CN106255882A - 用于检测铜绿假单胞菌的方法和装置 - Google Patents

Abstract

用于采用Lux‑R样受体驱动的报道细胞检测和诊断气体、液体或固体样品中的铜绿假单胞菌的方法和装置。

Description

用于检测铜绿假单胞菌的方法和装置

发明领域和背景

本发明，在其一些实施方案中，涉及用于检测铜绿假单胞菌和表征其的挥发性有机化合物的装置和方法。

铜绿假单胞菌是造成多达~14%的所有医院感染和多达~23%的重症监护病房感染的革兰氏阴性细菌病原体。该细菌是烧伤感染和外耳感染(外耳炎 - 包括恶性外耳炎)的最常见原因，以及囊性纤维化患者中的最常见呼吸道病原体，导致高发病率和死亡率。铜绿假单胞菌感染的特征在于高抗生素耐药性，并且需要特殊治疗，通常组合使用两种不同的抗生素。因此，尽可能早地识别铜绿假单胞菌感染是非常重要的。如今使用的最常见方法是培养接种，其可以在两天内识别出铜绿假单胞菌。

铜绿假单胞菌细菌产生2-氨基苯乙酮(2-AA)，这是一种具有葡萄样气味的挥发性物质。使用离子-喷雾气相色谱分析，几项研究显示，2-AA可以在囊性纤维化患者的呼吸测试中充当铜绿假单胞菌感染的生物标志物(Metters等人, Analyst 2014; 16:3999,Scott-Thomas等人 BMC Pulm Med 2010; 10:56)。

2-AA已与铜绿假单胞菌中的细胞密度感应信号传导相关(参见，例如Bandyopadhaya等人, PLoS Patholog 2012；11月15日的在线出版物)，然而，对铜绿假单胞菌中的2-AA的信号传导途径和作用知之甚少。2- AA在铜绿假单胞菌中没有已知受体。

2-AA是一大类细菌挥发性有机化合物(VOC)、细菌代谢物之一，其已经证明可用于诊断多种疾病和病况，包括糖尿病、胃肠道和肝脏疾病、肺病、一些癌症和感染。例如，Reuther等人(美国专利申请US2014/0336081)教导了通过检测个体的呼吸、血液或组织中的微生物肺炎病原体的VOC特征而诊断肺炎。

理想地，VOC分析可最终消除对疑似感染或污染的细菌培养以识别病原体的需要。迄今为止，生物或非生物(医疗仪器、土壤、水等)样品中的VOC的分析主要基于气相色谱(GS)、质谱(MS)、组合GC-MS、化学发光、光吸收光谱***、“电子鼻”和气体传感器***。专用装置可能对于检测某些VOC是特别有效的：例如，火焰离子化检测气相色谱(GC-FID)、质子转移反应质谱(PTR-MS)。

由与VOC相互作用以生成向计算机发送信号输出(光学、电子)的物理或化学变化的专用或非选择性传感器组成的多维传感器阵列可生成样品组分的详细概况，然后可将其与疾病的存在与否相关联。然而，这样的“电子鼻”是复杂的、昂贵的并且需要复杂的计算能力来表征样品概况。识别指定配体的生物传感器、用于检测配体结合的生物传感器以及用于报道配体结合的装置，试图提供用于组分概况分析的基于生物的传感器***。Hseih等人的美国专利申请2004/019932描述了“人工鼻”的制造和使用，其将生物配体结合与基于压电的灵敏度结合起来。在Zupancic等人的美国专利申请2014/0273020中也教导利用杂交瘤细胞作为生物传感器的通用检测***。

Sayler等人(美国专利申请2003/0027241)公开了经基因工程改造的噬菌体和生物发光生物报道细胞，其在所述噬菌体感染靶微生物后发光。经由所述报道细胞的弧菌LuxR-luxCDABE构建体响应于靶细菌的携带Lux-I的噬菌体感染而产生生物发光。

Michelini等人(Biosensors & Bioelectronics 2005, 20, 2261-2267)和Leskinen等人(Chemosphere 2005, 61, 259-266)描述了用于使用重组酿酒酵母检测具有雄激素活性的化合物的生物发光测定。MMirasoli等人(Anal. Chem. 2002, 74, 5948-5953)描述了具有内部信号校正的细菌生物传感器。D'Souza S F (Microbialbiosensors. Biosens Bioelectron. 2001 August; 16(6):337-53)公开了将活细胞捕获于聚合物基质中，用于制造稳定的生物发光细胞生物传感器。Simpson M L等人(TrendsBiotech, 1998; 16:332-338)描述了生物发光微生物生物传感器，其中细胞被包封于聚合物基质中，以增加生物传感器稳定性。

台湾专利TW 239392公开了与特定信号处理结合以检测水毒性或营养特性的便携式生物传感***。该***是基于样品毒性对微生物生长的抑制。美国专利申请US 2008/032326公开了基于电渗透细胞和多种光合生物体的水质分析仪。

PCT申请WO2007083137公开了由能够基于挥发性物质的发散而检测特定被分析物的生物传感器构成的装置，基于使用琼脂、琼脂糖和藻酸盐(所有组分都通常用于固定细菌细胞)的基质而设想了固定程序。PCT申请WO2008152124公开了用作生物传感器的经工程改造的酵母细胞。

美国专利申请US 2003/162164A1公开了一种测试***，其中细胞借助悬浮介质而固定于多孔支持物上。

Nivens等人报道了使用细菌液体培养物的BBIC(生物发光生物报道集成电路)(Nivens, DE, J. Appl. Microbiol. 2004; 96(1):33-46)。

其它相关的出版物包括Hitt等人的US2007/0003996，Boots等人(J Breath Res.8, 2014 127106)，Winson等人(FEMS Microb Lett 1998 163:185-92)，Kereswani等人(PLoS pathogens, 2011, 7:e1002192)，Que等人(PLoS 2013 ONE 8: e80140)和Scott-Thomas等人(BMC Pulm Med 2010;10:56)。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种装置，其包括含有多核苷酸的报道细胞，所述多核苷酸包含编码能够产生可检测信号的报道分子的第一核酸序列和包含用于调节所述报道分子的转录的luxR样受体结合元件的第二核酸序列，其中所述报道细胞附接至固体支持物或包封于附接至固体支持物的包封基质内。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了检测生物样品中的2AA或其衍生物的方法，其包括使所述样品与本发明的装置接触，其中可检测信号的存在指示所述生物样品中的2-AA。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了诊断个体中的铜绿假单胞菌感染的方法，其包括使所述个体的生物样品与本发明的装置接触，其中检测到高于预定水平的信号表明所述样品中存在铜绿假单胞菌感染。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了检测测试样品中存在产生2-AA的生物体的方法，其包括使包含所述生物体的样品与本发明的装置接触，其中可检测信号的存在表明所述测试样品中存在产生2-AA的生物体。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于检测个体中的铜绿假单胞菌感染的***，所述***包括本发明的装置和用于检测可检测信号的传感器。

根据本发明的一些实施方案，所述细胞还包含编码能够结合2AA的luxR样受体的第三核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸包含第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述第三核酸序列包含在不同于所述多核苷酸的多核苷酸上。

根据本发明的一些实施方案，所述luxR样受体对于所述细胞是外来的。

根据本发明的一些实施方案，所述luxR样受体选自弧菌(Vibrio) LuxR样受体、果胶杆菌(Pectobacterium) LuxR样受体、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia) LuxR样受体、沙雷氏菌(Serratia) LuxR样受体、假单胞菌(Pseudomonas) LuxR样受体、色杆菌(Chromobacteria) LuxR样受体和盐单胞菌(Halomonas) LuxR样受体。

根据本发明的一些实施方案，所述细胞缺乏内源性luxR样表达。

根据本发明的一些实施方案，所述细胞缺乏内源性luxR样激动剂和/或拮抗剂。

根据本发明的一些实施方案，所述细胞缺乏luxI表达。

根据本发明的一些实施方案，所述可检测信号选自光信号、化学信号和电化学信号。

根据本发明的一些实施方案，所述可检测信号是生物发光。

根据本发明的一些实施方案，所述报道分子是报道多肽。

根据本发明的一些实施方案，所述报道多肽是荧光素酶。

根据本发明的一些实施方案，所述第一核酸序列包含luxCDABE基因簇。

根据本发明的一些实施方案，所述报道细胞选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、藻类细胞和动物细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述报道细胞是细菌细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述细菌细胞选自埃希氏菌属、假单胞菌属、弧菌属、葡萄球菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属、聚球蓝细菌属、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和青枯菌属。

根据本发明的一些实施方案，所述报道细胞是大肠杆菌。

根据本发明的一些实施方案，所述报道细胞位于包封基质内。

根据本发明的一些实施方案，所述报道细胞被固定于固体支持物上。

根据本发明的一些实施方案，所述报道细胞被定位成接触挥发性样品。

根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括用2 AA标准样品校准所述装置，以便将2AA的量或浓度分配给可检测信号的值。

根据本发明的一些实施方案，所述接触经由流体连通。

根据本发明的一些实施方案，所述接触经由气体连通。

根据本发明的一些实施方案，所述生物样品选自细菌培养物、细菌培养液、呼吸空气、汗液、唾液、痰液、血液、血浆、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、脑脊液、脑膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、***、脓液、***物、呕吐物、眼泪、组织活检样品、细胞培养物、环境空气、获得自伤口或烧伤的组织样品、获得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、***、伤口、烧伤或疑似具有感染的任何其它组织的拭子、痰以及粘液。

根据本发明的一些实施方案，所述生物样品是气体样品。

根据本发明的一些实施方案，所述气体样品是收集自选自以下的来源的顶部空间气体：动物或人患者的呼吸空气、汗液、唾液、痰液、血液、血浆、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、脑脊液、脑膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、***、脓液、***物、呕吐物、眼泪、组织活检样品、细胞培养物、环境空气、获得自伤口或烧伤的组织样品、获得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、***、伤口、烧伤或疑似具有感染的任何其它组织的拭子、痰、粘液、渗出物或呼气。

根据本发明的一些实施方案，所述气体样品包含疑似细菌种群的顶部空间气体。

根据本发明的一些实施方案，所述疑似细菌种群是疑似细菌感染。

根据本发明的一些实施方案，所述产生2-AA的生物体是铜绿假单胞菌。

根据本发明的一些实施方案，所检测到的2AA的量或模式指示铜绿假单胞菌感染。

根据本发明的一些实施方案，所述个体疑似患有中耳炎，而所述生物样品是耳部渗出物、从耳部渗出物收集的顶部空间气体或从患耳收集的顶部空间气体的样品。

根据本发明的一些实施方案，所述***还包括用于显示可检测信号的检测事件的显示器。

根据本发明的一些实施方案，所述***还包括与报道细胞经液体或气体连通的样品支架，其用于支托来自个体的生物样品用于检测。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同含义。尽管与本文所述的方法或材料相同或等效的方法或材料也可以用于实施或测试本公开的实施方案，但下文描述示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的，并不一定旨在是限制性的。

附图的几个视图的简述

本文参考附图仅通过示例的方式描述了本发明的一些实施方案。现在具体详细参考附图，强调的是，所示细节是通过示例的方式，并用于说明性讨论本发明的实施方案的目的。在这方面，对附图所作的描述使得可以如何实施本发明的实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。

在附图中：

图1是显示由铜绿假单胞菌的挥发物诱导大肠杆菌/pSB401报道菌株中的发光的图。在过夜暴露于铜绿假单胞菌(PA14)的挥发性化合物后测量大肠杆菌/pSB401的相对发光。从琼脂刮下报道菌株的菌落，悬浮于磷酸盐缓冲盐水中，并在96孔板中测量发光水平。误差条表示5次重复的标准偏差，且上方星号表示根据Mann-Whitney秩和检验的显著差异(p <0.01)；

图2是显示铜绿假单胞菌的总挥发物对表达LuxR的生物传感器的影响的图。如图1中测量表达LuxR响应调节物的大肠杆菌/pSB401报道菌株相应于铜绿假单胞菌(PAO1)的总挥发物或1pmol 3-氧代-C6-HSL (AHL)的相对发光水平。通过将1 pmol 3-氧代-C6-HSL添加至报道物(PAO1 + AHL)来检查挥发物的拮抗或协同效果。n=8；误差条是平均值的标准误差。不同字母表明根据Ranks的ANOVA和Student–Newman–Keuls事后检验的统计学差异(P<0.05)；

图3A-3B举例说明铜绿假单胞菌PAO1野生型和lasR –缺陷的突变型铜绿假单胞菌的挥发物概况。图3A：铜绿假单胞菌的野生型(PAO1-黑线)和lasR突变体(ΔlasR - 红线)的气相色谱图。图3B：铜绿假单胞菌野生型和ΔlasR菌株中的五种挥发物的丰度。n=3；误差条表示平均值的标准误差，星号表示根据student t-检验的ΔlasR (灰色)和PAO1野生型(黑色)之间的显著差异(P<0.05)。注意野生型铜绿假单胞菌挥发物中的2-AA的丰度。为了便于可视化，仅呈现12-20分钟的保留时间的结果。在这些保留时间之外，突变型菌株中的挥发物概况相比于野生型菌株没有实质性差异；

图4是显示2-AA和C6-HSL对大肠杆菌/pSB401发光的影响的图。如图1中测量大肠杆菌pSB401报道菌株在5nM C6-HSL (pSB401+C6HSL)或50μM 2-AA (pSB401+2AA)存在的情况下的相对发光。测量无任何添加的菌株的发光作为对照(pSB401)。在暴露于信号传导分子后20小时实施测量。误差条表示四次重复的标准偏差，且上方字母表示显著统计组ANOVA和事后Tukey (p<0.05)；

图5A和5B是显示2-AA和3-氧代-C6-HSL对表达LuxR的生物传感器的影响的图。将2-AA(0-500 µM)(黑色柱)和3-氧代-C6-HSL (0-500 nM)(红色柱)添加至大肠杆菌/pSB401(5A)和大肠杆菌JLD271/pAL103 (5B)报道菌株以评估2-AA对LuxR响应调节物的影响。对于拮抗/协同测定(3-氧代-C6-HSL + 2AA)，在10 nM 3-氧代-C6-HSL存在的情况下将0-500nM 2-AA添加至报道菌株。值表示暴露于信号传导分子后12小时进行的发光测量。n=4；误差条表示平均值的标准误差，星号表明根据ANOVA和Dunnett事后检验的相比于对照的统计学差异(P<0.01)；

图6是显示2-AA对费氏弧菌的LuxR调节的发光的影响的图。在18小时温育期间每半小时测量野生型费氏弧菌MJ-1在不存在2-AA和3-氧代-C6-HSL(对照，黑色圆形)和在存在25(空心圆形)、50(黑色三角形)和100μM(空心三角形) 2-AA以及10 nM 3-氧代-C6-HSL(黑色正方形)的情况下的发光。注意对100μM2-AA的有效响应；

图7是显示作为挥发物应用的2-AA对大肠杆菌/pSB401的发光的诱导的图。在过夜暴露于添加至双向petri皿的对侧隔室的1 μg 2-AA (1)之后测量相比于未接受任何添加的对照(0)的大肠杆菌/pSB401的相对发光。从琼脂刮下报道菌株的菌落，悬浮于PBS中，并在96孔板中测量。误差条表示四次重复的标准偏差，且星号表示根据t检验的各组之间的显著差异(P<0.05)；

图8是显示2-AA和C-12 HSL对铜绿假单胞菌LasR/pKD201发光的影响的图。在50μMC12-HSL (JP2+C12HSL)或2-AA (JP2+2AA)存在的情况下测定铜绿假单胞菌JP2/pKD201报道菌株的相对发光。测量无任何添加的菌株的发光作为对照(JP2)。在暴露于信号传导分子后10小时实施测量。误差条表示五次重复的标准偏差，且上方字母表示显著统计组，ANOVA和事后Tukey (p<0.05)；

图9是显示2AA和C4-HSL对铜绿假单胞菌的RhlR受体的影响的图。在50μM C4-HSL(RhlA+C4HSL)或2-AA (RhlA+2AA)存在的情况下的铜绿假单胞菌JP2/pKD-RhlA报道菌株的相对发光。测量无任何添加的菌株的发光作为对照(RhlA)。在暴露于信号传导分子后20小时实施测量。误差条表示六次重复的标准偏差，且上方字母表示显著统计组，ANOVA和事后Tukey (p<0.05)；

图10是显示2-AA和相关修饰分子对表达LuxR的生物传感器的影响的图。在暴露于50μM以下物质后测量大肠杆菌pSB401报道菌株的相对发光：2-氨基苯乙酮(2-AA)、3-氨基苯乙酮(3-AA)、4-氨基苯乙酮(4-AA)、2-硝基苯乙酮、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸、苯乙酮和2-氨基苯甲醛。测量在温育20小时之后。n=6；误差条表示平均值的标准误差。不同字母表明根据ANOVA和Student–Newman–Keuls事后检验的统计学差异(P<0.05)。每个分子的结构描绘于对应栏上方；

图11A和11B举例说明3-氧代-C6-HSL (11A)和2-AA (11B)与LuxR分子模型的生物信息学对接。相互作用显示为虚线并根据相互作用类型着色。氢键 - 绿色，疏水相互作用 - 粉红色；

图12是费氏弧菌(SEQ ID NO:1)、火神弧菌 (SEQ ID NO:2)、拟态弧菌(SEQ ID NO:3)、鳆发光杆菌(SEQ ID NO:4)和副溶血性弧菌(SEQ ID NO:5)的LuxR响应调节物(受体蛋白)的多重氨基酸序列比对(根据T-Coffee算法比对)。以红色标记与2-AA相互作用的残基；

图13A-13B是2-AA的质谱分析的图。图13A显示总离子色谱测量(TIC)；图123显示100ppm 2-AA标准样品的选择离子监测色谱(SIM)；

图14A-14C是显示脓液样品编号1的质谱分析的图。图14A显示总离子色谱测量(TIC)；图14B显示脓液样品的选择离子监测色谱(SIM)，且图14C显示如图14A中的2-AA 1ppm标准品(蓝色)和脓液样品编号1(红色)的TIC重叠图；

图15A-15B是脓液样品编号2的质谱分析的图。图15A显示总离子色谱测量(TIC)；图15B显示脓液样品的选择离子监测色谱(SIM)；

图16A-16B是显示使用质谱和报道菌株分析脓液样品中的2-AA的图。图16A显示图14和15中呈现的TIC分析的重叠图：1 ppm 2-AA标准品(红色)、铜绿假单胞菌阳性脓液样品1(绿色)、铜绿假单胞菌阴性脓液样品(黑色)；图16B显示在暴露于从脓液样品1(MS分析中2-AA阳性且培养测试中铜绿假单胞菌阳性)和脓液样品2(MS中2-AA阴性且培养测试中铜绿假单胞菌阴性)发出的挥发物后大肠杆菌pSB401报道菌株的相对发光；

图17是显示使用报道菌株分析马伤口样品中的2-AA的图。该图显示在暴露于从马伤口组织样品编号1(用抗生素治疗之后两天)和马伤口组织样品编号2(用抗生素治疗之后一周)发出的挥发物后大肠杆菌pSB401报道菌株的相对发光。

图18是显示本发明的装置的简化形式的示意图，其中代表性报道细胞固定于固体支持物上；

图19是显示本发明的装置的简化形式的示意图，其中代表性报道细胞包封于固体支持物上的可透气基质内；

图20是显示本发明的***的简化形式的示意图，其包括装置和传感器。

本发明具体实施方案的描述

本发明，在其一些实施方案中，涉及生物传感器装置，其包括附接至或包封于固体支持物内的报道细胞，所述细胞能够在接触luxR样受体配体后产生可检测信号。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解的是，本发明在其申请中不必限于以下描述中记载或由实施例列举的细节。本发明能够有其它实施方案或者能够以各种方式实施或进行。

有效并可靠地检测和识别细菌是医学、环境科学和工业中持续面临的挑战。常规方法通常需要费时且费钱地培养疑似含有细菌的样品材料，用于通常复杂的分析程序。

某些细菌，诸如铜绿假单胞菌，通过分泌因子诸如细胞密度感应(QS)信号、根据群体密度调节响应的基因簇的活化剂，与它们的环境相互作用。本发明人已显示，铜绿假单胞菌中的一种这样的分泌物，挥发性有机化合物(VOC) 2-氨基苯乙酮(2-AA) 2-AA结合并活化LuxR样受体转录因子。

