氨酶阴性遗传特性的菌株。

抗性突变株筛选方法：配置基本培养基，灭菌后加入适量的结构类似物(8-氮鸟嘌呤、8-氮黄嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、6-氯嘌呤、6-巯基嘌呤、磺胺胍)，使平板中的结构类似物浓度分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L，再在各个不同浓度结构类似物平板上涂布适量的诱变菌的菌悬液，观察生长情况，根据诱变菌株耐受结构类似物的浓度确定筛选用结构类似物浓度。将诱变处理的菌液涂布在含有上述方法确定浓度的筛选平板上，置32℃培养箱中培养2～3天，随机挑选生长菌落进行摇瓶筛选。

将得到的含有抗性标记的高产腺苷突变株，接入装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中32℃振荡培养24h后，以20％的接种量将种子液接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，32℃振荡培养36～48h，筛选出产量较高的菌株。

将最终获得的一株腺苷高产菌株ACA301，在摇瓶水平上考察出发菌和突变菌株的腺苷发酵性能，结果如表1所示。从表1中可以看出，突变菌株的腺苷产率和转化率要高出很多。

表1出发菌和突变菌株发酵腺苷的性能比较

菌号	腺苷产率(g/L)	转化率(％)
			出发菌CICC10082	0	0
突变菌株ACA301	15.48	13.4

遗传稳定性试验：将上述筛选获得的腺苷高产菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，每一代菌株先进行种子培养，并进行遗传标记实验和发酵产率实验。摇瓶传代方法：把腺苷高产菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至下一代摇瓶。

将连续传代10次的每一代菌株分别使用30L发酵罐培养，检测发酵结束的腺苷产率，考察菌株的遗传稳定性。结果如表2所示：

表2菌株ACA301的遗传稳定性

传代次数	腺苷产率(g/L)
		1	52.1
2	53.4
		3	49.8
4	50.2
		5	51.9
6	52.6
		7	50.5
8	53.5
		9	52.3
10	51.8

从表2中可以看出，突变菌株ACA301的遗传稳定性良好，连续传代10次在30L发酵罐培养结束的腺苷产率基本稳定在50g/L左右，腺苷发酵生产技术水平取得了较大进步，更适于工业化生产。

对该菌株进行传代保藏，命名为枯草芽孢杆菌ACA301，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其分类命名为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，保藏时间为2018年11月19日，菌种保藏编号为CGMCC No.16753，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

中国科学院微生物研究所对枯草芽孢杆菌ACA301的细胞形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列(其基因序列如SEQ NO.1所示)、gyrB基因序列(其基因序列如SEQ NO.2所示)等项目进行了检测鉴定，检测鉴定报告编号(2018)微检字第476号，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏***细菌手册》以及International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology有关研究论文，菌株编号ACA301的鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，包含以下步骤：

(1)菌种培养，取保藏的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接种于无菌活化培养基中，28～40℃培养18～24小时至长出新鲜菌体，将种子培养基进行灭菌，冷却至40℃左右，pH调至6.5～7.5，将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度28～40℃，pH值6.5～7.5左右，溶氧≥10％，罐压0.02～0.05MPa。

(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至40℃左右，pH调至6.5～7.5，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，培养至30～72小时结束培养，得到腺苷发酵液。发酵培养控制条件：温度28～40℃，pH值6.5～7.5，溶氧≥10％，罐压0.02～0.10MPa，发酵过程中补糖，残糖含量控制在0.05～5.0％。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中菌种活化培养基包含葡萄糖1～10g/L、蛋白胨2～20g/L、牛肉膏2～20g/L、酵母浸粉2～20g/L、玉米浆5～30g/L、氯化钠1～10g/L、琼脂5～50g/L、微量元素1份；其中菌种培养的培养基包含葡萄糖1～20g/L、玉米浆1～30g/L、酵母粉0.1～10g/L、硫酸镁0.01～1g/L、磷酸二氢钾0.01～5g/L、微量元素1份。微量元素是铁、锌、铜按照1：1：3的质量比例构成的混合物。微量元素1份是指每升所述无菌活化培养基含有微量元素1.5g。

