CN112313337A - 选择和监测治疗功效的指示物噬菌体及其使用方法 - Google Patents

选择和监测治疗功效的指示物噬菌体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于检测样品中的微生物的方法和***以及此类方法用于选择和监测疗法的应用。指示物噬菌体例如葡萄球菌属(Staphylococcus)特异性噬菌体的特异性允许检测特定微生物，例如葡萄球菌属，并且可以放大指示物信号以优化测定法灵敏度。

Description

选择和监测治疗功效的指示物噬菌体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月24日提交的美国临时申请号62/661,739的优先权。美国申请号13/773,339、14/625,481、15/263,619和15/409,258以及美国临时申请62/661,739的公开内容在此通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于使用感染原检测微生物的组合物、方法、***和试剂盒。
背景技术
对改善生物、食品、水和临床样品中的细菌、病毒和其他微生物的检测速度和灵敏度有强烈兴趣。微生物病原体可导致人类和家畜的大量发病，以及巨大的经济损失。此外，鉴于食用被某些微生物(例如，葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.))污染的食物而引起的危及生命或致命的疾病的爆发，对于食品和药物管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)而言，微生物的检测是高优先级的。
用于检测细菌的传统微生物测试依赖于非选择性和选择性富集培养物，随后在选择性培养基上铺板并进一步测试以确认可疑菌落。这样的程序可能需要几天。已经研究了多种快速方法并将其引入实践以减少时间要求。但是，这些方法具有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链反应(PCR)测试还包括扩增步骤，并因此能够具有很高的灵敏度和选择性；但是，可以经济地进行PCR测试的样品大小是有限的。使用稀释的细菌悬浮液，大部分小的子样品将没有细胞并因此仍然需要纯化和/或冗长的富集步骤。
传统生物富集所需的时间由样品的靶细菌群体的生长速率、样品基质的作用和所需的灵敏度决定。在实践中，大多数高灵敏度方法利用过夜孵育，并且整个过程耗费约24小时。由于培养所需的时间，这些方法可耗费多达三天，取决于要鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水(或其他产品)可能已经进入牲畜或人类。此外，抗生素抗性细菌的增加和对生物防御的考虑使得全世界非常优先地考虑水、食品和临床样品中的细菌病原体的快速鉴定。
因此，需要更快速、简单和灵敏的检测和鉴定微生物，例如细菌、病毒和其他潜在致病的微生物。
发明内容
本发明的实施方案包括用于检测微生物的组合物、方法、***和试剂盒。本发明可以以多种方式实施。
在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含***到噬菌体基因组的晚期基因区域中的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的葡萄球菌属特异性噬菌体基因组。在一些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)特异性噬菌体基因组。在进一步的实施方案中，金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林(methicillin)金黄色葡萄球菌(MRSA)。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的噬菌体基因组。在一些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性感染葡萄球菌属。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌的存在下区分葡萄球菌属。
在重组指示物噬菌体的一些实施方案中，可以对指示基因进行密码子优化并且可以编码生成内在信号的可溶性蛋白质产物或与底物反应时生成信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还包括在密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，例如，Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者可以是遗传改造的基因，例如，NanoLuc。
本文还公开了用于制备重组指示物噬菌体的方法。一些实施方案包括选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将所述同源重组质粒/载体转化到靶病原菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而使所述质粒/载体和所述噬菌体基因组之间发生同源重组；并分离重组噬菌体的特定克隆。在一些实施方案中，选择的野生型噬菌体是葡萄球菌属特异性噬菌体或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体。在一些实施方案中，选择的野生型噬菌体是T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1或具有与以上公开的噬菌体99、98、97、96、95、94、93、92、91 90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或70％同源性的基因组的另一种天然存在的噬菌体。
在一些实施方案中，制备同源重组质粒/载体包括确定选择的噬菌体的基因组的晚期区域中的天然核苷酸序列；注释所述基因组并鉴定所述选择的噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计用于所述主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列，其中所述序列包含密码子优化的指示基因；和将设计用于同源重组的所述序列掺入质粒/载体中。设计序列的步骤可以包括在所述密码子优化的指示基因的上游***非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。因此，在一些方法中，同源重组质粒包含在密码子优化的指示基因上游的非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
本发明的一些实施方案是包含如本文所述的重组指示物噬菌体的组合物。例如，组合物可以包含一种或多种野生型或遗传修饰的感染原(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可以包含可以编码和表达相同或不同的指示蛋白的不同指示物噬菌体的混合物。
在一些实施方案中，本发明包括用于检测样品中的目标微生物的方法，其包括将样品与感染目标微生物的重组噬菌体孵育的步骤，其中重组噬菌体包含***到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物，并检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示目标微生物存在于样品中。
在用于制备重组指示物噬菌体的方法的一些实施方案中，野生型噬菌体是葡萄球菌属特异性噬菌体并且靶病原菌是葡萄球菌属。在一些实施方案中，分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明指示基因表达的克隆的有限稀释测定法。
本发明的其他方面包括用于检测样品中的细菌(例如，葡萄球菌属)的方法，其包括以下步骤：将所述样品与衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体的重组噬菌体孵育并检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测指示葡萄球菌属存在于所述样品中。在一些实施方案中，本发明包括使用衍生自金黄色葡萄球菌的重组噬菌体检测金黄色葡萄球菌的方法。样品可以是食品样品、环境样品、水样品、商业样品或临床样品。
在用于检测细菌的方法的一些实施方案中，首先将样品在有利于生长的条件下孵育18小时或更少、17小时或更少、16小时或更少、15小时或更少、14小时或更少、13小时或更少、12小时或更少、11小时或更少、10小时或更少、或9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少或2小时或更少的富集时间。在一些实施方案中，得到结果的总时间小于20小时、小于19小时、小于18小时、小于17小时、小于16小时、小于15小时、小于14小时、小于13小时、小于12小时、小于11小时、小于10小时、小于9小时、小于8小时、小于7小时或小于6小时。在一些实施方案中，通过检测所述指示物生成的信号背景比是至少2.0或至少2.5。在一些实施方案中，所述方法检测食品安全行业的标准尺寸的样品中的少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定细菌。