在实施本发明时，本发明人已证明，包含LuxR样受体和多核苷酸的报道细胞可以将2-AA有效地检测为纯化合物(参见图4、5A-5B、6和7)和来自铜绿假单胞菌的分泌物(参见图1、2和3A-3B)，所述多核苷酸包含转录融合至核酸序列的luxR样受体结合元件，而所述核酸序列编码报道分子。生物传感器报道细胞的2-AA检测在检测来自疑似感染的组织的样品中的铜绿假单胞菌时与气相色谱一样有效(参见图13A-13B、14A-14C、15A-15B、16A-16B和17)。包括此类包封和/或附接至固体支持物的生物传感器报道细胞的装置可以有效地用于广泛多种医学、科学、环境和工业应用中的2-AA和细菌检测。

因此，根据本发明的一个方面，提供了装置，其包括：

报道细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：

a) 第一核酸序列，其编码能够产生可检测信号的报道分子，和

b) 第二核酸序列，其包含luxR样受体结合元件，用于调节编码所述报道分子的序列的转录；

其中所述报道细胞附接至固体支持物或包封于附接至固体支持物的包封基质内。

如本文中所用，短语“报道细胞”是指可用外源多核苷酸基因工程改造(即，转化或感染)的细胞。

如本文中所用，术语“外源”或“外来”是指这样的遗传物质(例如DNA、RNA)，其通常不是野生型或非工程改造的、未转化的生物体的遗传物质的组分。

本发明的报道细胞可以是细菌报道细胞、真菌报道细胞、植物报道细胞、藻类报道细胞、原生动物报道细胞和动物报道细胞。

在一些实施方案中，所述报道细胞是细菌报道细胞。所述细菌报道细胞可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞。适合于本发明的示例性细菌报道细胞包括但不限于埃希氏菌属、假单胞菌属、弧菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属、聚球蓝细菌属、嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophilia)和青枯菌属。在一些实施方案中，所述报道细胞为费氏弧菌MJ-1，其具有天然luxR受体、报道和结合元件。在一些实施方案中，所述报道细胞是经基因修饰的大肠杆菌，包括，但不限于携带表达费氏弧菌的LuxR的pSB401质粒的大肠杆菌，和携带表达费氏弧菌的LuxR的pAL103质粒的大肠杆菌JLD271/pAL103。

在本发明的一些实施方案中，所述报道细胞是含有包含luxR样受体结合元件和来自费氏弧菌的完整luxCDABE基因盒的多核苷酸且特异于luxR受体配体的细菌。任何合适的细菌均可用作报道细胞，但在一些实施方案中，所用细菌应当缺乏luxI自体诱导物(AI)的表达，以避免LuxR样受体结合其配体并活化luxR盒后的自体诱导的反馈回路。在报道细胞内，内源性Lux-R样信号传导***组分的表达可以是潜在的混淆因素，其干扰对事件诸如配体(例如2-AA)与LuxR样报道蛋白的结合或LuxR样受体-配体复合物与受体结合元件的结合的准确检测和报道。因此，在一些实施方案中，所述宿主细胞缺乏内源性luxR样表达。在其它实施方案中，所述宿主报道细胞缺乏内源性luxR样激动剂和/或拮抗剂。

因此，在本发明的一些实施方案中，所述报道细胞缺乏内源性luxR样受体表达。在其它实施方案中，所述报道细胞缺乏内源性luxR样激动剂和/或拮抗剂。在特定实施方案中，所述报道细胞缺乏luxI表达。为了确定候选细胞是否确实缺乏内源性luxR样受体表达，可以通过PCR检测编码luxR样受体的DNA序列或此类序列的RNA转录物的存在，可以检测(例如，从免疫学上)实际luxR样受体蛋白，且可以用全细胞或在其无细胞级分中来评价luxR样配体的结合。类似测定法可以用于检测内源性luxR样激动剂或拮抗剂，或luxI。luxR样激动剂和拮抗剂以及luxI的表达也可通过如下来评估：观察候选细胞、细胞提取物或其级分对与分离的luxR样受体的结合或对无细胞或全细胞制备物中的luxR样受体信号传导的功能的影响。在本发明的一些实施方案中，本发明的报道细胞是天然存在的细胞，其天然能够结合luxR样受体的配体。然而，通常，“报道细胞”是经基因工程改造的细胞，其携带对于细胞而言外来的luxR样受体。

在本发明的其它实施方案中，所述报道细胞包含编码能够结合2AA的luxR样受体的第三核酸序列。

术语“lux-R样受体”或“响应调节物”涉及包含配体结合结构域(例如，2-AA结合结构域)和识别luxR样受体结合核苷酸序列的DNA结合结构域的多肽受体。通常，luxR样受体结合在其侧链中具有六个或八个碳的酰基-高丝氨酸内酯诸如2-AA。这些碳链可以是氧化或未氧化的，是指：N-3-(氧代己酰基)高丝氨酸内酯、N-3-(氧代辛酰基)高丝氨酸内酯、N-己酰基高丝氨酸内酯、N-辛酰基高丝氨酸内酯。携带LuxR样受体的细菌物种包括但不限于费氏弧菌(Vibrio fisscheri)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、致金色假单胞菌(Pseuodomonas aureofacians)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和Halomonas anticariensis。

在一些实施方案中，术语“luxR样受体”是指与来自生物发光海洋细菌费氏弧菌的细胞密度感应(QS)***同源的LuxI/LuxR型QS***的同源胞质转录因子(SEQ ID NO:6)。在LuxI/LuxR***中，生理性LuxI同源物是自体诱导物(AI)合酶，其催化SAM和酰基载体蛋白(ACP)之间的反应，以产生可自由扩散的酰基高丝氨酸内酯(AHL或HSL)自体诱导物(AI)。在高浓度下，AHL AI结合胞质LuxR样转录因子(LuxR样受体)（当不被AI结合时，其迅速降解）。AI结合稳定了LuxR样蛋白，使其折叠，结合DNA中的luxR样受体结合元件，并活化靶基因的转录。通常，AHL (HSL)-结合的LuxR样受体蛋白还活化luxI表达，形成充斥(flood)于AI附近的前馈自体诱导回路。

已在超过100种革兰氏阴性细菌种中识别出了LuxI/LuxR同源物(参见，例如，Case等人, ISME J, 2008; 2:345-49)。使用生物信息学对接技术，本发明人已定义了费氏弧菌LuxR样受体(SEQ ID NO:6)中2-AA的潜在对接位点，并识别出了许多氨基酸残基，其对于配体在结合口袋内的正确配合是关键的(参见图11A和11B和12)。据发现，不响应于2-AA或铜绿假单胞菌的报道细胞携带的QS信号传导受体蛋白缺乏假定关键残基。因此，在本发明的一些实施方案中，LuxR样受体蛋白包含LuxR样同源物或直系同源物，其具有对应于费氏弧菌LuxR样受体蛋白(SEQ ID NO:6)的氨基酸Trp66、Try70和Asp79以及对应于Tyr62、Leu118、Ala139、Ile46和Ile 81的保守氨基酸残基。适合于在本发明的一些实施方案中使用且具有包含假定2-AA结合残基的高度相似序列的示例性LuxR样受体包括，但不限于，费氏弧菌(SEQ ID NO:6)、火神弧菌 (SEQ ID NO:7)、拟态弧菌(Vibrio mimicus) (SEQ IDNO:8)、鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi) (SEQ ID NO:9)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus) (SEQ ID NO:10)的LuxR样受体。编码LuxR受体蛋白的示例性核酸序列包括SEQ ID NO:11、12、13、14和15。

在本发明的一些实施方案中，所述LuxR样受体蛋白包含费氏弧菌LuxR样受体蛋白(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，所述LuxR样受体蛋白由核酸序列SEQ ID NO:11编码。

所述报道细胞包含编码报道分子的第一核酸序列，所述报道分子能够产生可检测信号并与包含luxR样受体结合元件的第二核苷酸序列翻译融合。作为转录因子的luxR样受体，一旦其结合信号传导分子(例如，2-AA)，则经由受体结合元件活化基因的转录。

如本文中所用，术语“报道分子”是指基因转录物，其转录导致产生可检测信号。如本文中所用，可检测信号可以是报道细胞或其环境中的任何改变，其随后可以由于报道分子的转录而被检测到。

在一些实施方案中，所述报道分子是催化产生可检测信号的多肽(例如酶)(例如荧光素酶)的mRNA。在一些实施方案中，所述报道分子是多核苷酸调节因子，或编码使得(例如诱导)其它多肽能够产生可检测信号的肽或多肽调节因子。调节因子，诸如转录增强子和酶诱导物，可以在多个水平发挥作用，以实现可检测信号的产生。

在本发明的一些实施方案中，编码报道分子的核酸序列是lux荧光素酶基因簇或“盒”。如本文中所用，“基因簇”是指多个编码基因产物的基因序列，所述基因产物是相同生物化学途径(例如产生荧光素酶生物发光)的组分。活化基因簇lux CDABE参与荧光素酶基因合成和活化，所述荧光素酶基因一旦被活化就发射光(发光)。

如本文中所用，术语“盒”是指由载体和***的DNA序列制成的重组DNA构建体。完整lux盒包含五个基因，即luxA、B、C、D和E。LuxA和luxB编码负责生成生物发光的蛋白，而luxC和D编码生物发光反应所需的醛。在一个具体实施方案中，lux簇为费氏弧菌的luxCDABE簇(SEQ ID NO:16)。

尽管本文描述的实验涉及使用来自费氏弧菌的luxCDABE (SEQ ID NO:16)，但lux簇或盒可以来自其它发光细菌，包括发光光杆菌(Photorhabdus luminescens)或哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。此外，所述报道分子可以是昆虫荧光素酶(来自萤火虫或磕头虫(click-beetle)的荧光素酶)。

除了发光，也可使报道细胞生成荧光信号(使用绿色荧光蛋白，SEQ ID NO:17，或红色荧光蛋白，SEQ ID NO:18，橙色荧光蛋白SEQ ID NO:19，或在青色、红色或黄色波长发荧光的衍生物，以及水母发光蛋白或尿卟啉原III甲基转移酶(UMT))。也可以在本发明内实现色度(lacZ、xylE、bla)、化学发光和电化学信号。在表1中提供了适用于本发明的产生可检测信号部分的分子的非限制性实例。

表 1

可识别部分	氨基酸序列 (GenBank登录号) / SEQ ID NO:	核酸序列(GenBank登录号) / SEQ ID NO:
			绿色荧光蛋白	AAL33912 / 17	AF435427 / 27
碱性磷酸酶	AAK73766 / 20	AY042185 / 30
			过氧化物酶	CAA00083 / 21	A00740 /31
组氨酸标签	GenBank登录号AAK09208/ 22的氨基酸264-269	GenBank登录号AF329457/ 32的氨基酸790-807
			Myc标签	GenBank登录号AAK09208/ 23的氨基酸273-283	GenBank登录号AF329457/ 33的氨基酸817-849
生物素连接酶标签(Biotin lygase tag)	LHHILDAQKMVWNHR / 24
			橙色荧光蛋白	AAL33917 / 19	AF435432 / 29
β半乳糖苷酶	ACH42114 / 25	EU626139 / 34
			链霉抗生物素蛋白	AAM49066 / 26	AF283893 / 35
Amcyan	AEI59072.1/44	JF796087.1/45

如本文中所用，短语“LuxR样受体结合元件”是指在LuxR样受体配体结合LuxR受体后可结合LuxR样受体且可以顺式方式活化核酸序列的转录的DNA序列。应理解的是，包含本发明的报道细胞的luxR样受体结合元件的核酸序列是用于调节编码能够产生可检测信号的报道分子的第一核酸序列的转录。

在费氏弧菌中，天然LuxR受体-配体复合物(LuxR/3-氧代-C6-HSL)结合被称为‘lux框’的luxR-luxI基因间区域内的20-bp luxR-受体结合序列。lux框居中于luxI启动子起始位点上游42.5 bp，表明LuxR/3-氧代-C6-HSL复合物充当转录活化物。在费氏弧菌LuxRQS***中，位于位置3-5和16-18的lux框碱基对对于lux表达的LuxR调节是至关重要的。LuxR/3-氧代-C6-HSL复合物中的配体结合使得LuxR受体蛋白对蛋白水解耐受。

LuxR样受体结合元件也存在于费氏弧菌中的lux基因座之外：已证明，大于20种基因在存在生理浓度的3-氧代-C6的情况下被显著差异调节(Antunes等人, J Bacteriol2007; 189:8387-91)。已证明，LuxR/3-氧代-C6复合物直接结合这些基因中相应的启动子元件中的7种。

因此，在本发明的一些实施方案中，第二核酸序列的luxR样结合元件包含费氏弧菌lux框序列(SEQ ID NO:36)。可结合一些luxR样受体蛋白的lux框同源物，包括但不限于根癌农杆菌的tra框(SEQ ID NO:37)、铜绿假单胞菌的rhl框(SEQ ID NO:38)、Qsc102(被铜绿假单胞菌的lasR活化)(SEQ ID NO:39)、Qsc117 (SEQ ID NO:40)、phzA (SEQ ID NO:41)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)的cep框(SEQ ID NO:42)序列和铜绿假单胞菌的las框(SEQ ID NO:46)。在一些实施方案中，第二核酸序列的luxR样结合元件包含费氏弧菌lux框(SEQ ID NO:36)序列。

应理解，响应于2-AA信号传导的其它细菌细胞可包含由可适用于本发明的额外luxR样结合元件调节的基因。此类额外luxR样结合元件的识别和表征可以通过如下进行：筛选在存在和不存在2-AA配体的情况下的差异基因表达，检测与已知luxR样结合元件同源的序列和/或进行候选DNA序列与luxR-配体复合物的直接结合研究。

在一些实施方案中，所述报道细胞包含含有的多核苷酸。在其它实施方案中，所述第三核酸序列包含于不同于所述多核苷酸的多核苷酸上。

可以针对具体宿主报道细胞类型优化核酸序列用于表达，所述核酸序列包含第一核酸序列、第二核酸序列和任选的第三核酸序列，其中所述第一核酸序列编码能够产生可检测信号的报道分子，所述第二核酸序列包含用于调节编码所述报道分子的序列的转录的luxR样受体结合元件，所述第三核酸序列编码本发明的一些实施方案的luxR样受体。此类序列修饰的实例包括但不限于改变G/C含量以更紧密地接近目标宿主细胞物种通常具有的含量，以及去除宿主细胞物种中的非典型密码子（通常所说的密码子优化）。

短语“密码子优化”是指选择合适的DNA核苷酸用于结构基因或其片段内从而接近目标宿主细胞内的密码子使用。因此，优化的基因或核酸序列是指这样的基因，其中天然基因或天然存在的基因的核苷酸序列已经被修饰，以便利用宿主细胞内统计学上优选或统计学上有利的密码子。通常在DNA水平检查核苷酸序列，并且采用任何合适的程序确定优化用于在宿主细胞物种中表达的编码区，例如参见Sardana等人(1996, Plant Cell Reports15:677-681)。在该方法中，密码子使用的标准偏差（密码子使用偏倚的度量）可以通过如下计算：首先找出天然基因的各个密码子使用率相对于高表达基因的各个密码子使用率的平方比例偏差(squared proportional deviation)，随后计算平均平方偏差。所用公式为：1SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N，其中Xn是指在高表达基因中密码子n的使用频率，其中Yn是指目标基因中密码子n的使用频率，N是指目标基因中密码子的总数。

根据特定细胞类型的优选的密码子使用而优化核酸序列的一种方法是基于直接使用密码子优化表，而无需进行任何额外的统计学计算，所述密码子优化表诸如通过日本的NIAS (国立农业生物科学研究院(National Institute of AgrobiologicalSciences)) DNA文库(www.dotkazusadotordotjp/codon/)的密码子使用数据库在线提供的密码子优化表。密码子使用数据库含有大量不同物种的密码子使用表，其中每个密码子使用表基于Genbank中存在的数据从统计学上确定。

通过使用所参考的表来确定特定物种(例如，大肠杆菌)中每个氨基酸的最优选或最有利的密码子，可将编码目标蛋白的天然存在的核苷酸序列针对该特定物种进行密码子优化。关于氨基酸，通过用统计学上更有利的相应密码子替代特定物种基因组中可具有低统计发生率的密码子来实现这一点。然而，可以选择一个或多个较不利的密码子以缺失存在的限制位点，以在可能有用的连接点(添加信号肽或终止盒的5'末端和3'末端，可用来一起切割和剪接区段以产生正确的全长序列的内部位点)上产生新的限制位点，或者消除可负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。

天然存在的编码核苷酸序列，在任何修饰前，可能已经含有对应于特定物种中统计学上有利的密码子的多个密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可包括确定天然核苷酸序列内的哪些密码子就特定细胞而言不是统计学上有利的，并且根据特定物种的密码子使用表修饰这些密码子以产生经密码子优化的衍生物。经修饰的核苷酸序列可以针对宿主细胞密码子使用进行完全或部分优化，条件是经修饰的核苷酸序列编码的蛋白以高于由相应的天然存在的基因或天然基因编码的蛋白的水平产生。通过改变密码子使用构建合成基因在例如PCT专利申请号93/07278中有述。

为了使用重组技术产生本发明的报道细胞，在适用于指导报道分子在宿主细胞中的转录的luxR受体结合元件和顺式调节序列(例如，启动子序列)的转录控制下，可以将包含第一、第二和任选第三核酸序列的多核苷酸连接入核酸表达载体(例如细菌质粒)或核酸构建体***中。在具体实施方案中，lux框元件和启动子包含如SEQ ID NO:43中所示的核酸序列。

在一些实施方案中，将包含第一、第二和任选的第三核苷酸序列的多核苷酸连接入核酸表达载体中，用于在宿主细胞中转化和表达。在某些实施方案中，编码用于产生可检测信号的报道分子的第一核酸序列、包含luxR-受体结合元件的第二核酸序列和编码luxR样受体蛋白的第三核酸序列位于同一核酸表达载体中，并因而位于宿主细胞内的同一多核苷酸上。因此，在一些实施方案中，所述报道细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码报道分子的第一核酸序列、包含luxR样受体结合元件的第二核酸序列和编码luxR样受体蛋白的第三核酸序列。在其它实施方案中，所述第三核酸序列包含在与包含第一和第二核酸序列的多核苷酸(其在本文中也被称为核酸构建体***)不同且分开的多核苷酸上。

在本发明的一些实施方案中，所述载体是细菌质粒，其使用市售的细菌质粒“骨架”构建。在特定实施方案中，所用细菌质粒骨架是pACYC184或pBR322。

因此，本发明设想了包含本发明的第一、第二和任选的第三核酸序列的分离的多核苷酸。

短语“分离的多核苷酸”是指单链或双链核酸序列，其以以下形式分离和提供：RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如上述的组合)。

如本文中所用，短语“互补多核苷酸序列”是指由使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶将信使RNA逆转录产生的序列。此类序列随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增。

如本文中所用，短语“基因组多核苷酸序列”是指源自（分离自）染色体的序列，因而其表示染色体的连续部分。

如本文中所用，短语“复合多核苷酸序列”是指至少部分互补且至少部分是基因组的序列。复合序列可包含编码本发明多肽所需的一些外显子序列以及在其间间插的一些内含子序列。所述内含子序列可以具有任何来源（包括其它基因），并且通常可包含保守剪接信号序列。此类内含子序列还可包含顺式作用表达调节元件。

在本发明的一些实施方案中，所述报道细胞选自包含编码能够产生可检测信号的报道分子的核酸序列(例如luxR基因簇)的细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、藻类细胞和动物细胞。真核宿主细胞(酵母：Gupta等人, FEMS Yeast Res 2003 4:305; Sanseverino等人,Appl Environ. Microbiol 2005; 71:4455-60;和人细胞：Patterson等人, J Ind MicrobBiotech, 2005; 3:2115-23以及Close等人, PLoS One, 2010; 5:e12441)以及细菌宿主细胞已用luxR序列工程改造以产生生物发光的报道细胞。因此，本发明的表达载体或核酸构建体可包含使得载体适合于在原核生物、真核生物或优选两者(例如，穿梭载体)中复制和整合的额外序列。典型的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如，启动子、增强子)以及转录和翻译终止子(例如，多腺苷酸化信号)。

可以使用各种方法将本发明的表达载体引入宿主细胞***中。此类方法在Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs HarborLaboratory, New York (1989, 1992), Ausubel等人, Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang等人,Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega等人, GeneTargeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]中有一般性描述，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。此外，对于正负选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。

示例性的基于细菌的表达***在Baneyx等人, Current Opinion inBiotechnology, 1999; 10, 411-421和Macrides等人, Microbiol Rev 1996, 60:512-538中公开，其通过引用并入本文。

所述宿主细胞可以用本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化。在稳定转化中，本发明的核酸分子被整合入宿主细胞基因组中，因此其呈现稳定和遗传的性状。在瞬时转化中，重组核酸分子由转化的细胞表达，但并不整合入基因组中，因此呈现瞬时性状。