所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，其中发酵培养的培养基包含葡萄糖5～50g/L、玉米浆1～40g/L、酵母浸粉0.1～20g/L、磷酸氢二钾0.1～5g/L、硫酸镁0.01～2g/L、硫酸铵0.01～3g/L、微量元素1份。

本发明所述的枯草芽孢杆菌ACA301及其在发酵生产腺苷中的应用，菌种稳定性大大提高，取得了突破性的进展，采用该菌种发酵生产腺苷，产率和转化率具有相对较高水平，具有显著先进性，并且发酵配方原材料简单易得、工艺控制简单。经过50吨发酵罐生产，生产技术水平稳定，产品质量达到《中国药典》2015版标准。本发明技术适合进行工业化生产推广，具有显著的先进性和较好的应用前景。

实施例4：一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACA301，该枯草芽孢杆菌ACA301保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.16753。

所述枯草芽孢杆菌ACA301在发酵生产腺苷中的应用。

一种枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，包含如下步骤：

步骤1：菌种培养

将枯草芽孢杆菌ACA301菌种接种于无菌活化培养基中，40℃培养24小时至长出新鲜菌体，得到活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种；然后将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；

步骤2：将步骤1制得的对数生长期的菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，培养至72小时结束培养，得到腺苷发酵液；

优选的实施方式为：每升所述无菌活化培养基包含葡萄糖10g、蛋白胨20g、牛肉膏20g、酵母浸粉20g、玉米浆30g、氯化钠10g、琼脂50g、微量元素1份。微量元素包括铜。微量元素1份是指每升所述无菌活化培养基含有微量元素0.5-1.5g。

优选的实施方式为：每升所述种子培养基包含葡萄糖20g、玉米浆30g、酵母粉10g、硫酸镁1g、磷酸二氢钾5g、微量元素1份。微量元素是钠。每升所述种子培养基含有微量元素1.5g。

优选的实施方式为：每升所述发酵培养基包含葡萄糖50g、玉米浆40g、酵母浸粉20g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁2g、硫酸铵3g和微量元素1份。微量元素为锰。每升所述发酵培养基含有微量元素1.5g。

优选的实施方式为：将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期时的菌种培养条件为：温度40℃，pH值7.5，溶氧为10.5％，发酵罐的罐压为0.05MPa。

优选的实施方式为：步骤2的发酵培养控制条件：温度40℃，pH值7.5，溶氧为11％，发酵罐的罐压0.10MPa，发酵过程中补糖，残糖含量控制在0.05～5.0％。

优选的实施方式为：步骤3中，微膜过滤的设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为100nm；超滤***截留分子量为5000D；对超滤清液进行脱色处理采用活性炭脱色、树脂脱色或纳滤脱色；蒸发浓缩结晶采用的设备为多效蒸发结晶器，浓缩真空度为-0.09MPa，蒸发温度为85℃，浓缩比为8倍；冷却结晶的设备为冷结晶器，采用阶梯降温控制方式，最低温度为10℃，冷却结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液；重结晶后使用板框过滤机或离心机去除母液。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