另外的实施方案包括用于检测葡萄球菌属的***和试剂盒，其中所述***或试剂盒包含衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。在一些实施方案中，***和试剂盒可以用于检测金黄色葡萄球菌，其中所述***或试剂盒包含衍生自金黄色葡萄球菌的重组噬菌体。在一些实施方案中，***和试剂盒可以用于检测MRSA。一些实施方案还包括用于与指示物反应以检测重组噬菌体表达的可溶性蛋白产物的底物。这些***或试剂盒可以包括针对本发明的噬菌体、组合物和方法描述的特征。在其他实施方案中，本发明包括与根据本发明的方法或***一起使用的非瞬态计算机可读介质。
在另一方面，本发明可以包括：一种用于选择用于受试者的治疗的方法，其包括：(i)从所述受试者获得生物样品；(ii)使用指示物噬菌体检测所述生物样品中的特定微生物或微生物类别；和(iii)基于在所述生物样品中检测到的特定微生物的鉴定来选择治疗。
在另一方面，本发明可以包括一种用于监测患有致病性医学病况的受试者的治疗功效的方法，其包括：(i)从所述受试者获得生物样品；(ii)使用指示物噬菌体检测所述生物样品中的特定微生物或微生物类别；(iii)开始用于所述受试者的治疗；(iv)从所述受试者获得与第一生物样品相同类型的第二生物样品；(v)使用所述指示物噬菌体检测所述第二生物样品中的所述特定微生物或微生物类别；和(vi)基于在所述第一生物样品和第二生物样品中检测到的量确定所述受试者中所述特定微生物或微生物类别的减少、增加或稳定水平。
附图说明
通过参考以下非限制性附图可以更好地理解本发明。
图1描绘了根据本发明实施方案的指示物噬菌体构建体，举例说明了包含萤火虫萤光素酶基因和T7晚期启动子的遗传构建体***噬菌体的晚期(III类)区域中。还描绘了在所有三个阅读框中包含防止通读的终止密码子和非翻译区(UTR)的序列。
图2显示了噬菌体SEA1的基因组，其是一种肌尾病毒(与T4噬菌体有关)，是从Francisco Diez-Gonzalez的实验室获得的并且与肌尾病毒沙门氏菌属(Salmonella)噬菌体S16共享～95％同源性。用于长尾丝(tail fiber)形成的基因57A分子伴侣位于晚期基因区域的***，该区域由编码病毒粒子蛋白的结构基因组成。因为这些病毒粒子蛋白以非常高的水平表达，只要使用晚期基因启动子和/或其他相似控制元件，就可以预期***到这个区域中的任何基因具有相似的表达水平。
图3显示了携带2种不同噬菌体的萤光素酶基因的两种同源重组质粒构建体，在***位点的上游和下游具有约500bp的匹配噬菌体序列以促进同源重组。将
Figure BDA0002740551510000061
萤光素酶***到具有上游非翻译区的pBAV1k-T5-GFP质粒骨架中，该上游非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。构建金黄色葡萄球菌噬菌体重组质粒以将
Figure BDA0002740551510000062
***晚期基因区域内，但由于稳定性问题而与主要衣壳蛋白(MCP)保持一定距离。
图4描绘了使用一系列按序感染和稀释步骤，使用如图3中所示的那些质粒构建体，从金黄色葡萄球菌噬菌体的修饰中分离重组噬菌体，以鉴定表达指示基因的重组噬菌体。
图5描绘了根据本发明的实施方案，使用编码可溶性萤光素酶的指示物噬菌体以通过检测细菌细胞感染期间从后代噬菌体复制生成的萤光素酶来检测细菌细胞。
图6描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测目标细菌的滤板测定法，其中在滤板上孵育细菌和重组噬菌体，并且在后代噬菌体生成后，直接检测指示蛋白而不除去孵育培养基。
图7描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测目标细菌的“无浓缩测定法”。
图8描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测目标细菌的HybridImmuno-Phage(HIP)测定法，其中在与具有指示基因的重组感染原孵育前，使用针对目标微生物的抗体将微生物捕获在测定孔的表面上。
发明详述
本文中公开的是证明了用于检测测试样品(例如，生物样品、食品样品、水样品和临床样品)中的目标微生物的令人惊讶的灵敏度的组合物、方法和***。在没有富集培养的情况下或在一些实施方案中在其中微生物可能潜在地繁殖的最小孵育时间下进行的测定中，可以使用遗传修饰的感染原，在短于之前认为可能的时间框架中实现检测。还令人惊讶的是使用潜在地高感染复数(MOI)或高浓度噬菌斑形成单位(PFU)用于与测试样品孵育的成功。这样的高噬菌体浓度(PFU/mL)先前被认为在细菌检测测定中是有害的，因为据说它们引起“自外裂解”。然而，高浓度的噬菌体有助于发现、结合和感染低数量的靶细胞。
本发明的组合物、方法、***和试剂盒可以包括用于检测此类微生物的感染原。在某些实施方案中，本发明可以包括组合物，所述组合物包含具有***到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因的重组噬菌体。在某些实施方案中，在感染宿主细菌后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生。在某些实施方案中，指示基因可以***噬菌体的晚期基因(即，ΠΙ类)区域中。噬菌体可以衍生自T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1或葡萄球菌属特异性噬菌体，或另一种野生型或改造的噬菌体。
在一些方面中，本发明包括用于检测目标微生物的方法。方法可以使用用于检测目标微生物的感染原。例如，在某些实施方案中，目标微生物是细菌并且感染原是噬菌体。因此，在某些实施方案中，所述方法可以包括通过将样品与感染目标微生物的重组噬菌体孵育来检测样品中的目标微生物。在某些实施方案中，重组噬菌体包含指示基因。在某些实施方案中，可以将指示基因***到噬菌体的晚期基因区域中，使得在感染宿主细菌后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生。所述方法可以包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示目标细菌存在于样品中。在一些实施方案中，指示蛋白是可溶性的。
在某些实施方案中，本发明可以包括***。***可以含有至少一些本发明的组合物。此外，***可以包括至少一些用于进行所述方法的组分。在某些实施方案中，将***配制成试剂盒。因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的***，其包括：用于将所述样品与对所述目标微生物具有特异性的感染原孵育的组分，其中所述感染原包含指示部分；和用于检测所述指示部分的组分。在又一其他实施方案中，本发明包括用于与方法或***一起使用的软件。
因此，本发明的一些实施方案通过使用基于噬菌体的方法解决了对放大指示细菌存在的可检测信号的需求。在某些实施方案中，检测少至单个细菌。本文应用的原理可以应用于检测各种微生物。由于微生物表面上的感染原的众多结合位点，在感染期间产生一百或更多个感染原后代的能力，和编码的指示部分的高水平表达的可能，感染原或指示部分可以比微生物本身更容易地检测到。以这种方式，本发明的实施方案可以从甚至单个感染的细菌实现巨大的信号放大。
本发明的各个方面利用可以结合特定微生物的结合剂(例如，感染原的结合组分)的高特异性，作为检测和/或定量样品中的特定微生物的手段。在一些实施方案中，本发明利用感染原(例如，噬菌体)的高特异性。
在一些实施方案中，通过与对目标微生物具有特异性的结合剂缔合的指示部分来实现检测。例如，感染原可以包含指示部分，例如编码可溶性指示物的基因。在一些实施方案中，指示物可以由感染原(例如，噬菌体)编码，并且该噬菌体被定名为指示物噬菌体。
本文中公开和描述的本发明的一些实施方案利用以下发现：单个微生物能够结合特定的识别剂，例如噬菌体。噬菌体感染和复制后，可以通过在噬菌体复制期间表达的指示部分检测后代噬菌体。该原理基于微生物表面受体的特异性识别，允许从一个或几个细胞放大指示物信号。例如，通过将甚至单个细菌细胞暴露于多个噬菌体，此后允许在复制期间噬菌体的扩增和所编码的指示基因产物的高水平表达，指示物信号放大使得可检测到单个细菌。
本发明的方法和***的实施方案可以应用于检测和定量各种环境中的各种微生物(例如，细菌、真菌、酵母菌)，包括但不限于检测来自食品样品、水样品、临床样品和商业样品的病原体。在一些实施方案中，可以分析临床样品中微生物的存在。本发明的方法可以快速地提供高检测灵敏度和特异性，并且不需要传统的生物学富集(例如，富集培养)，这是令人惊讶的方面，因为所有可利用的方法都需要培养。在一些实施方案中，在噬菌体的单个复制周期内检测是可能的，这是未预料到的。