如所提及，所述报道细胞附接至固体支持物。

如本文中所用，术语“附接(attach, attachment)”、“粘附(adhere, adhered,adherent)”、“固定化(immobilize)”或类似术语通常是指将例如本发明的报道细胞固定化或固定至表面，诸如通过物理吸附、化学粘合和类似方法或其组合。具体地，“细胞附接”、“细胞粘附”或类似术语是指细胞与表面的相互作用或结合，诸如通过将细胞与表面、诸如固体支持物的表面一起培养或相互作用。

所述固体支持物表面可以是未修饰的或修饰的，诸如具有表面涂层、锚定材料、相容剂(例如，纤连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等)，或促进报道细胞粘附和细胞状态或生长的类似修饰。对于悬浮细胞，所述细胞可以，例如，在温育期间通过物理沉降或通过表面-细胞相互作用来使其与固体支持物的表面接触。表面-细胞相互作用可通过若干种方式来实现，例如，反应表面与细胞表面(细胞膜，细胞壁)蛋白或分子的共价偶联、基于电荷的电相互作用、固体支持物表面分子(例如，抗体、配体)与细胞表面分子的结合，或类似方法。

用于附接或固定报道细胞的固体支持物是本领域众所周知的，例如，Michelini等人的US2012/0045835。简而言之，所述固体支持物可以是天然聚合物，诸如胶原和/或其衍生物与蛋白聚糖或蛋白聚糖混合物的组合，其中选择所述胶原的来源(例如，牛、马、猪、鲨鱼)以与生物传感器活力相容。所述固体支持物还可以是合成聚合物，例如，合成乙烯基聚合物与任选修饰的聚硅氧烷的组合，确保结构刚度和报道细胞限制以及足以令光信号传输至检测器的透明度，其中所述可检测信号是光信号(例如，生物发光)。合适的聚合物包括，但不限于，乙烯基聚合物聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胶原-蛋白聚糖混合物等。

取决于所固定的细胞类型，所述固体支持物也可以是天然材料，诸如纸、木材、金属、天然聚合物，或合成材料，或天然和合成材料的混合物，诸如混合的天然或合成的聚合物。

此外，合成聚合物，可以包含固定/附接混合物，或者被添加至固定/附接混合物中。

在本发明的另一个实施方案中，添加植物粘液以增加细胞对固体支持物的粘附性。小百分比就足够了。来自苯胺紫(mauve)和芦荟的示例性植物粘液是市售的。根据报道细胞的类型，用于细胞附接的固体支持物也应用适当的缓冲溶液来制备。

在不损害报道细胞的细胞完整性、活力和功能性(即，响应于2AA的能力)的同时将细胞固定至固体支持物。在一种示例性固定方法中，将所述细胞培养至所需密度，任选地冲洗干净培养基，并且与偶联剂诸如戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯和六亚甲基二异硫氰酸酯混合，然后应用于固体支持物表面。如所提及，固定至固体支持物可包括使用聚丙烯酰胺固定，使用天然聚合物诸如藻酸、胶原、明胶、琼脂和κ-角叉菜胶固定，以及使用合成聚合物诸如光固化树脂和聚氨酯聚合物固定。

生物传感器诸如本文描述的报道细胞的一个优点是其灵敏度、小尺寸和操作的简易性。所述报道细胞可以容易地与测试样品接触，或者甚至部署用于检测luxR样配体(例如，2-AA)或原位(例如，在伤口(例如，烧伤、感染、炎症)部位或疑似污染的表面或材料(例如，医疗装置、水源、呼吸或空气))产生它们的微生物。

将报道细胞固定在所述装置的固体支持物上允许：将包含固定的报道细胞的装置定位到疑似LuxR样受体配体(例如，2-AA)的来源附近，简化检测且甚至可能消除样品回收的需要。因此，在本发明的一个实施方案中，装置经配置使得其允许将报道细胞定位到疑似LuxR样受体配体(例如，2-AA)的来源附近。

因此，根据本发明的一些实施方案，提供了包括如本文所述的报道细胞的装置，所述报道细胞附接至固体支持物或包封于可透气的包封基质内。

图18举例说明本发明的一个实施方案的示例性装置10，其具有报道细胞12，所述报道细胞12包含具有如本文所述的第一和第二核苷酸序列的多核苷酸16，所述报道细胞固定在固体支持物14上。

固体支持物14可以是细胞诸如细菌或酵母细胞可以附接至的任何刚性或半刚性材料。

在本发明的一些实施方案中，报道细胞12附接至固体支持物14。在其它实施方案中，报道细胞12包封于包封基质内。

维持细胞活力、允许可检测信号的检测和提供透气性(例如，用于与挥发性luxR样受体配体诸如2-AA接触的细胞)的合适的包封基质是本领域已知的。例如，Smith等人(US2008/0182287)教导了用于操作、分析或处理活细胞的来自PBP嵌段聚合物的细胞包封基质，其特征在于低毒性和光学相容性。PBP凝胶特性可通过提供具有适合于不同应用的不同转变温度的嵌段聚合物的制剂进行改良。

在另一个实施方案中，聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，和聚硅氧烷(任选地用原硅酸酯修饰和/或交联)，可以不同浓度使用(通常为0.05至15％)，以生成适合于包封细胞和维持它们的活力、同时确保透明度(这是用于检测发光信号的关键因素)的基质。一种经修饰的聚硅氧烷是具有烷基、丙烯酸基团、醇基团的聚硅氧烷。聚硅氧烷是具有30-60个Si原子长度的Si--O--Si主链和C₁至C₁₂的侧链的聚合物。

原硅酸酯是合适的交联剂，并且在一些实施方案中，聚硅氧烷是用四乙基-原硅酸酯交联的二甲基硅氧烷。

在其它实施方案中，所述包封基质可以是琼脂基质，或任何其它合适的固体或半固体培养基，其单独使用或用可透气保留层覆盖(例如涂覆)。此外，藻酸盐已成功地用于包封细胞，而对活力无不利影响。长期活力(数周至数月)是可能的，只要藻酸盐包封的细胞保持湿润。胶乳共聚物也已报道可用于固定大肠杆菌并维持活力。其它基质包括角叉菜胶、丙烯酸乙酸乙烯酯共聚物、聚氯乙烯聚合物、溶胶-凝胶、琼脂、琼脂糖、微机械加工的纳米孔膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酰胺、聚氨酯/聚羰基(polycarbomyl)磺酸酯或聚乙烯醇。也可以采用电泳沉积。

报道细胞可以被包封，例如，通过与溶胶状态的包封基质混合，然后胶凝化，并将混合物形成为所需形状(珠、块、颗粒等)，直到胶凝化并适合于附接至固体支持物。

应理解，所述包封基质可以是固体支持物的一部分，或并入固体支持物，使得报道细胞分布于固体支持物的体内。在此类实施方案中，固体支持物可以有利地具有包封基质的特征中的一些，例如，最少干扰或不干扰可检测信号(例如光学透明度)、维持报道细胞活力和功能以及透气性。

应理解，本发明的装置中的信号检测可以通过将大量报道细胞附接至固体支持物或者通过在包封基质中包括大量报道细胞来增强。因此，在一些实施方案中，所述装置包括报道细胞群体。对所述装置中包含的细胞数目的限制由以下确定：细胞类型、固体支持物或包封基质的大小、传感器用于检测可检测信号的灵敏度、预期用途(例如，预期的LuxR-1配体的丰度、测试环境的物理局限等)。有效用于本发明的装置中的合适的报道细胞群体大小可通过如下确定：暴露于LuxR样配体(例如，2-AA)或产生LuxR样配体的生物体之后，监测报道细胞培养物的系列稀释液中的可检测信号(例如，生物发光)。用预期存在于待测试的样品、表面或物体中的范围内的配体或产生配体的生物体的量或浓度校准可以进一步有助于精确测定装置所需的报道细胞的数目。

在本发明的一些实施方案中，所述报道细胞包含在营养培养基诸如营养琼脂上，或与营养培养基诸如营养琼脂接触。营养培养基可添加至固体支持物上，或可整合于固体支持物内。在一些实施方案中，报道细胞或细胞设置于培养容器诸如培养皿、烧瓶或多孔培养板中的营养培养基上。

图19举例说明本发明的一个实施方案的示例性装置100，其具有报道细胞12，所述报道细胞12包含具有如本文所述的第一和第二核苷酸序列的多核苷酸16，所述报道细胞包封于包封基质18内，所述包封基质18固定在固体支持物14上。

在本发明的一些实施方案中，所述装置包含在还包含传感器的***中。

如本文中所用，术语“传感器”是指能够检测由报道细胞产生的可检测信号的检测器装置。在一些实施方案中，其中核酸序列编码的可检测信号是发光或生物发光，而能够产生可检测信号的报道分子可以是在luxR样活化后产生的能够发光的蛋白诸如荧光素酶，可检测信号可通过光度计来读取或者发光可通过使用光电二极管和将报道测定从发光信号转换为电信号的信号处理***来读取。用于检测发光的一些方法描述于(Vijayaraghavan等人，2007)和(Li等人，2012)。

包括本发明的装置的***可包含在所述装置上的基本上任何位置的各种不同的传感器方式。可使用并入装置或与装置分离但与待检测的装置区域对齐的传感器来实现检测。

传感器通常包括信号接收器(检测器)和用于将检测到的信号转换为可以容易地传输、定量和存储的能量形式的换能器。传感器的类型自然由可检测信号的性质决定。因此，在一些实施方案中，所述传感器选自光传感器、电化学传感器和化学传感器。在一些实施方案中，所述装置还可包括用于增加检测信号的灵敏度水平的信号扩增器。

在其它实施方案中，其中可检测信号是发光或荧光，由发光报道细胞(无论是细菌、酵母还是其它)生成的光响应通常用光学换能器诸如光电倍增管、光电二极管、微通道板或电荷耦合装置来测量。另外还需要一些将生物发光信号转移至换能器的装置，这使得在大型装置中必须用到光纤电缆、透镜或液体光导。然而，可干扰膝上型计算机或具有存储和计算能力的无线装置(诸如“智能手机”)的手持式、电池操作的光电倍增器装置是可用的(The Azur Corporation, Carlsbad, Calif.)，其为本发明的装置的移动和远程使用(例如，在野外条件下和在诊所和医院病房中)提供了平台。此类移动发光检测器可以如下制成，例如，使用直接干扰报道细胞的集成电路光学换能器，形成“生物发光生物报道集成电路(BBIC)，其可被包含在小(近似5 mm²)区域内，并且包括两个主要组分：用于捕获生物发光报道细胞信号的光检测器和用于管理和存储源自生物发光的信息的信号处理器。如果需要的话，也可将远程射频(RF)发射器并入装置(在一般情况下)，或并入用于无线数据中继(relay)的整体集成电路设计。由于所有必需元件完全自含于BBIC内，所以通过将BBIC简单地暴露于所需测试样品即可实现操作能力。在一些实施方案中，所述***还包括用于显示所检测事件的显示器。

图20举例说明本发明的一个实施方案的示例性***200，其具有报道细胞12，所述报道细胞12包含具有如本文所述的第一和第二核苷酸序列的多核苷酸16，所述报道细胞固定在固体支持物14上，所述装置还包含用于检测来自报道分子的可检测信号的传感器20。在一些实施方案中，传感器20位于固体支持物14上，附接至固体支持物14或并入固体支持物14。在其它实施方案中，传感器20与固体支持物分开，例如传感器可包含于对接站中，所述固体支持物与报道细胞被合适邻近置于所述对接站中，以便检测可检测信号。

所述***或装置还可包含样品支架，其用于将报道细胞定位成足够邻近测试样品，以便有效量的LuxR样受体配体(当存在时)接触和结合LuxR样受体分子。

“样品”可以是获得自人、动物或其它来源的生物样品，并且可以是，但不限于：呼吸空气、汗液、唾液、痰液、血液、血浆、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、脑脊液、脑膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、***、脓液、***物、呕吐物、眼泪、组织活检样品、细胞培养物、环境空气、获得自伤口或烧伤的组织样品、获得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、***、伤口、烧伤或疑似具有感染的任何其它组织的拭子、痰和粘液。为了测试来自肺部诸如来自囊性纤维化患者的感染，样品可以是粘液，但也可以是呼出至合适容器中的呼吸样品。

所述样品也可以是非生物的，诸如医院中使用的需要针对铜绿假单胞菌感染进行监测的医疗装置、插管、导管等。在一些实施方案中，所述装置可以设计成连续监测医疗装置附近的空气样品，并且一旦达到或超过2AA的预定水平就发出警告。

本发明的装置可以检测结合并活化LuxR样受体蛋白以产生来自报道细胞的信号的挥发性有机分子。因此，在一些实施方案中，所述样品本身不是流体或固体样品，而是本身为气体的样品(诸如来自囊性纤维化患者的呼吸样品)或与样品直接接触且向其中释放挥发性有机分子(诸如2-AA)的气体级分(例如空气)。因此，在一些实施方案中，设计装置，使得所述报道细胞被定位为接触挥发性样品，例如，报道细胞可以与测试样品气体连通。在其它实施方案中，报道细胞与测试样品流体连通。如本文中所用，短语“气体连通”是指报道细胞的放置，使得包含样品的或从样品发出的一种或多种气体可以接触报道细胞。气体连通可以包括用于防止样品的或由样品散发的一种或多种气体分散的装置、用于盛放并任选地浓缩气体的捕获器、]用于防止气体样品的缩合/相转移的加热元件、用于使气体从样品移动至报道细胞的导管等。

本发明人已令人惊讶地发现，2-AA可结合并活化luxR样受体蛋白，而由铜绿假单胞菌分泌的2-AA可通过包含多核苷酸的报道细胞来检测，所述多核苷酸包含本发明的第一和第二核酸序列。因此，根据本发明的一些方面，提供了检测样品中luxR样配体诸如2-AA的存在的方法，所述方法包括使所述样品与本发明的装置接触，其中检测到高于预定水平的可检测信号表明所述样品中存在2-AA(或其它luxR样配体)。在一些实施方案中，所述luxR样配体是2-AA。

由于2-AA由铜绿假单胞菌分泌，在本发明的一些实施方案中，提供了检测个体中的铜绿假单胞菌感染的方法，所述方法包括使来自所述个体的生物样品与本发明的装置接触，其中检测到高于预定水平的可检测信号表明所述个体中存在铜绿假单胞菌感染。

在本发明的一些实施方案中，提供了检测样品中的产生2-AA的生物体的方法，所述方法包括使所述样品与本发明的装置接触，其中检测到高于预定水平的可检测信号表明所述样品中存在产生2-AA的生物体。

在一些实施方案中，在个体中检测luxR样配体诸如2-AA或检测铜绿假单胞菌感染或在样品中检测产生2-AA的生物体的方法还包括用2-AA标准样品校准本发明的装置，以便将2-AA的量或浓度分配给可检测信号的值。

本发明的装置的校准可以通过如下进行：使所述装置的报道细胞与不同浓度的外源添加的2-AA接触，并测量诱导可测量的发光响应所需的浓度和时间。制备2-AA的标准稀释液，例如，0.001nM至100 nM，并将其点样于吸附性基板上，并与报道细胞邻近置于装置中，例如样品支架中。记录可检测信号的检测，例如，从时间零，并以30秒至30分钟间隔，经预定的时间段。数据可以被绘制为随着时间的每单位时间的事件数(例如光子数)，并可确定所述装置对于2-AA的灵敏度的范围，例如，通过选择其中报道细胞对2-AA的响应与2-AA浓度呈线性的范围。因此，可以从记录自报道细胞的信号事件的记录确定所述装置的预定邻近空间中的2-AA浓度的值。一旦确定了标准品的值，则根据随着时间发生的可检测事件的数目分析样品数据。样品中或从样品散发的2-AA的浓度越高，每单位时间记录的事件数目越大。也可在本发明的装置的校准和实际使用中使用对照样品。阳性对照可以包括，例如，将已知luxR样配体(例如2-AA)添加至样品以观察累加信号产生，并添加luxR样受体或lux途径拮抗剂以验证响应的特异性。阴性对照可包括，但不限于，引入对照装置，所述对照装置包含缺乏报道途径的组分的细胞或包含不同的配体非响应性报道途径的细胞。

在一些实施方案中，在气体样品上进行luxR-1样配体(例如2-AA)的检测。气体样品可收集自luxR样配体的疑似来源的邻近，例如，密封小瓶中，吸附性材料诸如木炭上，或通过浓缩和液化。气体重构可以通过加热液化样品来实现。

在一些实施方案中，所述气体样品收集自样品的顶部空间气体。如本文中所用，术语“顶部空间气体”是指样品上方或周围的任何气体材料。对于密闭容器中的固体或液体样品，例如，顶部空间气体是容器的不包括固体或液体样品的内容物部分。细菌培养物的顶部空间气体是在其中培养细菌的液体或固体培养基上方收集的气体级分。

当分析气体样品时，应在使得挥发性2-AA能够与受体结合、活化LuxR样受体并产生可检测信号的条件下进行样品和报道细胞之间的接触。在此类条件下防止直接接触对于特异性是重要的，因为2-AA是活化luxR样受体的唯一挥发性分子。合适条件的非限制性实例是PBS缓冲液，约pH8，并在37度下暴露几分钟至过夜。

对于伤口、感染或污染仪器(例如医疗装置)、土壤、废水和可能需要原位取样的其它样品的取样，顶部空间气体可通过如下取样：将装置与样品(最大程度接近地(取决于报道细胞的灵敏度)放置例如，距离疑似铜绿假单胞菌感染的伤口或烧伤的几毫米至一厘米)。在一些实施方案中，本发明的装置可包括用于收集顶部空间气体的装置(例如吸管)，因此可以从远程位置实时取样顶部空间气体。这样的收集方法可特别适合于在患有中耳炎的患者或烧伤患者中、从***物中监测2-AA并诊断铜绿假单胞菌感染，而无需去除样品。所述装置又还可以包括用于维持气体样品与报道细胞接触而气体不会散失或稀释至周围空气的容器。

当测试气体样品时，所述样品可以是来自人、动物或其它来源的顶部空间气体，并且可以是，但不限于：气体样品，诸如呼吸空气，或来自以下的顶部空间气体：汗液、唾液、痰液、血液、血浆、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、脑脊液、脑膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、***、脓液、***物、呕吐物、眼泪、组织活检样品、细胞培养物、环境空气、获得自伤口或烧伤的组织样品、获得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、***、伤口、烧伤或疑似具有感染的任何其它组织的拭子、痰和粘液。

在一些实施方案中，所述装置可用于检测任何慢性炎症、感染或病况中的2-AA或铜绿假单胞菌感染，以及用于检测(医疗)仪器的污染。2-AA和铜绿假单胞菌可通过所述装置检测，以便检测疾病或病理性病况，包括，但不限于慢性中耳炎(渗出性)、支持性急性中耳炎、脓肿引流物、感染的烧伤、由于支气管炎导致的排痰性咳嗽、肺炎、鼻窦炎、犀牛鼻窦炎、感染的导管包括 - 机械通风管、外周和中枢线、尿导管、感染的褥疮性溃疡、糖尿病性溃疡、乳汁和医疗装置。特别重要的是免疫受损个体中的任何伤口、烧伤、感染或皮肤病变。

在一个具体实施方案中，所述个体疑似患有中耳炎，而生物样品是耳部渗出物、从耳部渗出物收集的顶部空间气体或从患耳收集的顶部空间气体的样品。

所述装置还可用于检测对于食品安全而言重要的产生LuxR样配体的病原体，其中适当考虑所分析样品的性质。通常，在非气体样品的情况下，报道细胞应答可能受样品基质(即从样品制备生成的颗粒材料)影响。颗粒材料可以结合报道细胞，并引起从报道细胞发射的(光)信号的普遍淬灭。因此，可分析样品以测试样品基质对报道细胞测定法的影响。

用本发明的装置检测样品中的2-AA之后，可以例如，通过培养疑似材料的样品，建立对铜绿假单胞菌感染或定植(例如，医疗装置上的生物膜中)的进一步证实。

如本文中所用，术语“约”是指±10%。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其变化形式是指“包括但不限于”。

术语“由……组成”是指“包括并限于”。

术语“基本由……组成”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤和/或部分，但只有当额外成分、步骤和/或部分不实质性改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征才可以。

如本文中所用，单数形式“a(一)”、“an(一)”和“the(该)”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，本发明的各个实施方案以范围形式提供。应当理解的是，以范围形式的描述仅仅是出于方便和简明，不应解释为是对本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应被视为已具体公开所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1-6的描述应被视为已具体公开子范围诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的个别数，例如1、2、3、4、5和6。这无论范围宽度如何都适用。

如本文中所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知或易于由所述从业人员从已知方式、手段、技术和方法开发的那些方式、手段、技术和方法。