序列表

<110> 江苏澳创生物科技有限公司

<120> 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用

<130> 20191216

<160> 2

<210> 1

<211> 1370

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> 16S rRNA基因序列

<400> 1 ACCGACTTCG GGTGTTACAA ACTCTCGTGG TGTGACGGGC GGTGTGTACA AGGCCCGGGAACGTATTCAC CGCGGCATGC TGATCCGCGA TTACTAGCGA TTCCAGCTTC ACGCAGTCGA GTTGCAGACTGCGATCCGAA CTGAGAACAG ATTTGTGGGA TTGGCTTAAC CTCGCGGTTT CGCTGCCCTT TGTTCTGTCCATTGTAGCAC GTGTGTAGCC CAGGTCATAA GGGGCATGAT GATTTGACGT CATCCCCACC TTCCTCCGGTTTGTCACCGG CAGTCACCTT AGAGTGCCCA ACTGAATGCT GGCAACTAAG ATCAAGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAA CCCAACATCT CACGACACGA GCTGACGACA ACCATGCACC ACCTGTCACT CTGCCCCCGAAGGGGACGTC CTATCTCTAG GATTGTCAGA GGATGTCAAG ACCTGGTAAG GTTCTTCGCG TTGCTTCGAATTAAACCACA TGCTCCACCG CTTGTGCGGG CCCCCGTCAA TTCCTTTGAG TTTCAGTCTT GCGACCGTACTCCCCAGGCG GAGTGCTTAA TGCGTTAGCT GCAGCACTAA GGGGCGGAAA CCCCCTAACA CTTAGCACTCATCGTTTACG GCGTGGACTA CCAGGGTATC TAATCCTGTT CGCTCCCCAC GCTTTCGCTC CTCAGCGTCAGTTACAGACC AGAGAGTCGC CTTCGCCACT GGTGTTCCTC CACATCTCTA CGCATTTCAC CGCTACACGTGGAATTCCAC TCTCCTCTTC TGCACTCAAG TTCCCCAGTT TCCAATGACC CTCCCCGGTT GAGCCGGGGGCTTTCACATC AGACTTAAGA AACCGCCTGC GAGCCCTTTA CGCCCAATAA TTCCGGACAA CGCTTGCCACCTACGTATTA CCGCGGCTGC TGGCACGTAG TTAGCCGTGG CTTTCTGGTT AGGTACCGTC AAGGTACCGCCCTATTCGAA CGGTACTTGT TCTTCCCTAA CAACAGAGCT TTACGATCCG AAAACCTTCA TCACTCACGCGGCGTTGCTC CGTCAGACTT TCGTCCATTG CGGAAGATTC CCTACTGCTG CCTCCCGTAG GAGTCTGGGCCGTGTCTCAG TCCCAGTGTG GCCGATCACC CTCTCAGGTC GGCTACGCAT CGTTGCCTTG GTGAGCCATTACCTCACCAA CTAGCTAATG CGCCGCGGGT CCATCTGTAA GTGGTAGCCG AAGCCACCTT TTATGTTTGAACCATGCGGT TCAAACAACC ATCCGGTATT AGCCCCGGTT TCCCGGAGTT ATCCCAGTCT TACAGGCAGGTTACCCACGT GTTACTCACC CGTCCGCCGC TAACATCAGG GAGCAAGCTC

<210> 2

<211> 1128

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> gyrB 基因序列

<400> 2 TTACACGGTG TAGGTGCGTC GGTCGTAAAC GCACTATCAA CAGAGCTTGA TGTGACGGTTCACCGTGACG GTAAAATTCA CCGCCAAACC TATAAACGCG GAGTTCCGGT TACAGACCTT GAAATCATTGGCGAAACGGA TCATACAGGA ACGACGACAC ATTTTGTCCC GGACCCTGAA ATTTTCTCAG AAACAACCGAGTATGATTAC GATCTGCTTG CCAACCGCGT GCGTGAATTA GCCTTTTTAA CAAAGGGCGT AAACATCACGATTGAAGATA AACGTGAAGG ACAAGAGCGC AAAAATGAAT ACCATTACGA AGGCGGAATT AAAAGTTATGTAGAGTATTT AAACCGCTCT AAAGAGGTTG TCCATGAAGA GCCGATTTAC ATTGAAGGCG AAAAGGACGGCATTACGGTT GAAGTGGCTT TGCAATACAA TGACAGCTAC ACAAGCAACA TTTACTCGTT TACAAACAACATTAACACGT ACGAAGGCGG TACCCATGAA GCTGGCTTCA AAACGGGCCT GACTCGTGTT ATCAACGATTACGCCAGAAA AAAAGGGCTT ATTAAAGAAA ATGATCCAAA CCTAAGCGGA GATGACGTAA GGGAAGGGCTGACAGCGATT ATTTCAATCA AACACCCTGA TCCGCAGTTT GAGGGCCAAA CAAAAACAAA GCTGGGCAACTCAGAAGCAC GGACGATCAC CGATACGTTA TTTTCTACGG CGATGGAAAC ATTTATGCTG GAAAATCCAGATGCAGCCAA AAAAATTGTC GATAAAGGTT TAATGGCGGC AAGAGCAAGA ATGGCTGCGA AAAAAGCGCGTGAACTAACA CGCCGTAAGA GTGCTTTGGA AATTTCAAAC CTGCCCGGTA AGTTAGCGGA CTGCTCTTCAAAAGATCCGA GCATCTCCGA GTTATATATC GTAGAGGGTG ACTCTGCCGG AGGATCTGCT AAACAAGGACGCGACAGACA TTTCCAAGCC ATTTTGCCGC TTAGAGGTAA AATCCTAAAC GTTGAAAAGG CCAGACTGGATAAAATCCTT TCTAACAACG AAGTTCGCTC TATGATCACA GCGCTCGGCA CAGGTATCGG AGAAGACTTCAACCTTGAGA AAGCCCGT