定义
除非本文另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交相关的命名法和技术是本领域众所周知的和通常使用的那些。除非另外指出，否则通常根据本领域众所周知的常规方法并且按照在整个本说明书中讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行已知的方法和技术。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。与本文所述的实验室程序和技术结合使用的命名法是本领域众所周知的和常用的那些。
除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所使用的，除非另外特别指出，否则术语“一个”、“一种”和“该”可以指一个或多个/一种或多种。
除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是互斥的，否则术语“或”的使用是指“和/或”，尽管本公开内容支持仅指备选方案和“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一”可以表示至少第二或更多。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括设备、用于确定该值的方法的误差的固有变化或样品之间存在的变化。
术语“固体支持物”或“支持物”是指提供生物分子可结合在其上的基底和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，例如微量滴定板或多孔板)，或者固体支持物可以是在过滤器、阵列或移动性支持物(例如珠粒或膜(例如过滤板或侧流条))上的位置。
术语“结合剂”是指可以特异性和选择性结合第二(即，不同的)目标分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，作为氢键、范德华相互作用或者静电或疏水性相互作用的结果，或者它可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物缔合(即，共价或非共价地结合)的结合剂。
如本文所使用的“分析物”是指被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可以与结合剂相互作用。如本文中所述的，术语“分析物”可以指目标蛋白或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可以不具有生物学效应。分析物可以包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报道分子”或“指示物”或“指示部分”是指可以在定量测定法中测量的分子。例如，指示部分可以包含可用于将底物转化成可测量的产物的酶。指示部分可以是催化生成生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶)。或者，指示部分可以是可以被定量的放射性同位素。或者，指示部分可以是荧光团。或者，可以使用其他可检测分子。
如本文所使用的“细菌噬菌体”或“噬菌体”包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开内容中，术语“细菌噬菌体”和“噬菌体”包括病毒(例如分枝杆菌噬菌体(例如对于TB和paraTB)、真菌噬菌体(例如对于真菌)、支原体噬菌体)以及指可以侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母菌菌和其他微观活生物体并利用它们自我复制的病毒的任何其他术语。在此，“微观”是指最大尺寸为1毫米或更小。噬菌体是在自然界中进化以利用细菌作为自我复制的手段的病毒。细菌噬菌体通过使自身附着至细菌并将其DNA(或RNA)注入该细菌中并诱导其复制细菌噬菌体上百乃至上千次来进行这个过程。这被称为噬菌体扩增。
如本文所使用的“晚期基因区域”是指在病毒生命周期的晚期转录的病毒基因组的区域。晚期基因区域通常包括最大量表达的基因(例如，装配至噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因是同义的并且包括具有结构和装配功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中转录，例如，从感染后8分钟直到裂解，I类(例如，RNA聚合酶)是早期从4-8分钟，而II类是从6-15分钟，因此在II和III的时间上存在重叠。晚期启动子是天然位于这样的晚期基因区域中并且在其中有活性的启动子。
如本文所使用的“富集培养”是指传统培养，例如在有利于微生物繁殖的介质中孵育，并且不应与“富集”一词的其他可能用途(例如通过去除样品的液体组分以浓缩其中所含微生物的富集，或不包括传统促进微生物繁殖的其他富集形式)混淆。在本文描述的方法的一些实施方案中，可以采用非常短时间的富集培养，但其不是必要的并且如果使用的话与传统的富集培养相比其时间要短得多。
如本文所使用的，“重组”是指通常在实验室中进行的遗传(即，核酸)修饰，以将原本不会发现的遗传物质聚集在一起。该术语在本文中与术语“修饰的”互换使用。
如本文所使用的“RLU”是指通过光度计(例如，
Figure BDA0002740551510000111
96)或类似的检测光的仪器测量的相对光单位。例如，通常以检测到的RLU报告萤光素酶与适当底物之间(例如，
Figure BDA0002740551510000112
与
Figure BDA0002740551510000113
)的反应的检测。
如本文所使用的“得到结果的时间”是指从样品孵育开始到生成结果的时间总量。得到结果的时间不包括任何确认性的测试时间。生成结果后可以在任何时间进行数据收集。
样品
本发明的方法和***的各个实施方案可以允许快速检测和定量样品中的微生物。例如，根据本发明的方法可以在缩短的时间内进行并具有优良的结果。
通过本发明的方法和***检测的微生物包括自然、商业、医学或兽医学方面的病原体。这样的病原体包括革兰氏阴性细菌、***和支原体。可以通过本发明的方法检测对其已经鉴定出对特定微生物具有特异性的感染原所针对的任何微生物。本领域技术人员将理解，除了必要的特异性感染原/微生物对的可用性之外，本发明方法的应用没有限制。
通过本发明可检测的细菌细胞包括但不限于是食品或水传播的病原体的细菌细胞。通过本发明可检测的细菌细胞包括但不限于沙门氏菌属的所有物种，大肠杆菌(Escherichia coli)的所有菌株，克罗诺杆菌属(Cronobacter)，葡萄球菌属，李斯特氏菌属(Listeria)的所有物种，包括但不限于单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)，以及弯曲杆菌属(Campylobacter)的所有物种。通过本发明可检测的细菌细胞包括但不限于是具有医学或兽医学意义的病原体的细菌细胞。这样的病原体包括但不限于芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。在一些实施方案中，本发明可检测的细菌细胞包括抗生素抗性细菌(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))。
样品可以是环境或食品样品或水样品。一些实施方案可以包括医学或兽医学样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样品可以包括环境材料例如水样品，或来自空气样品的过滤器，或来自旋风收集器的气溶胶样品。样品可以是蔬菜、肉、鱼、家禽、花生酱、加工食品、婴儿配方粉、奶粉、茶、淀粉、蛋、奶、奶酪或其他乳制品。医学或兽医学样品包括但不限于血液、痰、脑髓液和粪便样品以及不同类型的拭子。
在一些实施方案中，样品可以不经制备、浓缩或稀释而直接用于本发明的检测方法。例如，可以直接测定液体样品，包括但不限于奶和汁液。样品可以稀释或悬浮在溶液中，该溶液可以包括但不限于缓冲液或细菌培养基。可以通过将固体切碎、混合或浸软在液体中来将固体或半固体样品悬浮在液体中。样品应当维持在促进噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH范围内。样品还应包含适当浓度的二价和一价阳离子，包括但不限于Na+，Mg2+和Ca2+。优选地，将样品维持在维持样品内包含的任何病原体细胞的活力的温度。
优选地，在检测测定中，将样品维持在维持样品中存在的任何病原体细胞的活力的温度。在其中噬菌体附着于细菌细胞的步骤中，优选将样品维持在有利于噬菌体附着的温度。在其中噬菌体在受感染的细菌细胞内复制或裂解这样的受感染的细胞的步骤中，优选将样品维持在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度。这样的温度是至少约25摄氏度(C)，更优选不高于约45摄氏度，最优选约37摄氏度。还优选样品在噬菌体附着、复制和细胞裂解期间经受轻柔混合或摇动。