要理解的是，为了清楚起见在分开实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可与单个实施方案组合提供。相反，为了简明起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独提供或以任何合适的子组合或以适于任何其它描述的本发明实施方案提供。各个实施方案的上下文中描述的某些特征不应被视为是那些实施方案的必需特征，除非实施方案无那些要素就无法实施。

如上文中所述以及下面权利要求部分中要求保护的本发明的各个实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考下列实施例，所述实施例与上面的描述一起以非限制性方式举例说明本发明的一些实施方案。

一般而言，本文使用的命名和本发明中利用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。此类技术在文献中有全面解释。参见，例如，"Molecular Cloning: Alaboratory Manual" Sambrook等人, (1989); "Current Protocols in MolecularBiology" Volumes I-III Ausubel, R. M., 编 (1994); Ausubel等人, "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons,New York (1988); Watson等人, "Recombinant DNA", Scientific American Books,New York; Birren等人 (编) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series",Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 美国专利号4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659和5,272,057中记载的方法; "CellBiology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., 编 (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第三版; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-IIIColigan J. E., 编 (1994); Stites等人 (编), "Basic and Clinical Immunology"(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (编), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York(1980); 可用的免疫测定法全面描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., 编 (1984);“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., 编. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., 编. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., 编 (1986); "Immobilized Cells andEnzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal,B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCRProtocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego,CA (1990); Marshak等人, "Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 所有文献都通过引用并入本文，如同全部记载于本文中一样。其它一般参考文献贯穿本文中提供。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且为了读者方便而提供。其中含有的所有信息通过引用并入本文。

材料和方法

生长条件

使所有细菌菌株(表II)在37℃下生长于在1升蒸馏水中含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl的Luria-Bertani (LB)培养液中(除了根癌农杆菌A136/pCF218/pMV26(其在30℃下生长)，和费氏弧菌MJ-1(其在30℃下生长于LBM (LB+2% NaCl)培养基中)。

表II：细菌菌株和质粒

C4-HSL：N-丁酰基-高丝氨酸内酯；3-氧代-C6-HSL：N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯；C6-HSL：N-己酰基-高丝氨酸内酯；3-氧代-C8-HSL：N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯；C8-HSL：N-辛酰基-高丝氨酸内酯；3-氧代-C12-HSL：N-3-氧代-十二酰基-高丝氨酸内酯

。

由铜绿假单胞菌产生的总挥发物对细胞密度感应报道菌株的影响。

对于铜绿假单胞菌挥发物对各种细胞密度感应(QS)响应调节物的影响的检查，在双向Petri皿的两个单独隔室中用不同的QS-报道菌株(表I)接种铜绿假单胞菌PAO1。这样的隔室接种设备仅使得能够在铜绿假单胞菌培养物和被检查的报道菌株之间交换挥发物。对于评估铜绿假单胞菌的挥发物对QS响应调节物的可能的拮抗作用/协同作用的测定法，将暴露于铜绿假单胞菌的挥发物的报道菌株用其相关的酰基高丝氨酸内酯(AHL)信号传导分子(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)接种。在这些实验中，以1 μM的浓度添加1 μl N-3-氧代-十二酰基-高丝氨酸内酯(3-氧代-C12-HSL)和N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯(3-氧代-C6-HSL)，并且以100μM的浓度添加1 μl N-丁酰基-高丝氨酸内酯(C4-HSL)和N-辛酰基-高丝氨酸内酯(C8-HSL)。对于检查铜绿假单胞菌挥发物的激动剂活性的测定法，两种菌株均在不添加任何外源性AHL的情况下进行温育。过夜温育之后，从琼脂刮下报道菌株的菌落，将其再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS；0.1 M pH=7.4；10.9 g l-1的Na2HPO4, 3.2 g l-1的NaH2PO4和9 g l-1的NaCl)中，并且在96孔板中使用infinite-F200读板器(Tecan Trading AG, Switzerland)测量发光。相对发光以发光除以光密度计算。用465 nm的激发波长和535 nm的发射波长测量新洋葱伯克霍尔德氏菌H111-I/pAS-C8产生的相对绿色荧光。

或者，在双向petri皿的两个单独隔室中用几种报道菌株接种铜绿假单胞菌PA14。过夜温育之后，如上所述分析报道菌株的培养物的发光产生。

挥发物概况分析

用500 μl DDW一式三份稀释500 μl具有PAO1或PAO1 ΔlasR的培养基。将5 μl 1ppm苄基丙酮/MeOH作为内部标准品添加至0.33 μM或5 ppb的最终浓度。使用1x10 mm PDMS-涂覆的Twister棒(Gerstel GmbH, Mülheim an der Ruhr, Germany)实施搅拌棒吸附提取8小时。擦去Twisters，并用DDW冲洗并经受与程序化温度汽化(PTV)注射器偶联的热脱附(TDU-CIS-4, Gerstel)。在具有40 ml min-1 He流速和20℃至170℃的60℃min-1的温度梯度且保持5分钟的TDU未分条件下实施解吸。PTV入口装有石英棉衬垫(Gerstel)，并在解吸过程中保持在-20℃以下，随后是12℃sec-1的温度梯度，最高达250℃，保持10分钟。

与5375质谱仪(MS) (Agilent technologies, Santa Clara, CA)偶联且装有Rxi-XLB 30x0.25x0.25柱(Restek, Bellafonte, PA)的7890气相色谱仪(GC)用于运行分析。GC烘箱温度梯度为40℃持续3分钟，然后15℃min-1至280℃，持续5分钟。MS在阳性EI扫描(40-400 amu)模式、70 eV能量下操作。获得的色谱图用Chemstation软件(Agilent)分析，并将质谱与Wiley9/NIST08组合质谱文库(Wiley and Sons, Hoboken, NJ)和/或NIST11 (NIST, Gaitersburg, MD)进行比较。用商业标准品(Sigma)针对光谱和保留时间验证2-氨基苯乙酮(2-AA)和苄基丙酮的身份。

在Chemstation中使用chemstation积分器实施积分。将曲线下面积(AUC)针对内部标准品的AUC进行标准化。

2-氨基苯乙酮对特定QS-报道菌株的影响

将2-AA应用于各种报道菌株，以便评估其是否可以抑制或活化不同的QS响应调节物。使报道菌株在30℃下在含有适当抗生素的LB培养基中生长过夜，然后洗涤，并用新鲜LB培养基1:100稀释，获得约10⁷个细胞ml-1的浓度。在四次重复中，将每孔100 μl培养物添加至96孔板(Corning Inc., NY, USA. 目录号356701)。通过将2-AA与特定AHL一起添加至报道菌株培养物而准备拮抗/协同活性的测定。通过将2-AA添加至报道菌株、不添加任何AHL而进行激动作用测定。阴性对照缺乏2-AA和AHL，而阳性对照仅含有各种浓度的相应AHL。以1、10、25、50、100和500 μM的浓度添加2-AA用于激动作用和拮抗作用/协同作用测定。以1、10、25、50、100和500 μM的浓度添加C4-HSL、C8-HSL和3-氧代-C12-HSL用于阳性对照，而以1、10、25、50和500 nM添加3-氧代-C6-HSL。对于拮抗作用/协同作用测定，以10 μM的浓度添加C4-HSL、C8-HSL和3-氧代-C12-HSL，而以10 nM添加3-氧代-C6-HSL。将2-AA直接添加至报道菌株的培养物，然后将其分至96孔板的各孔，而将一微升溶解于乙腈中的不同浓度的各种AHL置于孔中，半小时后，添加培养物，以允许乙腈蒸发。然后将板内的细菌在37℃下温育24小时，而在30℃下温育根癌农杆菌A136/pCF218/pMV26。温育期间，以30分钟间隔使用infinite-F200读板器(Tecan Trading AG, Switzerland)测量由报道菌株产生的光密度(OD λ=600nm)和发光或荧光。

如下检查2-AA在其挥发物状态的影响：简而言之，将10 nmol 2-AA和100 μl过夜温育的报道菌株添加至双向Petri皿的2个相对侧。或者，在挥发物测定中检查1 μg 2-AA的LuxR活化。将一微升1 μg/μl浓度的2-AA置于petri皿的盖片上的空白盘(Oxoid, UK)上。将二十微升的大肠杆菌/pSB401的过夜生长的培养物接种于petri皿的第二部分上。将皿密封，并在37℃下的静态条件下温育过夜。过夜温育之后，从琼脂板刮下报道菌株的菌落，将菌落重悬浮，分份入96孔板，并如上所述测量相对发光。

2-氨基苯乙酮对费氏弧菌的LuxR调节的发光的影响。

将2-氨基苯乙酮(2-Acetoaminophenone)添加至费氏弧菌，以便验证2-AA对携带LuxR的野生型菌株中的QS调节的性状的活性。如下制备实验的起始物：每次实验前，将来自甘油储备物的培养物接种于LBM培养基中，并在30℃下温育过夜，然后1:1000稀释，并再次温育过夜。然后将培养物洗涤并1:1000稀释，然后添加25、50或100 μM的2-AA，或10 nM的3-氧代-C6-HSL。如上所述测量96孔板中温育的MJ-1培养物的发光和吸光度。应提及，在实验的两次重复中，在添加AHL或添加2-AA后没有测量到发光(数据未显示)。

2-AA类似物对LuxR的影响

针对大肠杆菌/pSB401和大肠杆菌JLD271/pAL103测试2-AA的七种类似物，以评估2-AA的哪些化学基团参与配体-受体相互作用。测试了下列化合物：4-氨基苯乙酮、3-氨基苯乙酮、氨基苯乙酮、2-硝基苯乙酮、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸和2-氨基苯甲醛(Sigma,St. Louis, USA)。如对于2-AA所述，以1-50 μM的浓度将所述化合物应用于报道菌株。12小时后在读板器中测量发光。

多序列比对

使用T-Coffee (参见www dot tcoffee dot vital-it dot ch apps tcoffee index)对TraR (PDB代码:1L3L)、LasR (PDB代码:2UVO)、SdiA (PDB代码:2AVX)和LuxR (Uniprot进入:P12746)进行多序列分析(MSA)。此外，将下列物种的LuxR响应调节物的部分与费氏弧菌的LuxR(登录号CAA68561.1)(SEQ ID NO:1)进行比对：火神弧菌 (AAQ90213.1) (SEQ IDNO:2)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)(AAQ90214.1) (SEQ ID NO:3)、鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)(AAQ90227.1) (SEQ ID NO:4)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)(AAQ90194.1) (SEQ ID NO:5)。

同源模型构建

使用T-Coffee算法将LuxR (SEQ ID NO:6) (Uniprot进入:P12746)与TraR (PDB代码:1L3L)进行比对。使用如Discovery Studio 4.0 (DS 4.0, Accelrys)中执行的Modeller方案(1)生成LuxR的模型。生成二十种模型，并且使用蛋白报道工具(DS 4.0)评价模型质量，并且选择具有最佳得分的模型用于进一步细化，其包括最小化。使用默认方案设置。

在模型中识别结合位点

使用DS 4.0中的'定义结合位点'方案定义结合位点。该方案是基于'橡皮擦和泛洪填充网格算法'，其中基于受体的形状识别结合位点。最佳得分位点被确定为生成模型的结合位点。使用默认算法设置。

配体对接

使用‘制备配体’方案制备配体，且使用‘生成构象’方案生成构象，两者均在DS 4.0中执行。使用CDocker方案(DS 4.0)进行配体的对接。使用默认方案设置。

对表现出外耳炎症状的患者的脓液样品的分析

分析获得自患有外耳炎的7名患者(2-80岁)的脓液样品。在每个样品中，通过三种单独的方法检查铜绿假单胞菌的存在：

(i) 样品的一部分用于常规培养拭子测定；

(ii) 样品的第二部分经受使用GC的动态顶部空间分析用于2-AA检测。对于动态顶部空间分析，将脓液悬浮于标准盐水溶液(0.9％ NaCl)中，并置于20mm顶部空间小瓶中。将顶部空间小瓶摇动并在60℃下温育10分钟。使用500ml氦气以20ml/min将顶部空间连续收集至Tenax TA管，持续1小时。将Tenax管在热解吸单元(Gerstel TDU)中在210℃下以未分模式解吸4分钟，随后将蒸气捕获于PTV注射器(Gerstel CIS4)中，所述PTV注射器保持在-70℃下。解吸完成之后，将PTV以12℃/sec加热至300℃，并在那里保持4分钟。GC色谱柱为Restek Rxi-XLB中等极性柱，30X0.250X25。He流速为1.1 ml/min，烘箱程序为40℃持续3分钟，然后12.5℃/min至300℃，持续3分钟。对于质量92.0；120.0；135.0，以SIM模式(选择性离子监测)进行质谱获取；

(iii) 对于2-AA针对LuxR应答调节物的活性，用大肠杆菌/pSB401报道菌株检查了样品的第三部分。对于LuxR活化测定，将脓液样品转移至无菌1.5 ml离心管。将二十微升大肠杆菌/pSB401报道菌株的过夜生长培养物置于250 μl琼脂上，所述琼脂在离心管帽的内部部分凝固。然后将管密封，并在37℃下的静态条件下温育过夜。脓液样品和报道菌株之间没有接触，并且活化仅通过脓液发出的挥发物而发生。温育后，将报道菌株的菌落转移至96孔板中的100ul PBS中。在读板器中测量悬浮菌落的发光和吸光度。

结果

铜绿假单胞菌的挥发物对基于发光的QS报道菌株的影响。

在双向Petri皿的两个单独隔室中用几种报道菌株接种铜绿假单胞菌PA14。测试和报道菌株的此类隔室接种使得能够仅在它们之间交换挥发物。在大肠杆菌/pSB401(报道菌株)中检测到发光的显著诱导(图1)，表明铜绿假单胞菌的挥发性物质可诱导细胞密度感应(QS)细胞至细胞通讯调节途径，据推测是由C6-和C8-高丝氨酸内酯(HSL)信号分子介导的那些。

在另一系列的实验中，为了识别可以充当QS激动剂或拮抗剂的潜在挥发性物质，使用双向Petri皿观察了由铜绿假单胞菌产生的总挥发物对几种QS生物报道者的影响，所述双向Petri皿具有独立隔间、但具有联合顶部空间，其仅允许交换挥发性物质。本研究中使用的生物报道者对碳链长度范围为四至12个碳的各种酰基高丝氨酸内酯(“AHL”或“HSL”)分子响应。这些分子是革兰氏阴性细菌用于通讯的最常见的QS信号传导分子。表I中汇总了本研究中所用的报道菌株及其指定的响应调节物。

铜绿假单胞菌PAO1菌株的挥发物在大肠杆菌/pSB401报道菌株中显著诱导阳性发光响应，其由费氏弧菌LuxR应答调节物调节(P<0.05；Ranks的ANOVA和Student–Newman–Keuls事后检验)(图2)。此外，铜绿假单胞菌的挥发物的影响对于由1 pmol N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯(3-氧代-C6-HSL)获得的诱导是协同的(图2)。值得注意的是，铜绿假单胞菌的挥发物没有影响任何其它被检查的响应调节物(数据未显示)，也没有充当LuxR的拮抗剂(图2)，表明来自铜绿假单胞菌的总挥发物的某些化合物可以特异性活化LuxR响应调节物。

铜绿假单胞菌具有对于其在宿主内的完全毒力和持久性至关重要的三种不同的QS***。两种***las和rhl分别由N-3-氧代-十二酰基-高丝氨酸内酯和N-丁酰基-高丝氨酸内酯活化。第三种***mvfR由喹诺酮类信号4-羟基-2-庚基喹诺酮(heptylequinolone)和假单胞菌喹诺酮信号(PQS)活化。

总体而言，超过10％的铜绿假单胞菌基因组处于QS的调节下。为了确定QS突变体是否可以维持其活化LuxR报道菌株的能力，测试了具有LasR响应调节物产生缺陷的ΔlasR突变体的响应。选择该突变体是因为铜绿假单胞菌的三种QS***是分层组织的，使得lasQS***相比于rhl和PQS占主导地位的。

与WT菌株相反，ΔlasR突变体的总挥发物没有活化LuxR响应调节物(数据未显示)。为了识别负责铜绿假单胞菌活化LuxR响应调节物的挥发性物质，进行了ΔlasR和WT菌株的比较气相色谱质谱(GC/MS)分析。如图3A和3B中所见，在lasR突变的挥发物概况中缺失的主要挥发物是2-氨基苯乙酮(2-AA)。

2-AA对基于发光的QS报道菌株的影响

2-AA在铜绿假单胞菌的挥发物概况中是主要的。为了确定QS-调节的发光的诱导是否由2-AA特异性引起，在添加2-AA (50 μM)后测量各种QS-报道菌株的发光。结果显示，主要对C6-HSL敏感的大肠杆菌/pSB401报道者，在暴露于2-AA后表现出对发光的显著的两个数量级的诱导(图4)。

在另一个系列的实验中，将作为挥发物或呈溶解状态的不同浓度的合成2-AA添加至大肠杆菌/pSB401和大肠杆菌JLD271/pAL103报道菌株的培养物。当作为液体(图5A和5B)和作为挥发物(数据未显示)应用时，2-AA能够显著诱导报道菌株的LuxR调节的发光(p<0.05；分别为ANOVA和Dennett事后检验和student氏t检验)。

类似于铜绿假单胞菌的总挥发物的影响，相比于10 nM AHL而无2-AA测量的值，将2-AA添加至用固定浓度的AHL (10 nM)接种的生物传感器进一步诱导了LuxR调节的发光(图5A和5B，绿色条)。

然而，相比于大肠杆菌JLD271/pAL103生物传感器(100和500 μm)，对大肠杆菌/pSB401生物传感器(25-500 μm)具有协同作用的浓度范围存在差异。为了验证观察到的由存在的2-AA经由LuxR活化对发光的诱导，将2-AA应用于大肠杆菌JLD271/pAL104报道菌株，其携带与pAL103相同的质粒，但缺乏编码LuxR的基因。

观察到2-AA对LuxR阴性报道者没有影响，表明确实2-AA与LuxR受体直接相互作用(数据未显示)。尽管铜绿假单胞菌的挥发物仅活化LuxR响应调节物，但研究了合成的2-AA化合物与上述其它生物报道菌株可能的交叉反应。类似于用铜绿假单胞菌的总挥发物获得的结果，2-AA没有诱导铜绿假单胞菌同源QS受体、RhlR和LasR的活性(数据未显示)。50和100 µM 2-AA在存在AHL的情况下轻微抑制(分别为20%和16％)RhlR调节的发光，然而，2-AA在不存在AHL的情况下也将发光轻微抑制至相同水平(20％)，说明该抑制不是经由配体响应调节物相互作用。500 µM 2-AA针对LasR-和RhlR调节的发光表现出更显著的抑制(减少40％)。根据O.D.测量，观察到的发光减少不是由于生长抑制。因此，尽管极高浓度(500 µM)的2-AA直接抑制LasR和RhlR是可行的，但这样的浓度是非生理性高的，并且可能是生物学无关的。值得注意的是，对于在本研究中检查的任何其它响应调节物(即TraR、SdiA、CepR、AhyR和AhlR)，2-AA没有表现出任何显著的活化(数据未显示)。

上述结果显示，2-AA可以在基于大肠杆菌的生物传感器菌株中活化luxR响应调节物。为了充分评估该发现的生物学意义，检查2AA对野生型费氏弧菌MJ-1的LuxR调节的自然发光的活性。在未添加外源HSL的情况下，野生型费氏弧菌MJ-1表现出相对低水平的发光。尽管如此，添加10 nM 3-氧代-C6-HSL导致发光的显著增加(图6)。显著地，将2-AA添加至野生型费氏弧菌MJ-1也以剂量依赖的方式显著增加发光，类似于携带LuxR的报道菌株的活化。

当将2-AA作为挥发物以1µg添加至双向Petri(对侧接种大肠杆菌/pSB401)时，也获得对发光的诱导(图7)。在这些实验中使用的2-AA的浓度与铜绿假单胞菌的培养物中的2-AA的浓度(5 µg/ml; 37 µM)是一致的。值得注意的是，2-AA的添加对PAO-JP2/pKD201菌株(对C12-HSL敏感)(图8)和铜绿假单胞菌/RhlA受体(对C4-HSL敏感)(图9)的发光没有影响。这些结果表明，2-AA可以特异性模拟HSL的C6和C8链。