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ACA301，该枯草芽孢杆菌ACA301保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.16753。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ACA301，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌ACA301在发酵生产腺苷中的应用。

3.一种采用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：包含如下步骤：

步骤1：菌种培养

将枯草芽孢杆菌ACA301菌种接种于无菌活化培养基中，28~40℃培养18~24小时至长出新鲜菌体，得到活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种；然后将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；

步骤2：将步骤1制得的对数生长期的菌种接入发酵培养基中进行发酵培养，培养至30~72 小时结束培养，得到腺苷发酵液；

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：每升所述无菌活化培养基包含葡萄糖1~10g、蛋白胨2~20g、牛肉膏2~20g、酵母浸粉2~20g、玉米浆5~30g、氯化钠1~10g、琼脂5~50g、微量元素1份。

5.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：每升所述种子培养基包含葡萄糖1~20g、玉米浆1~30g、酵母粉0.1~10g、硫酸镁0.01~1g、磷酸二氢钾0.01~5g、微量元素1份。

6.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：每升所述发酵培养基包含葡萄糖5~50g、玉米浆1~40g、酵母浸粉0.1~20g、磷酸氢二钾0.1~5 g、硫酸镁0.01~2g、硫酸铵0.01~3g和微量元素1份。

7.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：将活化后的枯草芽孢杆菌ACA301菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期时的菌种培养条件为：温度28~40℃，pH值6.5~7.5，溶氧≥10%，发酵罐的罐压为0.02~0.05 MPa。

8.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：步骤2的发酵培养控制条件：温度28~40℃，pH值6.5~7.5，溶氧≥10%，发酵罐的罐压0.02~0.10MPa，发酵过程中补糖，残糖含量控制在0.05~5.0%。

9.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：步骤3中，微膜过滤的设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为8nm~100nm；超滤***截留分子量为800~5000D；对超滤清液进行脱色处理采用活性炭脱色、树脂脱色或纳滤脱色；蒸发浓缩结晶采用的设备为多效蒸发结晶器，浓缩真空度为-0.05~-0.09MPa，蒸发温度为50~85℃，浓缩比为3~8倍；冷却结晶的设备为冷结晶器，采用阶梯降温控制方式，最低温度为0~10℃，冷却结晶后可使用板框过滤机或离心机去除母液；重结晶后使用板框过滤机或离心机去除母液。

10.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ACA301发酵生产腺苷的方法，其特征在于：微量元素包括铁、镁、锌、铜、锰、钠和钾；微量元素1份是指每升所述无菌活化培养基含有微量元素0.5-1.5g；每升所述种子培养基含有微量元素0.5-1.5g；每升所述发酵培养基含有微量元素0.5-1.5g。