测定可以包括各种合适的对照样品。例如，可以不含噬菌体的对照样品或含有噬菌体但不含细菌的对照样品测定为用于背景信号水平的对照。
指示物噬菌体
如本文中更详细描述的，本发明的组合物、方法、***和试剂盒可以包括用于检测病原性微生物中的感染原。在某些实施方案中，本发明包括重组指示物噬菌体，其中对噬菌体基因组进行遗传修饰以包含指示基因或报道基因。在一些实施方案中，本发明可以包括组合物，所述组合物包含具有***到噬菌体的基因组中的指示基因的重组噬菌体。
重组指示物噬菌体可以包括报道基因或指示基因。在感染原的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在感染宿主细菌后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，可以将指示基因***噬菌体的晚期基因区域中。晚期基因通常以比其他噬菌体基因更高的水平表达，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区域可以是III类基因区域并且可以包括主要衣壳蛋白的基因。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列。其他实施方案包括设计(和任选地制备)用于主要衣壳蛋白基因上游的同源重组的序列。在一些实施方案中，序列包含密码子优化的报道基因，其前是非翻译区。非翻译区可以包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
在一些实施方案中，指示物噬菌体衍生自T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1或葡萄球菌属特异性噬菌体，或者具有与T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1或葡萄球菌属特异性噬菌体至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的基因组的另一种噬菌体。在一些实施方案中，指示物噬菌体衍生自对特定病原微生物具有高度特异性的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失并因此与许多可商购获得的噬菌体相比，修饰的噬菌体可以与野生型感染原保持更相似。环境衍生的噬菌体可能对环境中发现的细菌更具特异性并因此在遗传上不同于可商购获得的噬菌体。
此外，被认为是非必需的噬菌体基因可能具有未被识别的功能。例如，明显非必需的基因可能在升高裂解量中具有重要功能，例如在装配中具有精细切割、拟合或修整功能。因此，缺失基因以***指示物可能是有害的。大部分噬菌体可以包装比其天然基因组大几个百分比的DNA。考虑到这一点，较小的指示基因可能是修饰噬菌体尤其是具有较小基因组的噬菌体的更合适的选择。OpLuc和
Figure BDA0002740551510000141
蛋白仅为约20kDa(编码约500-600bp)，而FLuc为约62kDa(编码约1,700bp)。为了比较，T7的基因组为约40kbp，而T4基因组为约170kbp，并且葡萄球菌属特异性噬菌体的基因组为约157kbp。此外，报道基因不应由细菌内源地表达(即，不是细菌基因组的部分)，应生成高的信号背景比，并且应易于及时检测。Promega的
Figure BDA0002740551510000142
是一种改良的Oplophorus gracilirostris(深海虾)萤光素酶。在一些实施方案中，与Promega的
Figure BDA0002740551510000143
(咪唑并吡嗪酮底物(furimazine))结合使用的
Figure BDA0002740551510000144
可以提供低背景的稳健信号。
在一些指示物噬菌体实施方案中，可以将指示基因***非翻译区以避免功能基因的破坏，使野生型噬菌体基因保持完整，这可以在感染非实验室细菌菌株时导致更大的适应性。另外，在所有三个阅读框中都包含终止密码子可以通过减少通读(也称为漏表达)来帮助增加表达。该策略还可消除以低水平制备融合蛋白的可能性，其将表现为无法与噬菌体分开的背景信号(例如，萤光素酶)。
指示基因可以表达多种生物分子。指示基因是表达可检测产物或产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可以使用各种类型的萤光素酶。在备选实施方案中，并且如本文更详细描述的，萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶或改造的萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶基因源自Oplophorus。在一些实施方案中，指示基因是遗传修饰的萤光素酶基因，例如
Figure BDA0002740551510000151
因此，在一些实施方案中，本发明包括遗传修饰的噬菌体，其在晚期(III类)基因区域中包含非噬菌体指示基因。在一些实施方案中，非天然指示基因在晚期启动子的控制下。使用病毒晚期基因启动子确保报告基因(例如萤光素酶)不仅像病毒衣壳蛋白那样以高水平表达，而且不像内源细菌基因或甚至早期病毒基因那样被关闭。
在一些实施方案中，晚期启动子是T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1启动子，或类似于在选定的野生型噬菌体(即没有遗传修饰)中发现的另一种噬菌体启动子。晚期基因区域可以是III类基因区域，并且噬菌体可以衍生自T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、葡萄球菌属或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体，或者与T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、葡萄球菌属或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体具有至少70、75、80、85、90或95％同源性的基因组的另一种天然噬菌体。
对感染原的遗传修饰可以包括核酸的小片段、基因的实质部分或整个基因的***、缺失或置换。在一些实施方案中，***或置换的核酸包含非天然序列。可以将非天然指示基因***噬菌体基因组中，使其处于噬菌体启动子的控制之下。在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。即，在一些实施方案中，可以配置遗传修饰，使得指示蛋白质产物不包含野生型噬菌体的多肽。在一些实施方案中，指示蛋白质产物是可溶的。在一些实施方案中，本发明包括用于检测感兴趣的细菌的方法，其包括将测试样品与这种重组噬菌体一起孵育的步骤。
在一些实施方案中，在感染宿主细菌后指示基因在后代噬菌体中的表达产生游离的可溶性蛋白质产物。在一些实施方案中，非天然指示基因不与编码结构噬菌体蛋白的基因邻接，并因此不产生融合蛋白。与采用检测部分与衣壳蛋白的融合(即融合蛋白)的***不同，本发明的一些实施方案表达可溶性指示或报告分子(例如，可溶性萤光素酶)。在一些实施方案中，指示或报告分子理想地不含噬菌体结构。即，指示或报告分子未附着于噬菌体结构。因此，指示或报告基因不与重组噬菌体基因组中的其他基因融合。对于一些实施方案，这可以极大地增加测定的灵敏度(低至单个细菌)，并简化测定，从而允许在不到一个小时内完成测定，而不是由于产生可检测的融合蛋白的构建体需要额外的纯化步骤而需要数小时。此外，由于例如可能改变酶活性位点的构象或接近底物的蛋白质折叠限制，融合蛋白的活性可能低于可溶性蛋白。
此外，根据定义，融合蛋白限制了噬菌体中与蛋白质亚基连接的部分的数量。例如，使用设计为用作融合蛋白平台的市售***将产生约415个拷贝的融合部分，对应于每个T7噬菌体颗粒中的基因10B衣壳蛋白的约415个拷贝。在没有这种限制的情况下，被感染的细菌可以预期表达出比可适装在噬菌体上的更多拷贝的检测部分(例如，萤光素酶)。另外，大的融合蛋白，例如衣壳-萤光素酶融合蛋白，可能会抑制噬菌体颗粒的组装，从而产生较少的噬菌体后代。因此，可溶性非融合指示基因产物可能是优选的。
在一些实施方案中，指示物噬菌体编码报告分子，例如可检测的酶。指示基因产物可以产生光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是可商购获得的，例如，碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
Figure BDA0002740551510000171
是指示部分。产生可检测信号的其他改造的萤光素酶或其他酶也可以是合适的指示部分。