2-AA的结构分析和生物信息学对接

AHL(也称为HSL)和2-AA在结构上相当不同，因此，AHL-结合LuxR和2-AA之间的相互作用的性质不清楚。为了更好地理解2-AA与AHL结合受体的表观特异性和相互作用，检查了几种2-AA类似物(4-氨基苯乙酮、3-氨基苯乙酮、苯乙酮、2-硝基苯乙酮、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸和2-氨基苯甲醛)对大肠杆菌/pSB401报道菌株的发光的影响(图10)。这些类似物或者在交替位置具有其胺基，或者在酮基具有取代。第三和第四位置的胺基的缺失或移位以及用羧酸、酯或醛取代酮基完全消除了报道菌株表现出的对发光的诱导(P<0.05；ANOVA和Student–Newman–Keuls事后检验)(图10)。相比于2-AA，用硝基取代胺基部分减少LuxR活化，表明2-硝基苯乙酮也可活化LuxR，但程度低于2-AA。显著地，在存在AHL的情况下，用2-硝基苯乙酮没有观察到剂量依赖性或协同作用。此外，无一类似物(除了2-硝基苯乙酮)在不存在外源AHL的情况下表现出显著诱导活性，或在存在AHL (HSL)的情况下表现出协同/拮抗活性(数据未显示)。不希望限于单一假设，这些结果表明，酮基的存在和胺基的位置是LuxR-2-AA相互作用和活化的关键因素。

为了进一步研究LuxR与2-AA的相互作用，将2-AA和LuxR的同源配体3-氧代-C6-HSL对接至LuxR模型进行生物信息学分析。对接的2-AA和3-氧代-C6-HSL的重叠揭示了2-AA环和LuxR的结合口袋内的3-氧代-C6-HSL的环的类似位置(数据未显示)。在不希望限于单一假设的同时，AHL对接的结果表明，Trp66、Asp79和Tyr70是通过经由氢键与AHL相互作用的AHL-LuxR相互作用中的关键残基(图11A)。除了这些相互作用以外，与Pro48、Met51、Ile56、Ile76和Val82的疏水性相互作用可以起到稳定碳链的作用。将2-AA对接至LuxR模型中表明参与3-氧代-C6-HSL相互作用的一些LuxR保守残基(Trp66、Tyr70和Asp 79)也在2-AA(蓝色)和受体之间的相互作用中发挥作用(图11B)。一种可能性是，Tyr70和Asp79可以与胺基形成氢键，Trp66可以与羰基形成氢键。此外，表明Tyr62、Leu118、Ala139、Ile46、Ile81参与疏水性相互作用。形成疏水性相互作用的所有五个残基的组合在不同的QS受体结合位点间不是保守的，并且相比于SdiA、LasR和TraR对于LuxR是独特的(数据未显示)，与2-AA对于LuxR的特异性一致。

总而言之，本文提供的结果表明，2-AA，由铜绿假单胞菌以相对高量(高达80 μM)产生且疑似在病原体的持续及其与宿主的相互作用中重要的低分子量挥发性化合物是LuxR响应调节物的特异性活化剂。如从图4至9显而易见的是，3-氧代-C6-HSL对于LuxR的亲和力比2-AA对于LuxR的亲和力高约三个数量级。尽管如此，不同亲和力的生理相关性可在于两种挥发物的生理浓度的差异：弧菌属的细菌培养物中测量的3-氧代-C6-HSL的浓度在1至10 nM之间变化，而铜绿假单胞菌培养物中的2-AA浓度达到80 μM。

2-AA不活化铜绿假单胞菌的QS受体。在不希望限于单一假设的同时，可以想到的是，2-AA可能充当物种间信号，活化其它细菌中的QS***。在栖息于人体至海洋沉积物的各种环境的若干种细菌物种的总挥发物中已 检测到2-AA。来自其它细菌物种的LuxR同源物的BLAST分析揭示，除了费氏弧菌以外的几种细菌物种，诸如火神弧菌、拟态弧菌、鳆发光杆菌和副溶血性弧菌，具有高度类似的LuxR同源物，其包括据发现与2-AA相互作用但在非反应性SdiA、TraR和LasR受体中缺乏的所有残基(图12)。

2-AA的质谱分析：

出于校准目的，进行2-AA标准品的质谱(MS)分析。TIC - 总离子色谱测量(图13A)显示在17.567的保留时间的峰，并且所选离子监测谱(SIM)(图13B)显示三种离子处于正确比率（分别对于135、120和92为70:100:50）。

获得准确2-AA MS信号特征后，对得自表现出严重外耳感染的患者的脓液进行TIC和SIM分析。同时分析了脓液样品活化报道菌株的发光的能力，并取样用于指示铜绿假单胞菌的存在的培养测试。使用两种样品：脓液样品编号1(其在培养测试中为铜绿假单胞菌阳性)，和脓液样品编号2(其在培养测试中为铜绿假单胞菌阴性)(数据未显示)。脓液样品编号1的TIC和SIM分析在该样品中识别出了2-AA(图14C)，并且报道菌株在暴露于该脓液样品发出的挥发物后也产生发光信号(图16B)。相反，TIC和SIM分析不能在脓液样品编号2中检测到2-AA(图15A和15B，以及16A)。报道菌株在暴露于脓液样品编号2发出的挥发物后也没有产生发光信号(图16B)。

除了图16A和16B中分析的样品以外，分析来自年龄范围为2-80岁的患者的其它五种脓液样品。所有样品在培养、TIC和生物传感器分析中都得到阴性结果，表明这些患者没有被铜绿假单胞菌感染。

还对经治疗的马的外部伤口进行了分析。从指屈肌腱鞘收集了两个组织样品。检查了来自两处伤口的样品。分析它们开始治疗后两天(伤口编号1，样品编号1)和一周(伤口编号2，样品编号2)的样品(在治疗开始前的零时间未提供样品)。治疗开始前，两处伤口在培养测定中均为铜绿假单胞菌细菌阳性。在治疗结束时(10天)从伤口取出的样品在培养测定中为铜绿假单胞菌细菌阴性。图17显示样品一(其对应于抗生素治疗2天)为2-AA阳性，而样品编号二为2-AA阴性，其对应于抗生素治疗的完成和抗细菌作用。

总而言之，这些结果表明，2-AA可以充当例如外耳(外耳炎)的铜绿假单胞菌感染的准确生物标志物，并且表达融合至报道基因的luxR受体的细菌报道菌株可用作检测铜绿假单胞菌感染的简单、准确和灵敏的诊断工具。

尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但明显的是，许多替代、修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，其意在包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请在本文都通过引用全部并入本说明书中，其程度如同每个单独出版物、专利、专利申请具体而单独指明通过引用并入本文中一样。此外，本申请中对任何参考文献的引用或鉴定不应当解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术获得。在使用的节段标题的程度上，它们不应解释为必然限制性的。

序列表

<110> Yissum Research Development Company of the Hebrew

University of Jerusalem Ltd.

Yeda Research and Development Co. Ltd.

HELMAN, Yael

SOBEL, Noam

SHUSHAN, Sagit

KVIATKOVSKI, Igor

FRUMIN, Idan

CHERNIN, Leonid

SECUNDO, Lavi

<120> 用于检测铜绿假单胞菌的方法和装置

<130> 61656

<150> 61/947,080

<151> 2014-03-03

<160> 46

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> 费氏弧菌

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<213> 拟态弧菌

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<213> 鳆发光杆菌

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<221> misc_feature

<222> (172)..(172)

<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸

<400> 9

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Leu Gly Cys Ser Glu Arg Gly Gly

210 215

<210> 10

<211> 208

<212> PRT

<213> 副溶血性弧菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (183)..(183)

<223> Xaa 可以是任何天然氨基酸

<400> 10

Met Gly Met Lys Asp Ile Asn Ala Asp Asp Thr Tyr Arg Ile Ile Asn

1 5 10 15

Lys Ile Lys Arg Cys Arg Ser Asn Lys Asp Ile Asn Gln Cys Leu Ser

20 25 30

Asp Met Thr Lys Met Val His Cys Glu Tyr Tyr Leu Leu Ala Ile Ile

35 40 45

Tyr Pro His Cys Met Val Lys Ser Asp Ile Ser Ile Val Asp Asn Tyr

50 55 60

Pro Lys Lys Trp Arg Gln Tyr Tyr Asp Asp Ala Asn Leu Ile Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Pro Ile Val Asp Tyr Ser Asn Ser Asn His Ser Pro Ile Asn Trp

85 90 95

Asn Ile Phe Glu Asn Asn Ala Val Asn Lys Lys Ser Pro Asn Val Ile

100 105 110

Lys Glu Ala Lys Ser Ser Gly Leu Ile Thr Gly Phe Ser Phe Pro Ile

115 120 125

His Thr Ala Asn Asn Gly Phe Gly Met Leu Ser Phe Ala His Ser Glu

130 135 140

Lys Asp Asn Tyr Ile Asp Ser Leu Phe Leu Gln Ala Cys Met Asn Ile

145 150 155 160

Pro Leu Ile Val Pro Ser Leu Val Asp Asn Tyr Arg Lys Ile Asn Ile

165 170 175

Ala Asn Asn Lys Ser Asn Xaa Asp Leu Thr Lys Arg Glu Lys Glu Cys

180 185 190

Leu Ala Trp Ala Cys Glu Gly Lys Ser Ser Trp Asp Ile Ser Lys Ile

195 200 205

<210> 11

<211> 1866

<212> DNA

<213> 费氏弧菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (1203)..(1203)

<223> n 为 a、c、g或t

<400> 11

aagctttact tacgtactta atttttaaag tatgggcaat caattgctcc tgttaaaatt 60

gctttagaaa tactttggca gcggtttgtt gtattgagtt tcatttgcgc attggttaaa 120

tggaaagtga cagtacgctc actgcagcct aatatttttg aaatatccca agagcttttt 180

ccttcgcatg cccacgctaa acattctttt tctcttttgg ttaaatcgtt gtttgattta 240

ttatttgcta tatttatttt tcgataatta tcaactagag aaggaacaat taatggtatg 300

ttcatacacg catgtaaaaa taaactatct atatagttgt ctttttctga atgtgcaaaa 360

ctaagcattc cgaagccatt gttagccgta tgaataggga aactaaaccc agtgataaga 420

cctgatgttt tcgcttcttt aattacattt ggagattttt tatttacagc attgttttca 480

aatatattcc aattaattgg tgaatgattg gagttagaat aatctactat aggatcatat 540

tttattaaat tagcgtcatc ataatattgc ctccattttt tagggtaatt atctagaatt 600

gaaatatcag atttaaccat agaatgagga taaatgatcg cgagtgttaa ataatattca 660

caatgtacca ttttagtcat atcagataag cattgattaa tatcatatgc tctacaagct 720

ttaattttat taattattct gtatgtgtcg tcggcattta tgtttttcat acccatctct 780

ttatccttac ctattgtttg tcgcaagttt tgcgtgttat atatcattaa aacggtaatg 840

gattgacatt tgattctaat aaattggatt tttgtcacac tattgtatcg ctgggaatac 900

aattacttaa cataagcacc tgtaggatcg tacaggttta gcgaagaaaa tggtttgtta 960

tagtcgaata aacgcaaggg aggttggtat gactataatg ataaaaaaat cggatttttt 1020

ggcaattcca tcggaggagt ataaaggtat tctaagtctt cgttatcaag tgtttaagca 1080

aagacttgag tgggacttag ttgtagaaaa taaccttgaa tcagatgagt atgataactc 1140

aaatgcagaa tatatttatg cttgtgatga tactgaaaat gtaagtggat gctggcgttt 1200

atnacctaca acaggtgatt atatgctgaa aagtgttttt cctgaattgc ttggtcaaca 1260

gagtgctccc aaagatccta atatagtcga attaagtcgt tttgctgtag gtaaaaatag 1320

ctcaaagata aataactctg ctagtgaaat tacaatgaaa ctatttgaag ctatatataa 1380

acacgctgtt agtcaaggta ttacagaata tgtaacagta acatcaacag caatagagcg 1440

atttttaaag cgtattaaag ttccttgtca tcgtattgga gacaaagaaa ttcatgtatt 1500

aggtgatact aaatcggttg tattgtctat gcctattaat gaacagttta aaaaagcagt 1560

cttaaattaa tgttgttaaa tcattaattt attttaaata ctaagtatat tatagggaaa 1620

ataatgaata aatgtattcc aatgataatt aatggaatga ttcaagattt tgataattat 1680

gcatataaag aagttaaact aaataatgat aatagagtaa aattatctgt cattactgaa 1740

agttcagttt caaaaacatt aaatatcaaa gatagaatta atctaaattt aaatcagatt 1800

gtgaattttt tatataccgt tggtcaacga tggaaaagtg aagaatataa tcggcgacga 1860

acctat 1866

<210> 12

<211> 1228

<212> DNA

<213> 火神弧菌

<400> 12

cagcggttag ttgtattgag tttcatttgc gcattggtta aatggaaagt gacagtacgc 60

acactgcagc ctaatatttt tgaaatatcc caagagcttt ttccttcgca tgcccacgct 120

aaacattctt tttctctttt ggttaaatcg ttgtttgatt tattatttgc tatatttatt 180

tttcgataat tatcaactag agaaggaaca attaatggta tgttcataca cgcatgtaaa 240

aataaactat ctatatagtt gtctttttct gaatgtgcaa aactaagcat tccgaagcca 300

ttgttagccg tatgaatagg gaaactaaac ccagtgataa gacctgatgt tttcgcttct 360

ttaattacat ttggagattt tttatttaca gcattgtttt caaagatatt ccaattaatt 420

ggtgaatgat tggagttaga ataatctact ataggatcat attttattaa attagcgtca 480

tcataatatt gcctccattt tttagggtaa ttatctagaa ttgaaatatc agatttaacc 540

atagaatgag gataaatgat cgcgagtaaa taatattcac aatgtaccat tttagtcata 600

tcagataagc attgattaat atcattattg cttctacaag ctttaatttt attaattatt 660

ctgtaagtgt cgtcggcatt tatgtctttc atacccatct ctttatcctt acctattgtt 720

tgtcgcaagt tttgcgtgtt atatatcatt aaaacggtaa tggattgaca tttgattcta 780

ataaattgga tttttgtcac actattgtat cgctgggaat acaattactt aacataagta 840

cctgtaggat cgtacaggtt tacgcaagaa aatggtttgt tatagtcgac taaacgcaag 900

ggaggttggt atgactataa tgataaaaaa atcggatttt ttggcaattc catcggagga 960

gtataaaggt attctaagtc ttcgttatca agtgtttaag caaagacttg agtgggactt 1020

agttgtagaa aataaccttg aatcagatga gtatgataac tcaaatgcag aatatattta 1080

tgcttgtgat gatactgaaa atgtaagtgg atgctggcgt ttattaccta caacagggtg 1140

attatatgct gaaaatgttt ttcctgaatt gcttggtcaa cagagtgctc ccaaagatcc 1200

taatatagtc gaattaagcc gttttgct 1228

<210> 13

<211> 1144

<212> DNA

<213> 拟态弧菌

<400> 13

tttgcgcatt ggttaaatgg aaagtgacag tacgctcact gcagcctaat atttttgaaa 60

tatcccaaga gctctttcct tcgcatgccc acgctaaaca ttctttttct cttttggtta 120

aatcgttgtt tgatttatta tttgctatat ttatttttcg ataattatca actagagaag 180

gaacaattaa tggtatgttc atacacgcat gtaaaaataa actatctata tagttgtctt 240

tctctgaatg tgcaaaacta agcattccga agccattatt agccgtatga atagggaaac 300

taaacccagt gataagacct gatgttttcg cttctttaat tacatttgga gattttttat 360

ttacagcatt gttttcaaat atattccaat taattggtga atgattggag ttagaataat 420

ctactatagg atcatatttt attaaattag cgtcatcata atattgcctc cattttttag 480

ggtaattatc tagaattgaa atatcagatt tcaccatgga atgaggataa atgatcgcga 540

gtaaataata ttcacaatgt accattttag tcatatcaga taagcattga ttaatatcat 600

tattgcttct acaagcttta attttattaa ttattctgta agtgtcgtcg gcatttatgt 660

ctttcatacc catctcttta tccttaccta ttgtttgtcg caagttttgc gtgttatata 720

tcattaaaac agtaatagat tgacatttga ttctaataaa ttggattttt gtcacactat 780

tgtatcgctt gaaatacaat tgtttaacat gagtgcctgt aggatcgtac aggtttacgt 840

aagaaaatgg tttgttatag tcgattaaac gcaagggagg ttggtatgac tataatgata 900

aaaaaatcgg attttttggc aattccatcg gaggagtata aaggtattct aagtcttcgt 960

tatcaagtat ttaagcaaag acttgagtgg gacttagttg tagaaaataa tcttgaatca 1020

gatgagtatg ataactcaaa tgcagaatat atttatgctt gtgatgatac tgaaaatgta 1080

agtggatgct ggcgtttatt acctacaaca ggtgatatta tgctgaaaag tgtttttcct 1140

gaat 1144

<210> 14

<211> 1030

<212> DNA

<213> 鳆发光杆菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (137)..(137)

<223> n 为 a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (139)..(139)

<223> n 为 a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (995)..(995)

<223> n 为 a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1002)

<223> n 为 a、c、g或t

<400> 14

agtgaccccc acgctcactg cagcctaata tttttgaact atcccaagag ctttttcctt 60

cgcatgccca cgctaaacat tctttttctc ttttggttaa atcgttgttt gatttattat 120

ttgctatatt tattttncna taattatcaa ctagagaagg aacaattaat ggtatgttca 180

tacacgcatg taaaaataaa ctatctatat agttgtcttt ttctgaatgt gcaaaactaa 240

gcattccgaa gccattgtta gccgtatgaa tagggaaact aaacccagtg ataagacctg 300

atgttttcgc ttctttaatt acatttggag attttttatt tacagcattg ttttcaaaga 360

tattccaatt aattggtgaa tgattggagt tagaataatc tactatagga tcatatttta 420

ttaaattagc gtcatcataa tattgcctcc attttttagg gtaattatct agaattgaaa 480

tatcagattt aaccatagaa tgaggataaa tgatcgcgag taaataatat tcacaatgta 540

ccattttagt catatcagat aagcattgat taatatcatt attgcttcta caagctttaa 600

ttttattaat tatcctgtaa gtgtcgtcgg catttatgtc tttcataccc atctctttat 660

ccttacctat tgtttgtcgc aagttttgcg tgttatatat cattaaaacg gtaatggatt 720

gacatttgat tctaataaat tggatttttg tcacactatt gtatcgctgg gaatacaatt 780

acttaacata agtacctgta ggatcgtaca ggtttacgca agaaaatggt ttgttatagt 840

cgactaaacg caagggaggt tggtatgact ataatgataa aaaaatcgga ttttttggca 900

attccatcgg aggagtataa aggtattcta agtcttcgtt atcaagtgtt taagcaaaga 960

cttgagtggg acttagttgt agaaaataac cttgnatcag angagtatga taactcaaat 1020

gcagaatata 1030

<210> 15

<211> 1097

<212> DNA

<213> 副溶血性弧菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> n 为 a、c、g或t

<400> 15

tatttttgaa atatcccaag agctctttcc ttcgcatgcc cacgctaaac attctttttc 60

tcttttggtt aaatcgntgt ttgatttatt atttgctata tttatttttc gataattatc 120

aactagagaa ggaacaatta atggtatgtt catacacgcc tgtaaaaata aactatctat 180

atagttgtct ttctctgaat gtgcaaaact aagcattccg aagccattat tagccgtatg 240

aatagggaaa ctaaacccag tgataagacc tgatgatttc gcttctttaa ttacatttgg 300

agatttttta tttacagcat tgttttcaaa tatattccaa ttaattggtg aatgattgga 360

gttagaataa tctactatag gatcatattt tattaaatta gcgtcatcat aatattgcct 420

ccatttttta gggtaattat ctacaattga aatatcagat ttaaccatgc aatgaggata 480

aatgatcgcg agtaaataat attcacaatg taccatttta gtcatatcag ataagcattg 540

attaatatcc ttattgcttc tacagcgttt aattttatta attattctgt aagtgtcgtc 600

ggcatttatg tctttcatac ccatctcttt atccttacct attgtttgtc gcaagttttg 660

cgtgttatat atcattaaaa cggtaatgga ttggcatttg attctaataa attggatttt 720

tgtcacacct attgtatcgc caggagtaca attgattaac ataagtaccc tgtaggatcg 780

tacaggttta cgcaagaaaa tggtttgtta tagtcgatta aacgcaaggg aggttggtat 840

gactataatg ataaaaaaat cggatttttt ggcaattcca tcggaggagt ataaaggtat 900

tctaagtctt cgttatcaag tgtttaagca aagacttgag tgggacttag ttgtagaaaa 960

taaccttgaa tcagatgagt atgataactc aaatgcagaa tatatttatg cttgtgatga 1020

tactgaaaat gtaagtggat gctggcgttt attacctaca acaggtgatt atatgctgaa 1080

gaatgttttt cctgaat 1097

<210> 16

<211> 6960

<212> DNA

<213> 费氏弧菌

<400> 16

gaattcttct ttagaaatct gccggtaaaa attagattgc tattcaatct atttctatcg 60

gtatttgtga aataatactc aggataataa tttacataaa tattatcacg cattagagaa 120

gagcatgact tttttaattt aaacttttca ttaacaaatc ttgttgatat gaaaattttc 180

ctttgctatt ttaacagata ttaaaacggg aataggcgtt atattgacga tccattcagt 240

tagattaaaa accttgagca gaaaatttat attattatca taattatgac gaaagttaca 300

ggccaggaac cacgtagtca gaatctgatt ttctatatat ttgttattta catcgtcata 360

acacaaaaat ataagaagca agtgttggta cgaccagttc gcaagatagt taaacagcaa 420

cttaagttga aattaccccc attaaatgga tggcaaatat gactaaaaaa atttcattca 480

ttattaacgg ccaggttgaa atctttcccg aaagtgatga tttagtgcaa tccattaatt 540

ttggtgataa tagtgtttac ctgccaatat tgaatgactc tcatgtaaaa aacattattg 600

attgtaatgg aaataacgaa ttacggttgc ataacattgt caattttctc tatacggtag 660

ggcaaagatg gaaaaatgaa gaatactcaa gacgcaggac atacattcgt gacttaaaaa 720

aatatatggg atattcagaa gaaatggcta agctagaggc caattggata tctatgattt 780

tatgttctaa aggcggcctt tatgatgttg tagaaaatga acttggttct cgccatatca 840

tggatgaatg gctacctcag gatgaaagtt atgttcgggc ttttccgaaa ggtaaatctg 900

tacatctgtt ggcaggtaat gttccattat ctgggatcat gtctatatta cgcgcaattt 960

taactaagaa tcagtgtatt ataaaaacat cgtcaaccga tccttttacc gctaatgcat 1020

tagcgttaag ttttattgat gtagacccta atcatccgat aacgcgctct ttatctgtta 1080

tatattggcc ccaccaaggt gatacatcac tcgcaaaaga aattatgcga catgcggatg 1140

ttattgtcgc ttggggaggg ccagatgcga ttaattgggc ggtagagcat gcgccatctt 1200

atgctgatgt gattaaattt ggttctaaaa agagtctttg cattatcgat aatcctgttg 1260

atttgacgtc cgcagcgaca ggtgcggctc atgatgtttg tttttacgat cagcgagctt 1320

gtttttctgc ccaaaacata tattacatgg gaaatcatta tgaggaattt aagttagcgt 1380

tgatagaaaa acttaatcta tatgcgcata tattaccgaa tgccaaaaaa gattttgatg 1440

aaaaggcggc ctattcttta gttcaaaaag aaagcttgtt tgctggatta aaagtagagg 1500

tggatattca tcaacgttgg atgattattg agtcaaatgc aggtgtggaa tttaatcaac 1560

cacttggcag atgtgtgtac cttcatcacg tcgataatat tgagcaaata ttgccttatg 1620

ttcaaaaaaa taagacgcaa accatatcta tttttccttg ggagtcatca tttaaatatc 1680

gagatgcgtt agcattaaaa ggtgcggaaa ggattgtaga agcaggaatg aataacatat 1740

ttcgagttgg tggatctcat gacggaatga gaccgttgca acgattagtg acatatattt 1800

ctcatgaaag gccatctaac tatacggcta aggatgttgc ggttgaaata gaacagactc 1860

gattcctgga agaagataag ttccttgtat ttgtcccata ataggtaaaa gtatggaaaa 1920

tgaatcaaaa tataaaacca tcgaccacgt tatttgtgtt gaaggaaata aaaaaattca 1980

tgtttgggaa acgctgccag aagaaaacag cccaaagaga aagaatgcca ttattattgc 2040

gtctggtttt gcccgcagga tggatcattt tgctggtctg gcggaatatt tatcgcggaa 2100

tggatttcat gtgatccgct atgattcgct tcaccacgtt ggattgagtt cagggacaat 2160

tgatgaattt acaatgtcta taggaaagca gagcttgtta gcagtggttg attggttaac 2220

tacacgaaaa ataaataact tcggtatgtt ggcttcaagc ttatctgcgc ggatagctta 2280

tgcaagccta tctgaaatca atgcttcgtt tttaatcacc gcagtcggtg ttgttaactt 2340

aagatattct cttgaaagag ctttagggtt tgattatctc agtctaccca ttaatgaatt 2400

gccggataat ctagattttg aaggccataa attgggtgct gaagtctttg cgagagattg 2460

tcttgatttt ggttgggaag atttagcttc tacaattaat aacatgatgt atcttgatat 2520

accgtttatt gcttttactg caaataacga taattgggtc aagcaagatg aagttatcac 2580

attgttatca aatattcgta gtaatcgatg caagatatat tctttgttag gaagttcgca 2640

tgacttgagt gaaaatttag tggtcctgcg caatttttat caatcggtta cgaaagccgc 2700

tatcgcgatg gataatgatc atctggatat tgatgttgat attactgaac cgtcatttga 2760

acatttaact attgcgacag tcaatgaacg ccgaatgaga attgagattg aaaatcaagc 2820

aatttctctg tcttaaaatc tattgagata ttctatcact caaatagcaa tataaggact 2880

ctctatgaaa tttggaaact ttttgcttac ataccaacct ccccaatttt ctcaaacaga 2940

ggtaatgaaa cgtttggtta aattaggtcg catctctgag gagtgtggtt ttgataccgt 3000

atggttactg gagcatcatt tcacggagtt tggtttgctt ggtaaccctt atgtcgctgc 3060

tgcatattta cttggcgcga ctaaaaaatt gaatgtagga actgccgcta ttgttcttcc 3120

cacagcccat ccagtacgcc aacttgaaga tgtgaattta ttggatcaaa tgtcaaaagg 3180

acgatttcgg tttggtattt gccgagggct ttacaacaag gactttcgcg tattcggcac 3240

agatatgaat aacagtcgcg ccttagcgga atgctggtac gggctgataa agaatggcat 3300

gacagaggga tatatggaag ctgataatga acatatcaag ttccataagg taaaagtaaa 3360

ccccgcggcg tatagcagag gtggcgcacc ggtttatgtg gtggctgaat cagcttcgac 3420

gactgagtgg gctgctcaat ttggcctacc gatgatatta agttggatta taaatactaa 3480

cgaaaagaaa gcacaacttg agctttataa tgaagtggct caagaatatg ggcacgatat 3540

tcataatatc gaccattgct tatcatatat aacatctgta gatcatgact caattaaagc 3600

gaaagagatt tgccggaaat ttctggggca ttggtatgat tcttatgtga atgctacgac 3660

tatttttgat gattcagacc aaacaagagg ttatgatttc aataaagggc agtggcgtga 3720

ctttgtatta aaaggacata aagatactaa tcgccgtatt gattacagtt acgaaatcaa 3780

tcccgtggga acgccgcagg aatgtattga cataattcaa aaagacattg atgctacagg 3840

aatatcaaat atttgttgtg gatttgaagc taatggaaca gtagacgaaa ttattgcttc 3900

catgaagctc ttccagtctg atgtcatgcc atttcttaaa gaaaaacaac gttcgctatt 3960

atattagcta aggagaaaga aatgaaattt ggattgttct tccttaactt catcaattca 4020

acaactgttc aagaacaaag tatagttcgc atgcaggaaa taacggagta tgttgataag 4080

ttgaattttg aacagatttt agtgtatgaa aatcattttt cagataatgg tgttgtcggc 4140

gctcctctga ctgtttctgg ttttctgctc ggtttaacag agaaaattaa aattggttca 4200

ttaaatcaca tcattacaac tcatcatcct gtcgccatag cggaggaagc ttgcttattg 4260

gatcagttaa gtgaagggag atttatttta gggtttagtg attgcgaaaa aaaagatgaa 4320

atgcattttt ttaatcgccc ggttgaatat caacagcaac tatttgaaga gtgttatgaa 4380

atcattaacg atgctttaac aacaggctat tgtaatccag ataacgattt ttatagcttc 4440

cctaaaatat ctgtaaatcc ccatgcttat acgccaggcg gacctcggaa atatgtaaca 4500

gcaaccagtc atcatattgt tgagtgggcg gccaaaaaag gtattcctct catctttaag 4560

tgggatgatt ctaatgatgt tagatatgaa tatgctgaaa gatataaagc cgttgcggat 4620

aaatatgacg ttgacctatc agagatagac catcagttaa tgatattagt taactataac 4680

gaagatagta ataaagctaa acaagagacg cgtgcattta ttagtgatta tgttcttgaa 4740

atgcacccta atgaaaattt cgaaaataaa cttgaagaaa taattgcaga aaacgctgtc 4800

ggaaattata cggagtgtat aactgcggct aagttggcaa ttgaaaagtg tggtgcgaaa 4860

agtgtattgc tgtcctttga accaatgaat gatttgatga gccaaaaaaa tgtaatcaat 4920

attgttgatg ataatattaa gaagtaccac atggaatata cctaatagat ttcgagttgc 4980

agcgaggcgg caagtgaacg aatccccagg agcatagata actatgtgac tggggtgagt 5040

gaaagcagcc aacaaagcag cagcttgaaa gatgaagggt ataaaagagt atgacagcag 5100

tgctgccata ctttctaata ttatcttgag gagtaaaaca ggtatgactt catatgttga 5160

taaacaagaa attacagcaa gctcagaaat tgatgatttg attttttcga gcgatccatt 5220

agtgtggtct tacgacgagc aggaaaaaat cagaaagaaa cttgtgcttg atgcatttcg 5280

taatcattat aaacattgtc gagaatatcg tcactactgt caggcacaca aagtagatga 5340

caatattacg gaaattgatg acatacctgt attcccaaca tcggttttta agtttactcg 5400

cttattaact tctcaggaaa acgagattga aagttggttt accagtagcg gcacgaatgg 5460

tttaaaaagt caggtggcgc gtgacagatt aagtattgag agactcttag gctctgtgag 5520

ttatggcatg aaatatgttg gtagttggtt tgatcatcaa atagaattag tcaatttggg 5580

accagataga tttaatgctc ataatatttg gtttaaatat gttatgagtt tggtggaatt 5640

gttatatcct acgacattta ccgtaacaga agaacgaata gattttgtta aaacattgaa 5700

tagtcttgaa cgaataaaaa atcaagggaa agatctttgt cttattggtt cgccatactt 5760

tatttattta ctctgccatt atatgaaaga taaaaaaatc tcattttctg gagataaaag 5820

cctttatatc ataaccggag gcggctggaa aagttacgaa aaagaatctc tgaaacgtga 5880

tgatttcaat catcttttat ttgatacttt caatctcagt gatattagtc agatccgaga 5940

tatatttaat caagttgaac tcaacacttg tttctttgag gatgaaatgc agcgtaaaca 6000

tgttccgccg tgggtatatg cgcgagcgct tgatcctgaa acgttgaaac ctgtacctga 6060

tggaacgccg gggttgatga gttatatgga tgcgtcagca accagttatc cagcatttat 6120

tgttaccgat gatgtcggga taattagcag agaatatggt aagtatcccg gcgtgctcgt 6180

tgaaatttta cgtcgcgtca atacgaggac gcagaaaggg tgtgctttaa gcttaaccga 6240

agcgtttgat agttgatatc ctttgcctaa ttgtaagtgg aatgcttgcg ttatataaat 6300

ctgaatgaca tctacacttt acaaaattct ccaaaacatc cacatttggg tacttgatag 6360

aggtttatgg ggttggctta acattgttct cattgttatt attggctcaa agcaaaagga 6420

gataacatga aaaaattggc agttatgctt gcattgggaa tgattagctt tggtgcaatg 6480

gcagttgatg ggtataaaga tgcaaagttt ggcatgacag aagaagagtt tctttcgaag 6540

aggttatgtg attttgaaaa atttgaggga gattctcgaa tagaagaagt atcactttat 6600

tcatgttctg acttttcgtt tgctaacaaa aagcgtgaag caatggcatt ttttttaaat 6660

gggaaattta aaagattaga gattaatatt ggcagacttg tgaagccagt aagcaaatcg 6720

ttaacgaaaa agtacggaga tggatcatcg tatccatcaa aagaagaatt tgagaacgcg 6780

ctaaaataca atggaactat gtctataggt tatgataata atacggtatt agttgatata 6840

catataatat gtggcaaaga aggcatagaa accagtcaac tgatttatac gagtccagat 6900

gtttatacgc tcccagattt cggagaaaaa atccaggaat taaagggatt aaaggaattc 6960

<210> 17

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 绿色荧光蛋白

<400> 17

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Val Leu Ile

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Gly Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met

65 70 75 80

Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly

145 150 155 160

Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Leu Gln Thr Ala Ile Ser

195 200 205

Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210 215 220

Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 18

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 红色荧光蛋白

<400> 18

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 19

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 橙色荧光蛋白

<400> 19

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Gly Tyr Gly Ile Leu Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met

65 70 75 80

Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Met

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly

145 150 155 160

Leu Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Thr Ala Ile Ser

195 200 205

Lys Asp Arg Asn Glu Thr Arg Asp His Met Val Phe Leu Glu Phe Phe

210 215 220

Ser Ala Cys Gly His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 20

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 碱性磷酸酶

<400> 20

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala Arg Thr Pro Glu Met Pro Leu Gln Gly Thr Ala

20 25 30

Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Met His Ala Ser Leu Glu Val Leu Glu

35 40 45

Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg Arg

50 55 60

Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ser Leu Ser Asp Lys

65 70 75 80

Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp Ser

85 90 95

Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe Phe

100 105 110

Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr Ala

115 120 125

Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala Ala

130 135 140

Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala Leu

145 150 155 160

Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met Ala

165 170 175

Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu Gln

180 185 190

Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys Cys

195 200 205

Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Glu Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu Glu

210 215 220

Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg Ala

225 230 235 240

Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala Thr

245 250 255

Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gln Ala Gln Ala Arg

260 265 270

Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr Glu

275 280 285

Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn Met

290 295 300

Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser Val

325 330 335

Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser Lys

340 345 350

Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp Lys

355 360 365

Gln Asp His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val Asp

370 375 380

Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu Gly

385 390 395 400

Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln Ile

405 410 415

Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn Thr

420 425 430

Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu Asp

435 440 445

Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Pro

450 455 460

His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe Tyr

465 470 475 480

Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys

485

<210> 21

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 辣根过氧化物酶

<400> 21

Met Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser

1 5 10 15

Asn Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg

20 25 30

Ile Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn

35 40 45

Gly Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr

50 55 60

Glu Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val

65 70 75 80

Ile Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val

85 90 95

Ser Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu

100 105 110

Ala Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu

115 120 125

Gln Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe

130 135 140

Thr Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg

145 150 155 160

Ser Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn

165 170 175

Gln Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly

180 185 190

Leu Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly

195 200 205

Leu Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu

210 215 220

Arg Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu

225 230 235 240

Gln Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn

245 250 255

Ala Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln

260 265 270

Thr Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile

275 280 285

Thr Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val

290 295 300

Val Asn Ser Asn Ser

305

<210> 22

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> His标签

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (264)..(269)

<223> 组氨酸标签

<400> 22

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Thr Tyr

20 25 30

Lys Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Gly

85 90 95

Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

130 135 140

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

145 150 155 160

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

165 170 175

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

180 185 190

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg His Arg Ala Ala Ser Gly Ser Pro Asp Ala Cys Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro

245 250 255

Thr Leu Phe Pro Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala

260 265 270

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala

275 280 285

<210> 23

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Myc标签

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (273)..(283)

<223> Myc标签

<400> 23

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Thr Tyr

20 25 30

Lys Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Gly

85 90 95

Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

130 135 140

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

145 150 155 160

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

165 170 175

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

180 185 190

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg His Arg Ala Ala Ser Gly Ser Pro Asp Ala Cys Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro

245 250 255

Thr Leu Phe Pro Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala

260 265 270

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala

275 280 285

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生物素连接酶标签

<400> 24

Leu His His Ile Leu Asp Ala Gln Lys Met Val Trp Asn His Arg

1 5 10 15

<210> 25

<211> 1019

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> β-半乳糖苷酶

<400> 25

Met Ala Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly

1 5 10 15

Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp

20 25 30

Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg

35 40 45

Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala

50 55 60

Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val

65 70 75 80

Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr

85 90 95

Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr

100 105 110

Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Asn Val Asp Glu Ser

115 120 125

Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile Phe Asp Gly Val Asn Ser

130 135 140

Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val Gly Tyr Gly Gln Asp

145 150 155 160

Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala Phe Leu Arg Ala Gly

165 170 175

Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp Ser Asp Gly Ser Tyr

180 185 190

Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly Ile Phe Arg Asp Val

195 200 205

Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile Ser Asp Phe His Val Ala

210 215 220

Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val Leu Glu Ala Glu Val

225 230 235 240

Gln Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg Val Thr Val Ser Leu

245 250 255

Trp Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr Ala Pro Phe Gly Gly

260 265 270

Glu Ile Ile Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp Arg Val Thr Leu Arg

275 280 285

Leu Asn Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala Glu Ile Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp Gly Thr Leu Ile Glu

305 310 315 320

Ala Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val Arg Ile Glu Asn Gly

325 330 335

Leu Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile Arg Gly Val Asn Arg

340 345 350

His Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met Asp Glu Gln Thr Met

355 360 365

Val Gln Asp Ile Leu Leu Met Lys Gln Asn Asn Phe Asn Ala Val Arg

370 375 380

Cys Ser His Tyr Pro Asn His Pro Leu Trp Tyr Thr Leu Cys Asp Arg

385 390 395 400

Tyr Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn Ile Glu Thr His Gly Met

405 410 415

Val Pro Met Asn Arg Leu Thr Asp Asp Pro Arg Trp Leu Pro Ala Met

420 425 430

Ser Glu Arg Val Thr Arg Met Val Gln Arg Asp Arg Asn His Pro Ser

435 440 445

Val Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Gly His Gly Ala Asn His

450 455 460

Asp Ala Leu Tyr Arg Trp Ile Lys Ser Val Asp Pro Ser Arg Pro Val

465 470 475 480

Gln Tyr Glu Gly Gly Gly Ala Asp Thr Thr Ala Thr Asp Ile Ile Cys

485 490 495

Pro Met Tyr Ala Arg Val Asp Glu Asp Gln Pro Phe Pro Ala Val Pro

500 505 510

Lys Trp Ser Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu Pro Gly Glu Thr Arg Pro

515 520 525

Leu Ile Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Leu Gly Gly

530 535 540

Phe Ala Lys Tyr Trp Gln Ala Phe Arg Gln Tyr Pro Arg Leu Gln Gly

545 550 555 560

Gly Phe Val Trp Asp Trp Val Asp Gln Ser Leu Ile Lys Tyr Asp Glu

565 570 575

Asn Gly Asn Pro Trp Ser Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp Thr Pro

580 585 590

Asn Asp Arg Gln Phe Cys Met Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr

595 600 605

Pro His Pro Ala Leu Thr Glu Ala Lys His Gln Gln Gln Phe Phe Gln

610 615 620

Phe Arg Leu Ser Gly Gln Thr Ile Glu Val Thr Ser Glu Tyr Leu Phe

625 630 635 640

Arg His Ser Asp Asn Glu Leu Leu His Trp Met Val Ala Leu Asp Gly

645 650 655

Lys Pro Leu Ala Ser Gly Glu Val Pro Leu Asp Val Ala Pro Gln Gly

660 665 670

Lys Gln Leu Ile Glu Leu Pro Glu Leu Pro Gln Pro Glu Ser Ala Gly

675 680 685

Gln Leu Trp Leu Thr Val Arg Val Val Gln Pro Asn Ala Thr Ala Trp

690 695 700

Ser Glu Ala Gly His Ile Ser Ala Trp Gln Gln Trp Arg Leu Ala Glu

705 710 715 720

Asn Leu Ser Val Thr Leu Pro Ala Ala Ser His Ala Ile Pro His Leu

725 730 735

Thr Thr Ser Glu Met Asp Phe Cys Ile Glu Leu Gly Asn Lys Arg Trp

740 745 750

Gln Phe Asn Arg Gln Ser Gly Phe Leu Ser Gln Met Trp Ile Gly Asp

755 760 765

Lys Lys Gln Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asp Gln Phe Thr Arg Ala Pro

770 775 780

Leu Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Ala Thr Arg Ile Asp Pro Asn

785 790 795 800

Ala Trp Val Glu Arg Trp Lys Ala Ala Gly His Tyr Gln Ala Glu Ala

805 810 815

Ala Leu Leu Gln Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ala Asp Ala Val Leu Ile