在一些实施方案中，可溶性检测部分的使用消除了从感染的样品细胞的裂解物中去除污染的亲本噬菌体的需要。在使用融合蛋白***的情况下，用于感染样品细胞的任何噬菌体都将附着有检测部分，并且与也包含检测部分的后代噬菌体是无法区分的。由于样品细菌的检测依赖于新创建的(从头合成的)检测部分的检测，使用融合构建体需要额外的步骤以将新创建的(子代噬菌体)部分与旧的(亲本)部分分开。这可以通过在噬菌体生命周期完成之前多次洗涤被感染的细胞、通过物理或化学手段灭活感染后的过量的亲本噬菌体和/或用结合部分(例如生物素)化学修饰亲本噬菌体然后可以将其结合和分开(例如通过链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠)来完成。但是，即使进行了所有这些尝试，当使用高浓度的亲本噬菌体来确保感染少量样品细胞时，亲本噬菌体仍会保留，产生背景信号，其可能会掩盖来自受感染细胞后代噬菌体的信号的检测。
相反，在使用在本发明的一些实施方案中表达的可溶性检测部分的情况下，不需要从最终裂解物中纯化亲本噬菌体，因为亲本噬菌体不具有任何附着的检测部分。因此，感染后存在的任何检测部分必须是已经从头创建的，指示存在被感染的一个或多个细菌。为了利用该益处，亲本噬菌体的生产和制备可以包括从在细菌培养中亲本噬菌体生产期间中产生的任何游离检测部分纯化噬菌体。可以采用标准噬菌体纯化技术来纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案，例如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱法和透析或衍生技术(例如，Amicon品牌的浓缩器–Millipore，Inc.)。氯化铯等密度超速离心可以用作本发明的重组噬菌体制备的一部分，以将亲本噬菌体颗粒与噬菌体在细菌宿主中繁殖时产生的污染性萤光素酶蛋白分开。以这种方式，本发明的亲本重组噬菌体基本上不含在细菌中的生产期间产生的任何萤光素酶。当重组噬菌体与测试样品一起孵育时，去除噬菌体原液中存在的残留萤光素酶可以显著降低背景信号。
在修饰的噬菌体的一些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如，来自T7、T4或ViI)对相同噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力，所述噬菌体转录用于组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因。这些蛋白质是噬菌体产生的最丰富的蛋白质，因为每个噬菌体颗粒都包含数十或数百个拷贝的这些分子。病毒晚期启动子的使用可以确保萤光素酶检测部分的最佳高水平表达。使用来源于、特异于指示物噬菌体所来源于的原始野生型噬菌体或在该噬菌体下具有活性的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-、T7-或ViI-的***的T4、T7或ViI晚期启动子)可以进一步确保检测部分的最佳表达。在一些情况下，使用标准细菌(非病毒/非噬菌体)启动子可能不利于表达，因为这些启动子在噬菌体感染期间通常被下调(以使噬菌体优先利用细菌资源用于噬菌体蛋白产生)。因此，在一些实施方案中，优选使用在基因组中不将表达限制于噬菌体结构组分的亚基的数量的位置改造噬菌体以编码和以高水平表达可溶性(游离)指示部分。
本发明的组合物可以包含一种或多种野生型或遗传修饰的感染原(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可以包含可以编码和表达相同或不同的指示蛋白的不同指示物噬菌体的混合物。在一些实施方案中，噬菌体的混合物包含至少两种不同类型的重组噬菌体。
制备指示物噬菌体的方法
用于制备指示物噬菌体的方法的实施方案开始于选择用于遗传修饰的野生型噬菌体。一些噬菌体对靶细菌具有高度特异性。这为高特异性检测提供了机会。
因此，本发明的方法利用结合剂的高特异性，结合剂与感染剂缔合，识别并结合到特定的目标微生物上，以此作为放大信号的手段，并从而检测样品中存在的低水平微生物(例如，单个微生物)。例如，感染原(例如，噬菌体)特异性识别特定微生物的表面受体并因此特异性感染这些微生物。因此，这些感染原可以是用于靶向目标微生物的合适的结合剂。
可以使用各种感染原。在替代实施方案中，可以侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母菌和其他微观活生物体的噬菌体、细菌噬菌体、分枝杆菌噬菌体(例如对于TB和paraTB)、真菌噬菌体(例如对于真菌)、支原体噬菌体和任何其他病毒可以用于靶向目标微生物。例如，在一个实施方案中，其中目标微生物是细菌，感染原可包括噬菌体。例如，经充分研究的大肠杆菌的噬菌体包括T1、T2、T3、T4、T5、T7和λ；ATCC保藏中心中可用的其他大肠杆菌噬菌体，例如，包括phiX174、S13、Ox6、MS2、phiVl、fd、PR772和ZIK1。如本文所讨论，噬菌体可以在细菌内部复制以生成数百个后代噬菌体。***到噬菌体基因组中的指示基因的产物的检测可以用作样品中细菌的量度。
本发明的一些实施方案利用重组噬菌体的结合特异性和高水平的基因表达能力来快速和灵敏地靶向感染目标细菌并促进目标细菌的检测。在一些实施方案中，对葡萄球菌属或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体进行遗传修饰以包括报道基因。在一些实施方案中，对噬菌体的晚期基因区域进行遗传修饰以包括报道基因。在一些实施方案中，报道基因位于主要衣壳基因的下游。在其他实施方案中，报道基因位于主要衣壳基因的上游。
用于制备重组指示物噬菌体的方法的一些实施方案包括选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将所述同源重组质粒/载体转化到靶病原菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而使所述质粒/载体和所述噬菌体基因组之间发生同源重组；并分离重组噬菌体的特定克隆。
用于设计和制备同源重组质粒的各种方法是已知的。用质粒转化细菌的各种方法是已知的，包括热休克、F菌毛介导的细菌接合、电穿孔和其他方法。同源重组后分离特定克隆的各种方法也是已知的。本文描述的一些方法实施例利用特定策略。
因此，用于制备指示物噬菌体的方法的一些实施方案包括以下步骤：选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；确定选择的噬菌体的基因组的晚期区域中的天然序列；注释所述基因组并鉴定所述选择的噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计与主要衣壳蛋白基因相邻的用于同源重组的序列，其中序列包含密码子优化的报道基因；将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中；将质粒/载体转化到靶病原菌；选择转化的细菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的细菌，从而使所述质粒和所述噬菌体基因组之间发生同源重组；测定所得重组噬菌体裂解物的滴度；和进行有限稀释测定法以富集和分离重组噬菌体。一些实施方案包括根据需要在第一有限稀释测定法之后进一步重复有限稀释和滴定步骤，如需要直到重组噬菌体代表混合物的可检测级分。例如，在一些实施方案中，在分离重组噬菌体的特定克隆之前，可以重复有限稀释和滴定步骤，直到混合物中至少1/30的噬菌体是重组的。在一些实施方案中，预期重组:野生型的比例是1:30，每96个噬菌斑(例如，在96-孔平板中)产生平均3.2个转导单位(TU)。重组与野生型噬菌体的初始比例可以通过进行基于TCID50(组织培养感染剂量50％)的有限稀释测定法来确定，例如先前在美国专利申请号15/409,258中描述的。通过泊松分布，1:30的比例产生96％的机会观察到96孔中某处的至少一个TU。
图1描绘了本发明的重组噬菌体(指示物噬菌体
Figure BDA0002740551510000201
415-Luc)的基因组结构的图示。对于图1中描绘的实施方案，检测部分由晚期(III类)基因区域110内***的萤火虫萤光素酶基因100编码，其在病毒生命周期的晚期表达。晚期基因通常以比其他噬菌体基因更高的水平表达，因为它们编码结构蛋白。因此，在图1所描绘的重组噬菌体的实施方案中，将指示基因(即，萤火虫萤光素酶)***晚期基因区域中，就在基因10B(主要衣壳蛋白)之后，并且是包含萤火虫萤光素酶基因100的构建体。图1中所描绘的构建体被设计成在全部3个阅读框中包括终止密码子120以确保萤光素酶不掺入基因10B产物中。也如图1所描绘的，构建体可以包含共有T7晚期启动子130来驱动萤光素酶基因的转录和表达。构建体还可以包含由几个T7 UTR140合成的复合非翻译区。这种构建体确保产生可溶性萤火虫萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示***中固有的衣壳蛋白的数量。
如本文中所述，在某些实施方案中，可以优选利用已经从环境中分离的感染原，用于产生本发明的感染原。以这种方式，可以生成对天然衍生的微生物具有特异性的感染原。