820 825 830

Thr Thr Ala His Ala Trp Gln His Gln Gly Lys Thr Leu Phe Ile Ser

835 840 845

Arg Lys Thr Tyr Arg Ile Asp Gly Ser Gly Gln Met Ala Ile Thr Val

850 855 860

Asp Val Glu Val Ala Ser Asp Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu

865 870 875 880

Asn Cys Gln Leu Ala Gln Val Ala Glu Arg Val Asn Trp Leu Gly Leu

885 890 895

Gly Pro Gln Glu Asn Tyr Pro Asp Arg Leu Thr Ala Ala Cys Phe Asp

900 905 910

Arg Trp Asp Leu Pro Leu Ser Asp Met Tyr Thr Pro Tyr Val Phe Pro

915 920 925

Ser Glu Asn Gly Leu Arg Cys Gly Thr Arg Glu Leu Asn Tyr Gly Pro

930 935 940

His Gln Trp Arg Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg Tyr Ser Gln

945 950 955 960

Gln Gln Leu Met Glu Thr Ser His Arg His Leu Leu His Ala Glu Glu

965 970 975

Gly Thr Trp Leu Asn Ile Asp Gly Phe His Met Gly Ile Gly Gly Asp

980 985 990

Asp Ser Trp Ser Pro Ser Val Ser Ala Asp Phe Gln Leu Ser Ala Gly

995 1000 1005

Arg Tyr His Tyr Gln Leu Val Trp Cys Gln Lys

1010 1015

<210> 26

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素

<400> 26

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 27

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码绿色荧光蛋白的寡核苷酸

<400> 27

atgagtaaag gagaagaact tttcactggg attgtcccag ttctcattga gttagacggt 60

gatgtccatg gacataaatt ctctgtcaga ggagaagggg aaggcgatgc agattatgga 120

aaacttgaaa tcaaattcat ttgcactact ggaaagctac cagttccatg gccaacactt 180

gttactacac tgggctacgg catccaatgt ttcgcaagat acccagaaca catgaaaatg 240

aatgacttct tcaagagtgc catgcctgag ggttacattc aagaaagaac catctttttc 300

caagatgatg gaaaatacaa gacacgtggt gaagtcaagt ttgaaggtga tactcttgtt 360

aacagaattg agctcaaagg tatggacttt aaagaagatg gcaatatcct tggacacaag 420

ttggagtaca attttaattc acataatgta tacattatgc cggacaaagc caataatgga 480

ctcaaagtca atttcaaaat tagacacaat atcgaaggtg gtggtgtcca acttgctgat 540

cattaccaaa caaatgttcc ccttggagac ggtcctgtcc ttataccaat caatcactac 600

ctatccttgc aaacagccat ttcaaaagat cgaaatgaga cgagagatca tatggtgttt 660

ctggaatttt tctcagcttg tggacataca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 28

<211> 2861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码红色荧光蛋白的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(726)

<223> 红色荧光蛋白

<400> 28

ctcgaggatc ccgggtacct gcagctagcg tcgacagagg aattaaccat ggcctcctcc 60

gagaacgtca tcaccgagtt catgcgcttc aaggtgcgca tggagggcac cgtgaacggc 120

cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcca caacaccgtg 180

aagctgaagg tgaccaaggg cggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtccccccag 240

ttccagtacg gctccaaggt gtacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacaagaag 300

ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg 360

gcgaccgtga cccaggactc ctccctgcag gacggctgct tcatctacaa ggtgaagttc 420

atcggcgtga acttcccctc cgacggcccc gtgatgcaga agaagaccat gggctgggag 480

gcctccaccg agcgcctgta cccccgcgac ggcgtgctga agggcgagac ccacaaggcc 540

ctgaagctga aggacggcgg ccactacctg gtggagttca agtccatcta catggccaag 600

aagcccgtgc agctgcccgg ctactactac gtggacgcca agctggacat cacctcccac 660

aacgaggact acaccatcgt ggagcagtac gagcgcaccg agggccgcca ccacctgttc 720

ctgtaggcgg ccgctctaga ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 780

ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccgcc 840

ctagacctag gcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 900

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 960

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1020

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1080

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1140

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc 1200

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1260

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1320

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 1380

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 1440

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 1500

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 1560

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 1620

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga ctagtgcttg gattctcacc 1680

aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa tccagatgga gttctgaggt 1740

cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgta aacttggtct gacagttacc 1800

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 1860

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 1920

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 1980

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 2040

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2100

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 2160

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2220

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 2280

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 2340

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 2400

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 2460

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 2520

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 2580

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 2640

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 2700

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 2760

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 2820

cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca c 2861

<210> 29

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码橙色荧光蛋白的寡核苷酸

<400> 29

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgtccatg gacataaatt ctctgtcaga ggagaagggg aaggcgatgc agattatgga 120

aaacttgaaa tcaaattcat ttgcactact ggaaagctac cagttccatg gccaacactt 180

gttactacac tgggctatgg catcctatgt ttcgcaagat acccagaaca catgaaaatg 240

aatgacttct tcaagagtgc catgcctgag ggttacattc aagaaagaac catctttttc 300

caagatgatg gaaaatacaa gacacgtggt gaagtcaagt ttgaaggtga tactcttgtt 360

aacagaattg agctcaaagg tatggacttt aaagaagatg gcaatatcct tggacacaag 420

ttggagtaca attttaactc acataatgta tacattatgc cggacaaagc caataatgga 480

ctcaaagtca atttcaaaat tagacacaat atcgaaggtg gtggtgtcca actcgctgat 540

cattaccaaa caaatgttcc ccttggagac ggtcctgtcc ttataccaat caatcactac 600

ctatcctatc aaacagccat ttcaaaagat cgaaatgaga cgagagatca tatggtgttt 660

ctggaatttt tctcagcttg tggacataca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 30

<211> 7151

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码碱性磷酸酶的寡核苷酸

<400> 30

gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60

gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120

ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180

tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240

aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300

ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360

ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420

ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480

gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600

ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660

aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720

actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780

ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840

agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900

agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960

tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020

gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080

tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140

gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200

agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260

tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320

cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380

aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440

atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500

atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt tttcgccagg cgcagacttg ctgttcttca 1560

ggcaatcact catgtaggtc ttacgagcat cccctttcaa cgcctgcgcc gtcgcctgct 1620

gattacagga ggtcatacgc tgttgttgtg gggttaaagt tctctcggca gcgccgacgg 1680

tggttaaaaa aaccagaccg aaaagcaagg taaccagtaa tgttattttc atagcaccat 1740

ccctcttcat gttttaacca tgagcgtatg cgcccgtgat ctgccattaa gtctggttgc 1800

taacagcaaa aaaaccaccc ggcagcgaaa attcactgcc gggcgcggtt ttatttcagc 1860

cccagagcgg ctttcatggt gtagaagaga tcggtctggt cggtcagtcc aacaacattg 1920

gcggcatgcg ggccatacgc cgcaatacgc aactgactgc cggtatgttc ttgtgaatcc 1980

tcttcggagt tcccgtaact catcaccatc actgcgccat ctttggtatt tagcgcctgg 2040

gtgaggcccg gagctttggt atccggcgca acaatctggc tggcgtgggc gtgatcagcg 2100

gtgactatga ccagcgtgtt accctccttt ttagcgaatt ccagcgcccg ttgtacggct 2160

tcatcgagat cgaccgtctc gccaatttgc ccacaaggat tcgcagcatg atcctgttta 2220

tcgattgacg caccttcaac ttgcaggaaa aagcctttct catttttact caacaattca 2280

atggctttgt cggtcatctg cgccagggtt ggtacactgt cattacgttg cggatttggc 2340

gtacaggtga ctgcgggctt atcgatattg ccatggtacg ttgctttcgg tcctagccag 2400

cgcactggca tattgccgtc agcaaacagg ccaagcaggg gtttttgctg attcgcttcc 2460

gtcaccgaat tcagtgaggc agcatcgctc accaactgat aaccacgcgc ctgtgcctgt 2520

tcacgcagcg tttttccctg ccattcacca gcggttgccg tttcagcaaa ggtttttgcg 2580

ccgccgccaa gcgtaacgtc ggcacgagcg ttaagcagct gttcggtaat cgatcctttt 2640

ccgccttttt ccagagcgtt acccggacat ttttcactgg tcgcgctcgg accgtagcat 2700

ttgcgcgagg tcacatgtgc caccagcgca gcgggcgtgg catcctgcaa ctctgcggta 2760

gaaacgttac cggtcgccag acctgcggct tttgccattt ccagaatcgt tgggtgatct 2820

ttttcgtgaa tatcgacgcc cagcgcgccg ttataggttt tgacaccggt tgaccaggcg 2880

gttgctgatg cagccgagtc ggtgacgtag tccggtttgc cggttttttt attcagcgca 2940

tagtgagtgt attgcccggt aagcggtaag gcatctatac ctttaaaaaa gccgcccgca 3000

ccttcggcat aattacgtgc ggcagtaatt tccgagtccc ccatcccatc gccaatcagc 3060

aaaataatat tttttgcagg tttatcgcta agagaatcac gcagagcggc agtctgatca 3120

cccgttaaac ggcgagcacc gccgggtgca gtaatatcgc cctgagcagc ccggttttcc 3180

agaacctcga ggctagcatg catagaaccg ccaccaccgt cgacagcggt accctgcaga 3240

ggcatttctg gtgtccgggc ttttgtcaca ggggtaaaca gtaacggtaa gagtgccagt 3300

gcaatagtgc tttgtttcac tttattttct ccatgtcgcg tcttatcagg gggaattctg 3360

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca ttatacgagc cgatgattaa 3420

ttgtcaacag ctcatttcag aatatttgcc agaaccgtta tgatgtcggc gcaaaaaaca 3480

ttatctagag gggaattgtt atccgctcac aattccccta tagtgagtcg tattaatttc 3540

gcgggatcga gatctcgatc ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc accggcgcca 3600

caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc 3660

acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg 3720

gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg ctcaacggcc 3780

tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgagatc 3840

ccggacacca tcgaatggcg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag 3900

agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc 3960

ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa 4020

acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca 4080

caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg 4140

cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc 4200

gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat 4260

cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc 4320

attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag 4380

acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat 4440

ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg 4500

gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata 4560

gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg 4620

aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca 4680

atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac 4740

gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt 4800

cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg 4860

aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat 4920

acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 4980

tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtaagttagc tcactcatta 5040

ggcaccggga tctcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg 5100

ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt 5160

aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc 5220

gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt 5280

cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc 5340

ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc 5400

cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc 5460

caggcaggta gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag 5520

cctaacttcg atcactggac cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac 5580

atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt 5640

gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct 5700

aacggattca ccactccaag aattggagcc aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg 5760

caaaccaacc cttggcagaa catatccatc gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg 5820

cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg 5880

aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc accgatacgc 5940

gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg 6000

gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcccctac gtgctgctga 6060

agttgcccgc aacagagagt ggaaccaacc ggtgatacca cgatactatg actgagagtc 6120

aacgccatga gcggcctcat ttcttattct gagttacaac agtccgcacc gctgtccggt 6180

agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 6240

atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct 6300

gccaccatac ccacgccgaa acaagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca 6360

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctaaccgttt 6420

ttatcaggct ctgggaggca gaataaatga tcatatcgtc aattattacc tccacgggga 6480

gagcctgagc aaactggcct caggcatttg agaagcacac ggtcacactg cttccggtag 6540

tcaataaacc ggtaaaccag caatagacat aagcggctat ttaacgaccc tgccctgaac 6600

cgacgaccgg gtcgaatttg ctttcgaatt tctgccattc atccgcttat tatcacttat 6660

tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg 6720

ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 6780

tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 6840

taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 6900

tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 6960

cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 7020

agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 7080

tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 7140

attgccatac g 7151

<210> 31

<211> 955

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码辣根过氧化物酶的寡核苷酸

<400> 31

aagcttaacc atgcagttaa cccctacatt ctacgacaat agctgtccca acgtgtccaa 60

catcgttcgc gacacaatcg tcaacgagct cagatccgat cccaggatcg ctgcttcaat 120

attacgtctg cacttccatg actgcttcgt gaatggttgc gacgctagca tattactgga 180

caacaccacc agtttccgca ctgaaaagga tgcattcggg aacgctaaca gcgccagggg 240

ctttccagtg atcgatcgca tgaaggctgc cgttgagtca gcatgcccac gaacagtcag 300

ttgtgcagac ctgctgacta tagctgcgca acagagcgtg actcttgcag gcggaccgtc 360

ctggagagtg ccgctcggtc gacgtgactc cctacaggca ttcctagatc tggccaacgc 420

caacttgcct gctccattct tcaccctgcc ccagctgaag gatagcttta gaaacgtggg 480

tctgaatcgc tcgagtgacc ttgtggctct gtccggagga cacacatttg gaaagaacca 540

gtgtaggttc atcatggata ggctctacaa tttcagcaac actgggttac ctgaccccac 600

gctgaacact acgtatctcc agacactgag aggcttgtgc ccactgaatg gcaacctcag 660

tgcactagtg gactttgatc tgcggacccc aaccatcttc gataacaagt actatgtgaa 720

tctagaggag cagaaaggcc tgatacagag tgatcaagaa ctgtttagca gtccaaacgc 780

cactgacacc atcccactgg tgagaagttt tgctaactct actcaaacct tctttaacgc 840

cttcgtggaa gccatggacc gtatgggtaa cattacccct ctgacgggta cccaaggcca 900

gattcgtctg aactgcagag tggtcaacag caactcttaa taaggatccg aattc 955

<210> 32

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体SP-1A2重组单链Fv抗体mRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (790)..(807)

<223> 组氨酸标签

<400> 32

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatattggg acttataaaa ttgtctcctg gtaccaacag 120

caccctggca aagcccccaa actcatgatt tatgacgtca atcagcggcc ctcaggggtt 180

tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcggcag cactctggta 300

ttcggcgggg ggaccaagct gaccgtccta ggctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360

ggtggctctg gcggtagtgc acttcaggta cagctgcagc agtcaggagc agaggtgaaa 420

aagcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggttctg gatacagctt taccagctac 480

tggatcggct gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg agtggatggg gatcatctat 540

cctggtgact ctgataccag atacagcccg tccttccaag gccaggtcac catctcagcc 600

gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag tggagcagcc tgaaggcctc ggacaccgcc 660

atgtattact gtgcgagaca tcgggccgct agtgggagcc cggacgcgtg tgactactgg 720

ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gggagtgcat ccgccccaac ccttttcccc 780

gcggccgcac atcatcatca ccatcacggg gccgcagaac aaaaactcat ctcagaagag 840

gatctgaatg gggccgcata g 861

<210> 33

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体SP-1A2重组单链Fv抗体mRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (817)..(849)

<223> Myc标签

<400> 33

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatattggg acttataaaa ttgtctcctg gtaccaacag 120

caccctggca aagcccccaa actcatgatt tatgacgtca atcagcggcc ctcaggggtt 180

tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcggcag cactctggta 300

ttcggcgggg ggaccaagct gaccgtccta ggctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360

ggtggctctg gcggtagtgc acttcaggta cagctgcagc agtcaggagc agaggtgaaa 420

aagcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggttctg gatacagctt taccagctac 480

tggatcggct gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg agtggatggg gatcatctat 540

cctggtgact ctgataccag atacagcccg tccttccaag gccaggtcac catctcagcc 600

gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag tggagcagcc tgaaggcctc ggacaccgcc 660

atgtattact gtgcgagaca tcgggccgct agtgggagcc cggacgcgtg tgactactgg 720

ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gggagtgcat ccgccccaac ccttttcccc 780

gcggccgcac atcatcatca ccatcacggg gccgcagaac aaaaactcat ctcagaagag 840

gatctgaatg gggccgcata g 861

<210> 34

<211> 8388

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码β-半乳糖苷酶的寡核苷酸

<400> 34

acgttaaggg attttggtca tggacggcca gcaggtaggc cgacaggctc atgccggccg 60

ccgccgcctt ttcctcaatc gctcttcgtt cgtctggaag gcagtacacc ttgataggtg 120

ggctgccctt cctggttggc ttggtttcat cagccatccg cttgccctca tctgttacgc 180

cggcggtagc cggccagcct cgcagagcag gattcccgtt gagcaccgcc aggtgcgaat 240

aagggacagt gaagaaggaa cacccgctcg cgggtgggcc tacttcacct atcctgcccg 300

gctgacgccg ttggatacac caaggaaagt ctacacgaac cctttggcaa aatcctgtat 360

atcgtgcgaa aaaggatgga tataccgaaa aaatcgctat aatgaccccg aagcagggtt 420

atgcagcgga aaagcgctgc ttccctgctg ttttgtggaa tatctaccga ctggaaacag 480

gcaaatgcag gaaattactg aactgagggg acaggcgaga gacgatgcca aagagctaca 540

ccgacgagct ggccgagtgg gttgaatccc gcgcggccaa gaagcgccgg cgtgatgagg 600

ctgcggttgc gttcctggcg gtgagggcgg atgtcgatat gcgtaaggag aaaataccgc 660

atcaggcgca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa aagagtttgt agaaacgcaa 720

aaaggccatc cgtcaggatg gccttctgct taatttgatg cctggcagtt tatggcgggc 780

gtcctgcccg ccaccctccg ggccgttgct tcgcaacgtt caaatccgct cccggcggat 840

ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt 900

tcgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc tggcagttcc ctactctcgc atggggagac 960

cccacactac catcggcgct acggcgtttc acttctgagt tcggcatggg gtcaggtggg 1020

accaccgcgc tactgccgcc aggcaaattc tgttttatca gaccgcttct gcgttctgat 1080

ttaatctgta tcaggctgaa aattaaggaa tcccccagga cccaacgctg cccgagtttg 1140

tcagaaagca gaccaaacag cggttggaat aatagcgaga acagagaaat agcggcaaaa 1200

ataatacccg tatcactttt gctgatatgg ttgatgtcat gtagccaaat cgggaaaaac 1260

gggaagtagg ctcccatgat aaaaaagtaa aagaaaaaga ataaaccgaa catccaaaag 1320

tttgtgtttt ttaaatagta cataatggat ttccttacgc gaaatacggg cagacatggc 1380

ctgcccggtt attattattt ttgacaccag accaactggt aatggtagcg accggcgctc 1440

agctggaaat ccgccgatac tgacgggctc caggagtcgt cgccaccaat ccccatatgg 1500

aaaccgtcga tattcagcca tgtgccttct tccgcgtgca gcagatggcg atggctggtt 1560

tccatcagtt gctgttgact gtagcggctg atgttgaact ggaagtcgcc gcgccactgg 1620

tgtgggccat aattcaattc gcgcgtcccg cagcgcagac cgttttcgct cgggaagacg 1680

tacggggtat acatgtctga caatggcaga tcccagcggt caaaacaggc ggcagtaagg 1740

cggtcgggat agttttcttg cggccctaat ccgagccagt ttacccgctc tgctacctgc 1800

gccagctggc agttcaggcc aatccgcgcc ggatgcggtg tatcgctcgc cacttcaaca 1860

tcaacggtaa tcgccatttg accactacca tcaatccggt aggttttccg gctgataaat 1920

aaggttttcc cctgatgctg ccacgcgtga gcggtcgtaa tcagcaccgc atcagcaagt 1980

gtatctgccg tgcactgcaa caacgctgct tcggcctggt aatggcccgc cgccttccag 2040

cgttcgaccc aggcgttagg gtcaatgcgg gtcgcttcac ttacgccaat gtcgttatcc 2100

agcggtgcac gggtgaactg atcgcgcagc ggcgtcagca gttgtttttt atcgccaatc 2160

cacatctgtg aaagaaagcc tgactggcgg ttaaattgcc aacgcttatt acccagctcg 2220

atgcaaaaat ccatttcgct ggtggtcaga tgcgggatgg cgtgggacgc ggcggggagc 2280

gtcacactga ggttttccgc cagacgccac tgctgccagg cgctgatgtg cccggcttct 2340

gaccatgcgg tcgcgttcgg ttgcactacg cgtactgtga gccagagttg cccggcgctc 2400

tccggctgcg gtagttcagg cagttcaatc aactgtttac cttgtggagc gacatccaga 2460

ggcacttcac cgcttgccag cggcttacca tccagcgcca ccatccagtg caggagctcg 2520

ttatcgctat gacggaacag gtattcgctg gtcacttcga tggtttgccc ggataaacgg 2580

aactggaaaa actgctgctg gtgttttgct tccgtcagcg ctggatgcgg cgtgcggtcg 2640

gcaaagacca gaccgttcat acagaactgg cgatcgttcg gcgtatcgcc aaaatcaccg 2700

ccgtaagccg accacgggtt gccgttttca tcatatttaa tcagcgactg atccacccag 2760

tcccagacga agccgccctg taaacgggga tactgacgaa acgcctgcca gtatttagcg 2820

aaaccgccaa gactgttacc catcgcgtgg gcgtattcgc aaaggatcag cgggcgcgtc 2880

tctccaggta gcgaaagcca ttttttgatg gaccatttcg gcacagccgg gaagggctgg 2940

tcttcatcca cgcgcgcgta catcgggcaa ataatatcgg tggccgtggt gtcggctccg 3000

ccgccttcat actgcaccgg gcgggaagga tcgacagatt tgatccagcg atacagcgcg 3060

tcgtgattag cgccgtggcc tgattcattc cccagcgacc agatgatcac actcgggtga 3120

ttacgatcgc gctgcaccat tcgcgttacg cgttcgctca tcgccggtag ccagcgcgga 3180

tcatcggtca gacgattcat tggcaccatg ccgtgggttt caatattggc ttcatccacc 3240

acatacaggc cgtagcggtc gcacagcgtg taccacagcg gatggttcgg ataatgcgaa 3300

cagcgcacgg cgttaaagtt gttctgcttc atcagcagga tatcctgcac catcgtctgc 3360

tcatccatga cctgaccatg cagaggatga tgctcgtgac ggttaacgcc tcgaatcagc 3420

aacggcttgc cgttcagcag cagcagacca ttttcaatcc gcacctcgcg gaaaccgaca 3480

tcgcaggctt ctgcttcaat cagcgtgccg tcggcggtgt gcagttcaac caccgcacga 3540

tagagattcg ggatttcggc gctccacagt ttcgggtttt cgacgttcag acgtagtgtg 3600

acgcgatcgg cataaccacc acgctcatcg ataatttcac cgccgaaagg cgcggtgccg 3660

ctggcgacct gcgtttcacc ctgccataaa gaaactgtta cccgtaggta gtcacgcaac 3720

tcgccgcaca tctgaacttc agcctccagt acagcgcggc tgaaatcatc attaaagcga 3780

gtggcaacat ggaaatcgct gatttgtgta gtcggtttat gcagcaacga gacgtcacgg 3840

aaaatgccgc tcatccgcca catatcctga tcttccagat aactgccgtc actccaacgc 3900

agcaccatca ccgcgaggcg gttttctccg gcgcgtaaaa atgcgctcag gtcaaattca 3960

gacggcaaac gactgtcctg gccgtaaccg acccagcgcc cgttgcacca cagatgaaac 4020

gccgagttaa cgccatcaaa aataattcgc gtctggcctt cctgtagcca gctttcatca 4080

acattaaatg tgagcgagta acaacccgtc ggattctccg tgggaacaaa cggcggattg 4140

accgtaatgg gataggttac gttggtgtag atgggcgcat cgtaaccgtg catctgccag 4200

tttgagggga cgacgacagt atcggcctca ggaagatcgc actccagcca gctttccggc 4260

accgcttctg gtgccggaaa ccaggcaaag cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt 4320

tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 4380

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 4440

acgggatcag ccattttttt ctccttactt acttaggatc cccgggtacc gagctcgaat 4500

tggggatctt gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcag 4560

agcgcttttg aagctaattc gagctcggta cccggggatc ccccgggctc gactgcatta 4620

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgctcgaat 4680

tgacataagc ctgttcggtt cgtaaactgt aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact 4740

ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt 4800

gttatgactg tttttttgta ctcgagcaga aagtcaaaag cctccgaccg gaggcttttg 4860

acttgagggg gatcgatccc ttatggctct gcacccggct ccatcaccaa caggtcgcgc 4920

acgcgcttca ctcggttgcg gatcgacact gccagcccaa caaagccggt tgccgccgcc 4980

gccaggatcg cgccgatgat gccggccaca ccggccatcg cccaccaggt cgccgccttc 5040

cggttccatt cctgctggta ctgcttcgca atgctggacc tcggctcacc ataggctgac 5100

cgctcgatgg cgtatgccgc ttctcccctt ggcgtaaaac ccagcgccgc aggcggcatt 5160

gccatgctgc ccgccgcttt cccgaccacg acgcgcgcac caggcttgcg gtccagacct 5220

tcggccacgg cgagctgcgc aaggacataa tcagccgccg acttggctcc acgcgcctcg 5280

atcagctctt gcactcgcgc gaaatccttg gcctccacgg ccgccatgaa tcgcgcacgc 5340

ggcgaaggct ccgcagggcc ggcgtcgtga tcgccgccga gaatgccctt caccaagttc 5400

gacgacacga aaatcatgct gacggctatc accatcatgc agacggatcg cacgaacccg 5460

cagaactcac ccccgaacac gagcacggca cccgcgacca ctatgccaag aatgcccaag 5520

gtaaaaattg ccggccccgc catgaagtcc gtgaatgccc cgacggccga agtgaagggc 5580

aggccgccac ccaggccgcc gccctcactg cccggcacct ggtcgctgaa tgtcgatgcc 5640

agcacctgcg gcacgtcaat gcttccgggc gtcgcgctcg ggctgatcgc ccatcccgtt 5700

actgccccga tcccggcaat ggcaaggact gccagcgccg cgatgaggaa gcgggtgccc 5760

cgcttcttca tcttcgcgcc tcgggcctcc aggccgccta cctgggcgaa aacatcggtg 5820

tttgtggcat tcatacggac tcctgttggg ccagctcgcg cacgggctgg cgggtcagct 5880

tggcttgaag atcgccacgc attgcggcga tctgcttctc ggcatccttg cgcttctgca 5940

cgccttcctg ctggatgcga ataacgtcct cgacggtctt gatgagcgtc gtctgaacct 6000

gcttgagcgt gtccacgtcg atcaccaggc gttggttctc cttcgccgtc tcgacggacg 6060

tgcgatgcag cagggccgca ttgcgcttca tcaggtcgtt ggtggtgtcg tcgatggccg 6120

tggccagttc gacggcgttc ttctgctcgt tgaggctcaa ggccagcatg aattgccgct 6180

tccacgccgg cacggtgatt tcgcggatgg tgtggaattt atcgaccagc atctggttgt 6240

tggcctggat catgcggatg gtcggcaggc tctgcatggc cgaatgttgc aaggcgatca 6300

ggtcgccgat gcgcttgtcc aggttggcaa ccatcgcatc gaggtcggcc agctcctgca 6360

cgcggccagg gtcgttcccg acattgccgc gcagaccctc ggcctgctcg cgcagctcgg 6420

caaggcggac cttgccggcc gcgatgtgga cgccaagaag gcggtgttcc tcgcgcacgg 6480

ctgcgaacat ttcgtcgagc gaggcattgc gctgcgcgat gccttgctgg gtggtctgca 6540

cttcgctgac caggtgttcg atctgctcgc gggtcgtgtc gaagcgcgcc atgaagcccg 6600

tcgaacggac gcggaagcgg tcgatcagcg ggccaatcag gggcaggcgg gaacggttgt 6660

cggacaaagg gccgacgttc agggaacggg ccttggcgac aacctgggtc agtttctcgc 6720

ctgcttcgtc caggtcgctg ttgcgcacct ggtccagcag gctatcggcg tagcgggacg 6780

tgtgctcggc cacgtcgcgg ccgaactcgg caacggtctg cggactgccg acctcgatcc 6840

gctgcgcgac cgcatggact tccggcacgt cgctttcctg caagcccagc tcgcgcaggg 6900

ttgccggggt catgtcgaag gcgacgatag gggccttggc gtcgtgcgtc gttttcagtg 6960

cgttcatagg gttctcccgc cgtgttattg gttgatgcct tccaggctct gcgaaaggct 7020

ccgcatgagc gcctggtgag ctttggccgc ctcggcgacc attgccggat tcatgttctt 7080

ggtggtgatg agcgcgaggg tgtgctgacg ccagacgggc accaggacgg atgccgtttc 7140

agagaagcgg tccagcatgt ccacggcctg cgcccgcgtg agcttcatct gagtgacgct 7200

catttcatgg gacgccatga gggttgccag gttggcgagc ttgcgcgcga agcgttcgcg 7260

cggcttgtcg aactcgatca cgccggcctt ggccgcgccg gcctcggggt tctcgtccag 7320

gaactcgcgc ccggcttgaa tgtaggctct gagccggtct acctcggcct catgcgtatt 7380

gagcatgtca tccaaggcgc gcaacgtgtc ccgcacgcgc tgcgctacgc cctcggcttc 7440

gtccagcaac tggtcgagcg tcttgcgggc gacctgatac ctcacctggc gttcaacctc 7500

acggccaagc atcttctcga accaggtagg cttttccgcg atcttgcggg ggtccgcgtc 7560

ggccagcttc gccacgatct ggctgatttt gtcggccagc gcggcaactg cgccgtgctc 7620

catcagattc gacagctcgt tgagggaatc cgccccgtcg atgccggccc cgtactcgcc 7680

aatcgtcgcc ggcgacgcga agagggcggg caaaacctcc cccttcaatc gcgccatgtt 7740

cacgctttgt tcttccatgg tatatctcct tcttaaagtt aaacaaaatt attcggaacc 7800

cagcatgata ttccggaaat accaactaag tcaacggctg atggccaatt cggcttcctc 7860

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 7920

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagatcg 7980

atcagcagtt caacctgttg atagtacgta ctaagctctc atgtttcacg tactaagctc 8040

tcatgtttaa cgtactaagc tctcatgttt aacgaactaa accctcatgg ctaacgtact 8100

aagctctcat ggctaacgta ctaagctctc atgtttcacg tactaagctc tcatgtttga 8160

acaataaaat taatataaat cagcaactta aatagcctct aaggttttaa gttttataag 8220

aaaaaaaaga atatataagg cttttaaagc tagcttttaa ggtttaacgg ttgtggacaa 8280

caagccaggg atgtaacgca ctgagaagcc cttagagcct ctcaaagcaa ttttcagtga 8340

cacaggaaca cttaacggct gacatgacgc tcagtggaac gaaaactc 8388

<210> 35

<211> 483

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码链霉亲和素的寡核苷酸

<400> 35

gacccgagca aagattctaa agcacaagta tctgctgcag aagcaggaat tacaggcaca 60

tggtataatc agctgggatc tacatttatt gttacagccg gcgcagatgg agctcttaca 120

ggaacatatg aatctgctgt tggaaatgca gaatctagat acgtgcttac aggaagatat 180

gattctgcac ctgcaacaga tggatccgga acagcacttg gatggacagt tgcatggaaa 240

aacaattata gaaacgcaca tagcgctaca acatggtctg gccaatatgt gggaggtgca 300

gaagcaagaa ttaacacaca atggctttta acatctggaa caacagaagc aaatgcatgg 360

aaaagtactc ttgttggaca tgatacattt acaaaagtta aacctagcgc agcatctatc 420

gatgcagcga aaaaagcagg agttaacaat ggcaatcctt tagatgcagt tcaacaataa 480

tga 483

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码费氏弧菌lux框的寡核苷酸

<400> 36

acctgtacga tcctacaggt 20

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码根瘤农杆菌tra框的寡核苷酸

<400> 37

acgtgcagat ctgcacat 18

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码铜绿假单胞菌rhl框的寡核苷酸

<400> 38

ctgccagatt tcacagga 18

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Qsc102

<400> 39

acctgcccgg aagggcaggt 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Qsc117

<400> 40

cactgccaga tctggcagtt 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> phzA

<400> 41

acctaccaga tcttgtagtt 20

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码伯克霍尔德氏菌cep框的寡核苷酸

<400> 42

ctgtaagagt taccagtt 18

<210> 43

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码费氏弧菌lux框的寡核苷酸 Lux框 + 启动子

<400> 43

acctgtagga tcgtacaggt ttacgcaaga aaatggtttg ttatagtcga ataaacgcaa 60

gggaggttgg t 71

<210> 44

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Amcyan

<400> 44

Met Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ile Gly Asp Asp Met Lys Met Thr Tyr

1 5 10 15

His Met Asp Gly Cys Val Asn Gly His Tyr Phe Thr Val Lys Gly Glu

20 25 30

Gly Ser Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ser Thr Phe Lys Val

35 40 45

Thr Met Ala Asn Gly Gly Pro Leu Ala Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser

50 55 60

Thr Val Phe Met Tyr Gly Asn Arg Cys Phe Thr Ala Tyr Pro Thr Ser

65 70 75 80

Met Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly Met Ser Tyr Glu

85 90 95

Arg Thr Phe Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Ala Ser Trp Glu

100 105 110

Ile Ser Leu Lys Gly Asn Cys Phe Glu His Lys Ser Thr Phe His Gly

115 120 125

Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Ala Lys Met Thr Thr Gly

130 135 140

Trp Asp Pro Ser Phe Glu Lys Met Thr Val Cys Asp Gly Ile Leu Lys

145 150 155 160

Gly Asp Val Thr Ala Phe Leu Met Leu Gln Gly Gly Gly Asn Tyr Arg

165 170 175

Cys Gln Phe His Thr Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Pro Val Thr Met Pro

180 185 190

Pro Asn His Ala Val Glu His Arg Ile Ala Arg Thr Asp Leu Asp Lys

195 200 205

Gly Gly Asn Ser Val Gln Leu Thr Glu His Ala Val Ala His Ile Thr

210 215 220

Ser Val Val Pro Phe

225

<210> 45

<211> 2875

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 报告基因融合载体 pFU81

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(739)

<223> Amcyan

<400> 45

ctcgaggatc ccgggtacct gcagctagcg tcgacaggag gaattaacca tggctctttc 60

aaacaagttt atcggagatg acatgaaaat gacctaccat atggatggct gtgtcaatgg 120

gcattacttt accgtcaaag gtgaaggcag cgggaagcca tacgaaggga cgcagacctc 180

gacttttaaa gtcaccatgg ccaacggtgg gccccttgca ttctcctttg acatactatc 240

tacagtgttc atgtatggaa atcgatgctt tactgcgtat cctaccagta tgcccgacta 300

tttcaaacaa gcatttcctg acggaatgtc atatgaaagg acttttacct atgaagatgg 360

aggagttgct acagccagtt gggaaataag ccttaaaggc aactgctttg agcacaaatc 420

cacgtttcat ggagtgaact ttcctgctga tggacctgtg atggcgaaga tgacaactgg 480

ttgggaccca tcttttgaga aaatgactgt ctgcgatgga atattgaagg gtgatgtcac 540

cgcgttcctc atgctgcaag gaggtggcaa ttacagatgc caattccaca cttcttacaa 600

gacaaaaaaa ccggtgacga tgccaccaaa ccatgcggtg gaacatcgca ttgcgaggac 660

cgaccttgac aaaggtggca acagtgttca gctgacggag cacgctgttg cacatataac 720

ctctgttgtc cctttctgaa gcggccgctc tagaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 780

tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg 840

acaaatccgc cgccctagac ctaggcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 900

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 960

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 1020

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 1080

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 1140

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 1200

ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 1260

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 1320

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 1380

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 1440

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 1500

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 1560

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 1620

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgactagtg 1680

cttggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga gcgttctgaa caaatccaga 1740

tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc caagcgagct cgtaaacttg 1800

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 1860

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 1920

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 1980

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 2040

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 2100

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 2160

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 2220

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 2280

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 2340

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 2400

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 2460

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 2520

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 2580

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 2640

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 2700

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 2760

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat 2820

tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcac 2875

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码铜绿假单胞菌las框的寡核苷酸

<400> 46

atctatctca tttgctagtt 20

Claims (38)

1.一种装置，其包括含有多核苷酸的报道细胞，所述多核苷酸包含编码能够产生可检测信号的报道分子的第一核酸序列和包含用于调节所述报道分子的转录的luxR样受体结合元件的第二核酸序列，其中所述报道细胞附接至固体支持物或包封于附接至固体支持物的包封基质内。

2.权利要求1的装置，其中所述细胞还包含编码能够结合2AA的luxR样受体的第三核酸序列。

3.权利要求2的装置，其中所述多核苷酸包含所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和所述第三核酸序列。

4.权利要求2的装置，其中所述第三核酸序列被包含在不同于所述多核苷酸的多核苷酸上。

5.权利要求2的装置，其中所述luxR样受体对于所述细胞是外来的。

6.权利要求2-5中任一项的装置，其中所述luxR样受体选自弧菌LuxR样受体、果胶杆菌LuxR样受体、伯克霍尔德氏菌LuxR样受体、沙雷氏菌LuxR样受体、假单胞菌LuxR样受体、色杆菌LuxR样受体和盐单胞菌LuxR样受体。

7.权利要求2-6中任一项的装置，其中所述细胞缺乏内源性luxR样表达。

8.权利要求2-7中任一项的装置，其中所述细胞缺乏内源性luxR样激动剂和/或拮抗剂。

9.权利要求8的装置，其中所述细胞缺乏luxI表达。

10.权利要求1-9中任一项的装置，其中所述可检测信号选自光信号、化学信号和电化学信号。

11.权利要求1-9中任一项的装置，其中所述可检测信号是生物发光。

12.权利要求1-11中任一项的装置，其中所述报道分子是报道多肽。

13.权利要求12的装置，其中所述报道多肽是荧光素酶。

14.权利要求13的装置，其中所述第一核酸序列包含luxCDABE基因簇。

15.权利要求1-14中任一项的装置，其中所述报道细胞选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、藻类细胞和动物细胞。

16.权利要求10的装置，其中所述报道细胞是细菌细胞。

17.权利要求16的装置，其中所述细菌细胞选自埃希氏菌属、假单胞菌属、弧菌属、葡萄球菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属、聚球蓝细菌属、嗜水气单胞菌和青枯菌属。

18.权利要求16的装置，其中所述报道细胞是大肠杆菌。

19.权利要求1-18中任一项的装置，其中所述报道细胞位于包封基质内。

20.权利要求1-18中任一项的装置，其中所述报道细胞固定在固体支持物上。

21.权利要求1-20中任一项的装置，其中所述报道细胞被定位成接触挥发性样品。

22.检测生物样品中2AA或其衍生物的方法，其包括使所述样品与权利要求2-21中任一项的装置接触，其中所述可检测信号的存在指示所述生物样品中的2-AA。

23.诊断个体中铜绿假单胞菌感染的方法，其包括使所述个体的生物样品与权利要求2-21中任一项的装置接触，其中检测到高于预定水平的所述信号表明所述样品中存在铜绿假单胞菌感染。

24.检测测试样品中存在产生2-AA的生物体的方法，其包括使包含所述生物体的所述样品与权利要求2-21中任一项的装置接触，其中所述可检测信号的存在表明所述测试样品中存在产生2-AA的生物体。

25.权利要求22-24中任一项的方法，其还包括用2 AA标准样品校准所述装置，以便将2AA的量或浓度分配给可检测信号的值。

26.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述接触是经由流体连通。

27.权利要求22-25中任一项的方法，其中所述接触是经由气体连通。

28.权利要求22-27中任一项的方法，其中所述生物样品选自细菌培养物、细菌培养液、呼吸空气、汗液、唾液、痰液、血液、血浆、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、脑脊液、脑膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、***、脓液、***物、呕吐物、眼泪、组织活检样品、细胞培养物、环境空气、获得自伤口或烧伤的组织样品、获得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、***、伤口、烧伤或疑似具有感染的任何其它组织的拭子、痰和粘液。

29.权利要求22-27中任一项的方法，其中所述生物样品是气体样品。

30.权利要求29的方法，其中所述气体样品是收集自选自以下来源的顶部空间气体：动物或人患者的呼吸空气、汗液、唾液、痰液、血液、血浆、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、脑脊液、脑膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、***、脓液、***物、呕吐物、眼泪、组织活检样品、细胞培养物、环境空气、获得自伤口或烧伤的组织样品、获得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、***、伤口、烧伤或疑似具有感染的任何其它组织的拭子、痰、粘液、渗出物或呼气。

31.权利要求29的方法，其中所述气体样品包括疑似细菌种群的顶部空间气体。

32.权利要求31的方法，其中所述疑似细菌种群是疑似细菌感染。

33.权利要求24的方法，其中所述产生2-AA的生物体是铜绿假单胞菌。

34.权利要求33的方法，其中检测到的所述2AA的所述量或模式指示铜绿假单胞菌感染。

35.权利要求23的方法，其中所述个体疑似患有中耳炎，而所述生物样品是耳部渗出物、从耳部渗出物收集的顶部空间气体或从患耳收集的顶部空间气体的样品。

36.用于检测个体中铜绿假单胞菌感染的***，所述***包括权利要求2-21中任一项的装置和用于检测所述可检测信号的传感器。

37.权利要求36的***，其还包括用于显示所述可检测信号的检测事件的显示器。

38.权利要求36的***，其还包括与所述报道细胞呈液体或气体连通的样品架，用于支托来自所述个体的生物样品用于检测。