例如，图2显示了噬菌体SEA1的基因组，SEA1是与T4相关肌尾病毒噬菌体S16具有约95％序列同源性的天然噬菌体。SEA1噬菌体是从Francisco Martinez的实验室获得的，并使用具有从头序列组装的Illumina MiSeq进行了全基因组测序。如实施例中所讨论的，主要衣壳蛋白220和各种其他结构基因在晚期基因区域210内，由结构基因组成，其编码病毒粒子蛋白。编码伴侣蛋白以形成长尾纤维的基因57A 230位于晚期基因区域的边界。因为这些病毒粒子蛋白以非常高的水平表达，只要使用晚期基因启动子和/或其他相似控制元件，就可以预期***到这个区域中的任何基因具有相似的表达水平。
有许多已知的方法和商业产品用于制备质粒。例如，PCR、定点诱变、限制性消化、连接、克隆和其他技术可以组合使用以制备质粒。合成的质粒也可以商业订购(例如，GeneWiz)。也可以利用粘粒，或者可以使用CRISPR/CAS9***以选择性地编辑噬菌体基因组。制备重组指示物噬菌体的方法的一些实施方案包括设计可容易地与野生型噬菌体基因组重组以生成重组基因组的质粒。在设计质粒时，一些实施方案包括添加密码子优化的报道基因，例如萤光素酶基因。一些实施方案还包括将元件添加到上游非翻译区中。例如，在设计与葡萄球菌属或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体基因组重组的质粒时，可以在编码gp23/主要衣壳蛋白的C末端的序列与
Figure BDA0002740551510000211
报道基因的起始密码子之间添加上游非翻译区。非翻译区可以包含启动子，例如，T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1启动子。非翻译区还可以包含核糖体进入/结合位点(RBS)，也被称为具有细菌***的“Shine-Dalgarno序列”。这些元件或其他非翻译元件中的一个或两者，可以嵌入短的上游非翻译区内，该区域由包含与其余噬菌体基因组大致相同的GC含量的随机序列构成。随机区域不应包含ATG序列，因为它将用作起始密码子。
本发明的组合物可以包含各种感染原和/或指示基因。例如，图3显示了携带用于2种不同噬菌体的萤光素酶基因的两种同源重组质粒构建体，在***位点的上游和下游具有约500bp的匹配噬菌体序列以促进同源重组。将
Figure BDA0002740551510000222
萤光素酶***到具有上游非翻译区的pBAV1k-T5-GFP质粒骨架中，该上游非翻译区含有噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。构建金黄色葡萄球菌噬菌体重组质粒以将
Figure BDA0002740551510000224
***晚期基因区域内，但由于稳定性问题而与主要衣壳蛋白(MCP)保持一定距离。
主要衣壳蛋白片段416-915是编码病毒粒子蛋白的结构基因的一部分。因为这些病毒粒子蛋白以很高的水平表达，只要使用晚期基因启动子和/或其他相似控制元件，就可以预期***到这个区域中的任何基因具有相似的表达水平。
在一些实施方案中，根据本发明的指示物噬菌体包含经遗传改造以包含报道基因(例如萤光素酶基因)的葡萄球菌属特异性噬菌体。例如，指示物噬菌体可以是葡萄球菌属特异性噬菌体，其中基因组包含
Figure BDA0002740551510000223
基因的序列。重组葡萄球菌属特异性NanoLuc噬菌体基因组可以进一步包含启动子，例如，T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、葡萄球菌属特异性、ViI或另一种晚期启动子。在一些实施方案中，葡萄球菌属特异性噬菌体是金黄色葡萄球菌特异性噬菌体。
因此，在因重组而生成的重组噬菌体的实施方案中，将指示基因(即
Figure BDA0002740551510000221
)***到晚期基因区域中，紧接编码主要衣壳蛋白的基因的下游，并因此创建包含
Figure BDA0002740551510000225
基因的重组噬菌体基因组。构建体可以另外地包含T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1、葡萄球菌属特异性噬菌体、ViI的共有启动子或另一种晚期启动子或另一种合适的启动子以驱动萤光素酶基因的转录和表达。构建体还可以包含由几个UTR合成的复合非翻译区。该构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示***中固有的衣壳蛋白的数量。
图4描绘了从野生型和由同源重组得到的重组噬菌体的混合物分离重组噬菌体。
在第一步骤402中，用金黄色葡萄球菌噬菌体噬菌体K感染用同源重组质粒转化的金黄色葡萄球菌细菌，产生具有亲本和重组噬菌体混合物的后代噬菌体434，其比例为大约186个野生型比1个重组噬菌体。将所得到的重组噬菌体混合物稀释404至96-孔平板406中，以得到每个平板平均5个重组转导单位(TU)(9.3PFU/孔)。对96-孔平板测定萤光素酶活性，以鉴定与含有野生型噬菌体的孔440相比，含有重组噬菌体的孔436。加入408细菌438；例如，每个孔可以含有大约50μL混浊的金黄色葡萄球菌培养物。这允许噬菌体复制并产生萤光素酶442。在410所示的在37℃孵育2小时后，可以针对萤光素酶442的存在筛选孔。任何阳性孔都可能已经用单个重组噬菌体接种，并且在这个阶段，混合物可以含有大约9.3个野生型噬菌体:1个重组体的比例，高于初始186:1比例的富集。在一个实施方案中，通过萤光素酶测定法发现5个孔中的一个含有可溶性萤光素酶，以大约总计2.4个:1个重组体的比例含有噬菌体。如果需要(即，如果重组体:总计的比例小于1:30)，来自这个富集的培养物412的后代可以接受另外的一种或多种有限稀释测定法414，以增加比例和确定重组噬菌体转导单位的实际浓度。例如，如果比例是1:384重组体:PFU，大约5个重组TU以及1920个污染性总噬菌体(5x384＝1920)，则可以从先前的阳性孔中等分414出每个96-孔平板416，导致第二稀释测定板每孔大约接种20个大多数野生型噬菌体(1920PFU/96孔＝20PFU/孔)420。任何阳性萤光素酶孔都可能已被单个重组体以及19个野生型噬菌体一起接种。可以对这些孔分析萤光素酶442的存在。
添加细菌并孵育(例如，在37℃下2小时)418后，可溶性萤光素酶和噬菌体以大约总计20个:1个重组体存在420。可以通过用于重组体的TU50滴定和用于总PFU的噬菌斑测定法来验证该比例。最后，可以进行噬菌斑测定法422以筛选表达萤光素酶446的重组体。可以单独挑选少量的单独的(例如，n＝48)噬菌斑并针对萤光素酶活性436在第三多孔平板426中筛选。在一个实施方案中，这种方法应当确保筛选足够的噬菌斑，以便基于已知的重组体与总噬菌体的比例，约3个重组体在待筛选的噬菌斑混合物中。可以从平板取出一个噬菌斑至96-孔平板的每个孔中424，并且进行萤光素酶测定法426以确定哪些孔含有呈现出萤光素酶活性442的噬菌体。显示萤光素酶活性的孔428代表纯的重组噬菌体434，而没有萤光素酶活性的孔430代表纯的野生型噬菌体432。
然后可以将单个噬菌斑悬浮于缓冲液(例如，100μL TMS)或培养基中，并且将等分试样(例如，约5μL)添加到含有混浊的金黄色葡萄球菌培养物的孔中，并在孵育(例如，在37℃下约45分钟至1小时)后测定。预期阳性孔含有纯的重组噬菌体培养物。某些实施方案可以包括另外轮次的噬菌斑纯化。
因此，如图4举例说明的，通过设计用于与野生型噬菌体基因组重组的质粒的同源重组生成的重组噬菌体可以从包含仅0.005％的总噬菌体基因组的混合物中分离。分离后，可以进行大规模生产以获得适用于金黄色葡萄球菌检测测定法中的高滴度重组指示物噬菌体储液。此外，氯化铯等密度梯度离心可以用于将污染性萤光素蛋白与噬菌体颗粒分离，以降低背景。
使用感染原检测微生物的方法
如本文中所述的，在某些实施方案中，本发明可以包括使用感染原检测微生物的方法。可以以各种方式来实施本发明的方法。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中的目标细菌的方法，其包括以下步骤：将感染目标细菌的噬菌体与样品孵育，其中噬菌体包含指示基因使得目标细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示目标细菌存在于样品中。
在另一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中目标抗生素抗性细菌的方法，其包括以下步骤：(i)将样品与至少一种抗生素孵育以允许富集对抗生素具有抗性的细菌，(ii)将富集的样品与感染目标细菌的噬菌体孵育，其中噬菌体包含指示基因，使得在目标细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；和(iii)检测指示蛋白产物，其中指示蛋白质产物的阳性检测指示目标抗生素抗性细菌存在于样品中。
在某些实施方案中，可以进行测定法以利用可以被修改以适应不同样品类型或尺寸和测定法形式的一般概念。利用本发明的重组噬菌体(即指示物噬菌体)的实施方案可以允许快速检测特定的细菌菌株，总测定时间小于1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0小时，取决于样品类型、样品尺寸和测定法形式。例如，所需时间的量可能会略短或更长，取决于噬菌体的菌株和测定法中待检测的细菌的菌株，待测试样品的类型和尺寸，靶标活力所需的条件，物理/化学环境的复杂性，以及“内源性”非靶细菌污染物的浓度。
图5显示了根据本发明的实施方案，使用产生可溶性萤光素酶的指示物噬菌体的策略。在该方法中，噬菌体(例如，T7、T4、T4-样、噬菌体K、MP131、MP115、MP112、MP506、MP87、Rambo、SAPJV1噬菌体)可以被改造以在噬菌体复制期间表达可溶性萤光素酶。萤光素酶的表达通过病毒衣壳启动子(例如，噬菌体T7或T4晚期启动子)来驱动，产生高表达。亲本噬菌体将不含萤光素酶，因此测定法中检测的萤光素酶必须来自细菌细胞感染期间后代噬菌体的复制。因此，通常不需要从后代噬菌体分离出亲本噬菌体。
在这些实验中，将至少部分的包含待定量的细菌502的样品500放入旋转柱滤器中并离心以除去LB肉汤，并且添加经过遗传改造以表达可溶性萤光素酶503的合适多重的噬菌体504。可以将受感染的细胞孵育足以发生后代噬菌体复制和细胞裂解的时间(例如，在37℃下30-90分钟)。然后可以收集(例如，通过离心)裂解物中的亲本噬菌体504和后代噬菌体516加游离萤光素酶503，并且使用光度计518定量滤液中萤光素酶的水平。可替代地，可以利用高通量方法，其中将细菌样品应用于96-孔滤板中，并且在进行以上所列的所有操作后，可以直接在初始96-孔滤板中测定萤光素酶，而没有最后的离心步骤。
图6描绘了使用根据本发明的实施方案的修饰的噬菌体来检测目标细菌的滤板测定法。简言之，可以将包括目标细菌618的样品616添加到多孔滤板604的孔602中并旋转606以通过从样品中除去液体来浓缩样品。将经遗传修饰的噬菌体620添加到孔中并与添加的另外的培养基孵育足以吸附的时间608，随后感染靶细菌并进行噬菌体生命周期610(例如，～45分钟)。最后，添加萤光素酶底物并与存在的任何萤光素酶624反应。在检测萤光素酶活性626的光度计614中测量产生的发射。
在某些实施方案中，可以在不将细菌浓缩在捕获表面上或附近的情况下进行测定法。图7举例说明了用于使用根据本发明的实施方案的修饰的噬菌体来检测目标细菌的“无浓缩测定法”。将指示物噬菌体714的等分试样分配到多孔平板704的各个孔702中，并且然后添加含有细菌712的测试样品等分试样并孵育706(例如，在37℃下45分钟)持续足以使噬菌体复制并生成可溶性指示物716(例如，萤光素酶)的时间段。然后可以测定710包含可溶性指示物和噬菌体的板孔708以测量在平板718上的指示物活性(例如，萤光素酶测定法)。在该实施方案中，不浓缩测试样品(例如，通过离心)，而是简单地与指示物噬菌体直接孵育一段时间并随后测定萤光素酶活性。
在一些实施方案中，可以在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在这样的实施方案中，富集时间段可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16小时或更长，取决于样品类型和尺寸。
在一些实施方案中，指示物噬菌体包含可检测的指示部分，并且可以通过经由指示部分生成的放大信号来检测单个病原体细胞(例如细菌)的感染。因此，所述方法可以包括检测在噬菌体复制期间产生的指示部分，其中指示物的检测指示目标细菌存在于样品中。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中的目标细菌的方法，其包括以下步骤：将样品与感染目标细菌的重组噬菌体孵育，其中重组噬菌体包含***到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示目标细菌存在于样品中。在一些实施方案中，检测的指示部分的量对应于样品中存在的目标细菌的量。
如本文更详细描述的，本发明的方法和***可以利用一定浓度范围的亲本指示物噬菌体来感染样品中存在的细菌。在一些实施方案中，将指示物噬菌体以足以快速发现、结合和感染在样品中以极低数量存在的靶细菌(例如单个细胞)的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，噬菌体浓度可以足以在不到一小时内发现、结合和感染靶细菌。在其他实施方案中，在将指示物噬菌体添加至样品后，这些事件可在小于两小时或小于三小时内发生。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度大于1×105PFU/mL，大于1×106PFU/mL，或大于1×107PFU/mL。
在某些实施方案中，重组感染原可以被纯化以不含在产生感染剂原储液时可能生成的任何残留的指示蛋白。因此，在某些实施方案中，在与样品孵育之前，可使用氯化铯等密度梯度离心纯化重组噬菌体。当感染原是噬菌体时，该纯化可以具有除去不具有DNA的噬菌体(即空噬菌体或“菌蜕(ghost)”)的额外益处。
在本发明方法的一些实施方案中，可以在不需要任何从样品分离或纯化微生物的情况下来检测微生物。例如，在某些实施方案中，含有一个或几个目标微生物的样品可以直接应用至测定容器，例如，旋转柱、微滴定孔或滤器，并且在该测定容器中进行测定。本文中公开了此类测定的各种实施方案。
可以将等分的测试样品直接分配到多孔平板的孔中，添加指示物噬菌体，并且在足以感染的时间段后，可添加裂解缓冲液以及指示部分的底物(例如，用于萤光素酶指示物的萤光素酶底物)并测定指示信号的检测。该方法的一些实施方案可以在滤板上进行。该方法的一些实施方案可以在用指示物噬菌体感染前用或不用浓缩的样品进行。
例如，在许多实施方案中，使用多孔平板来进行测定法。平板的选择(或其中可以进行检测的任何其他容器)可能影响检测步骤。例如，一些平板可以包括彩色或白色背景，这可能影响光发射的检测。一般而言，白色平板具有更高的灵敏度，但也产生更高的背景信号。其他颜色的平板可能产生更低的背景信号，但也具有略低的灵敏度。另外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄露至另一个相邻的孔。存在一些具有白色孔但平板的剩余部分是黑色的平板。这允许孔内部的高信号，但防止孔至孔的光泄露，并且因此可以降低背景。因此，平板或其他测定容器的选择可能影响测定法的灵敏度和背景信号。
本发明的方法可以包括各种其他步骤以增加灵敏度。例如，如本文更详细地讨论的，所述方法可以包括在添加噬菌体之后但在孵育之前洗涤捕获的和受感染的细菌的步骤，以除去过量的亲本噬菌体和/或萤光素酶或其他污染噬菌体制备物的报道蛋白。
在一些实施方案中，可以在不需要培养样品作为增加微生物群体的方式的情况下完成对目标微生物的检测。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间小于16.0小时、15.0小时、14.0小时、13.0小时、12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或小于30分钟。最小化得到结果的时间对于病原体的食品和环境测试至关重要。
与本领域已知的测定法相反，本发明的方法可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可以检测样品中存在的≤10个微生物细胞(即1、2、3、4、5、6、7、8、9个微生物)。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对葡萄球菌属具有高度特异性。在一些实施方案中，葡萄球菌属物种是金黄色葡萄球菌。在进一步的实施方案中，金黄色葡萄球菌可以是耐甲氧西林的(MRSA)。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型细菌的存在下区分葡萄球菌属。在其他实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型细菌的存在下区分金黄色葡萄球菌。在某些实施方案中，重组噬菌体可用于检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体检测样品中少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定细菌。
如本文所述，在某些实施方案中，本发明可以包括使用重组噬菌体来检测微生物对抗生素的抗性或以另一种方式来说检测抗生素对微生物的功效的方法。在另一个实施方案中，本发明包括用于选择用于治疗感染的抗生素的方法。另外，所述方法可以包括用于检测样品中的抗生素抗性细菌的方法。本发明的方法可以以多种方式体现。
方法可以包括使包含微生物的样品与如上所述的抗生素和感染原接触。在一些实施方案中，本公开内容提供了确定在杀死或抑制微生物生长中抗生素的有效剂量的方法，其包括：(a)将一种或多种抗生素溶液中的每一种分别与一种或多种包含微生物的样品孵育，其中一种或多种抗生素溶液的浓度是不同的并限定范围，(b)将一种或多种样品中的微生物与包含指示基因的感染原孵育，并且其中感染原对目标微生物具有特异性：和(c)检测一种或多种样品中感染原产生的指示蛋白产物，其中在多种样品中的一种或多种中的指示蛋白产物的检测指示用于处理一种或多种样品中的一种或多种抗生素溶液的浓度是无效的，并且缺乏指示蛋白的检测指示抗生素是有效的，从而确定抗生素的有效剂量。
在一些实施方案中，将抗生素和感染原同时添加至样品，使得样品与抗生素和感染原两者接触。在其他实施方案中，依次添加抗生素和感染原，例如，在样品与感染原接触之前使样品与抗生素接触。在某些实施方案中，所述方法可以包括在使样品与感染原接触之前将样品与抗生素孵育一段时间。孵育时间可以根据抗生素和微生物的性质而变化，例如基于微生物的倍增时间。在一些实施方案中，孵育时间小于24小时、小于18小时、小于12小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、小于45分钟、小于30分钟、小于15分钟、小于10分钟或小于5分钟。微生物与感染原的孵育时间也可以取决于特定感染原的生命周期而变化，在一些情况下，孵育时间小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、小于45分钟、小于30分钟、小于15分钟、小于10分钟或小于5分钟。对抗生素有抗性的微生物将存活并可以繁殖，并且对微生物具有特异性的感染原将复制；相反地，对抗生素敏感的微生物将被杀死并且因此感染原不会复制。根据该方法的感染原包含指示部分，其量对应于已经用抗生素处理的样品中存在的微生物的量。因此，指示部分的阳性检测指示微生物对抗生素具有抗性。
在一些实施方案中，所述方法可以用于确定临床样品中是否存在抗生素抗性微生物。例如，所述方法可以用于确定患者是否感染了对特定抗生素具有抗性或易感的金黄色葡萄球菌。然后可以将从患者获得的临床样品与对金黄色葡萄球菌具有特异性的抗生素孵育。然后可以将样品与对金黄色葡萄球菌具有特异性的重组噬菌体孵育一段时间。在具有对抗生素具有抗性的金黄色葡萄球菌的样品中，重组噬菌体产生的指示蛋白的检测将是阳性的。在具有对抗生素易感的金黄色葡萄球菌的样品中，指示蛋白的检测将是阴性的。在一些实施方案中，用于检测抗生素抗性的方法可以用于选择病原菌易感的有效治疗剂。
在某些实施方案中，检测所需的总时间小于6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时或小于1.0小时。检测所需的总时间将取决于目标细菌、噬菌体的类型以及所测试的抗生素。
任选地，所述方法进一步包括在检测指示部分之前裂解微生物。可以使用能裂解微生物的任何溶液。在一些情况下，裂解缓冲液可以含有非离子型去污剂、螯合剂、酶或各种盐和试剂的专有组合。裂解缓冲液也可从Promega、Sigma-Aldrich或Thermo-Fisher商购获得。实验表明，在一些实施方案中，加入萤光素酶底物后可检测到受感染的未裂解细胞。据推测，萤光素酶可能离开细胞和/或萤光素酶底物可能进入细胞而没有完全的细胞裂解。因此，对于利用旋转过滤器***的实施方案，其中在光度计中仅分析释放到裂解物中的萤光素酶(而不是仍然在完整细菌内部的萤光素酶)，检测需要裂解。然而，如下所述，对于利用滤板或96-孔平板以及在溶液或悬浮液中的噬菌体感染的样品的实施方案，其中完整的和裂解的细胞可以在光度计中直接测定，裂解对于检测可能不是必需的。因此，在一些实施方案中，检测抗生素抗性的方法不涉及裂解微生物。
测定法的实施方案的令人惊讶方面是将样品中的微生物与感染原孵育的步骤仅需要用于感染原(例如，噬菌体)的单个生命周期的足够长的时间。先前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多时间，使得噬菌体将复制数个循环。根据本发明的一些实施方案，指示物噬菌体的单次复制可能足以促进灵敏且快速的检测。测定的实施方案的另一个令人惊讶的方面是用于感染测试样品的高浓度的噬菌体(即，高ΜOΙ)已经成功地实现了对已经用抗生素处理的非常少量的抗生素抗性靶微生物的检测。包括噬菌体裂解量在内的因素可以影响噬菌体生命周期的数量，并因此影响检测所需的时间。具有大裂解量(大约100PFU)的噬菌体可能仅需要一个周期用于检测，而具有较小裂解量(例如，10PFU)的噬菌体可能需要多个噬菌体周期用于检测。在一些实施方案中，噬菌体与测试样品的孵育仅需要用于单个噬菌体生命周期的足够长的时间。在其他实施方案中，噬菌体与测试样品的孵育是大于单个生命周期的时间量。孵育步骤的噬菌体浓度将根据所用噬菌体的类型而变化。在一些实施方案中，用于该孵育步骤的噬菌体浓度大于1.0×105、大于1.0×106、大于1.0×107或大于1.0×108PFU/mL。使用如此高浓度噬菌体的成功是令人惊讶的，因为如此大量的噬菌体之前与“自外裂解”相关，其立即杀死靶细胞并由此防止从早期噬菌体测定中生成有用的信号。本文中所述的噬菌体储液的纯化可能有助于缓解该问题(例如，通过氯化铯等密梯度超离心的纯化)，因为除了除去任何与噬菌体缔合的污染性萤光素酶，这种纯化也可能除去菌蜕颗粒(具有丢失的DNA的颗粒)。这种菌蜕颗粒可以通过“自外裂解”裂解细菌细胞，过早地杀死细胞并由此防止指示物信号的生成。电子显微镜证明了粗制重组噬菌体裂解物(即，在氯化铯纯化之前)可能具有高于50％的菌蜕。这些菌蜕颗粒可以通过刺穿细胞膜的许多噬菌体颗粒的作用引起微生物的过早死亡。因此，菌蜕颗粒可能引起之前的问题，其中报道了高PFU浓度是有害的。
如本公开内容中所述的任何指示部分可以用于检测抗生素处理后微生物的活力，从而检测抗生素抗性。在一些实施方案中，在感染原复制期间或之后可以检测到与感染原缔合的指示部分。例如，如上所述，在一些情况下，指示部分可以是发射内在信号的蛋白质，例如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或其他)。指示物可以生成光和/或可以通过颜色变化而可检测。在一些实施方案中，可以使用光度计来检测指示物(例如，萤光素酶)。但是，也可以使用其他机器或设备。例如，分光光度计、CCD相机或CMOS相机可以检测颜色变化和其他光发射。
在一些实施方案中，样品暴露于抗生素可以持续5分钟或更长并且在各个时间点进行检测对于优化灵敏度可能是所希望的。例如，可以以不同的时间间隔(例如，在5分钟、10分钟或15分钟时)获取用抗生素处理的初级样品的等分试样。然后，用噬菌体感染来自不同时间间隔的样品，并在添加底物后测量指示部分。
在一些实施方案中，信号的检测用于确定抗生素抗性。在一些实施方案中，将样品产生的信号与实验确定的值进行比较。在其他实施方案中，实验确定的值是由对照样品产生的信号。在一些实施方案中，使用没有微生物的对照来确定背景阈值。在一些实施方案中，实验确定的值是从平均背景信号加上平均背景信号的1-3倍或更大的标准偏差计算的背景阈值。在一些实施方案中，可以从平均背景信号加上平均背景信号的2倍的标准偏差来计算背景阈值。在其他实施方案中，可以从平均背景信号乘以某个倍数(例如，2或3)来计算背景阈值。检测到样品信号大于背景阈值指示样品中存在一种或多种抗生素抗性微生物。例如，平均背景信号可以是250RLU。可通过将平均背景信号(例如，250)乘以3以计算750RLU的值来计算阈值背景值。具有大于750RLU的信号值的细菌的样品被确定为对含有抗生素抗性细菌呈阳性。
可替代地，实验确定的值是由对照样品产生的信号。测定可以包括各种合适的对照样品。例如，可以将不含对微生物具有特异性的感染原的样品或含有感染原但不含微生物的样品作为背景信号水平的对照进行测定。在一些情况下，将含有未经过抗生素处理的微生物的样品作为使用感染原用于确定抗生素抗性的对照进行测定。
在一些实施方案中，将样品信号与对照信号比较以确定样品中是否存在抗生素抗性微生物。相比于与感染原接触但不与抗生素接触的对照样品，未改变的信号检测指示微生物对抗生素具有抗性，以及相比于与感染原接触但不与抗生素接触的对照样品，减少的指示部分的检测指示微生物对抗生素易感。未改变的检测是指来自已经用抗生素和感染原处理过的样品的检测信号是来自未经过抗生素处理的对照样品的信号的至少80％、至少90％或至少95％。减少的检测是指来自已经用抗生素和感染原处理过的样品的检测信号是来自未经过抗生素处理的对照样品的信号的小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％或至少30％。
任选地，包含目标微生物的样品是未培养的样品。任选地，感染原是噬菌体并且包含***到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物。如上所述，在该方法中使用的每种组合物的特征也可以用于检测目标微生物的抗生素抗性的方法中。
本文还提供了确定用于杀死微生物的抗生素的有效剂量的方法。在一些实施方案中，抗生素有效杀死葡萄球菌属物种。例如，抗生素可以是头孢西丁(cefoxitin)，其对大多数甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)有效。通常，制备具有不同浓度的一种或多种抗生素溶液，使得不同浓度的溶液限定范围。在一些情况下，最低浓缩的抗生素溶液与最高浓缩的抗生素溶液的浓度比范围是1:2至1:50，例如，1:5至1:30、或1:10至1:20。在一些情况下，一种或多种抗生素溶液的最低浓度是至少1μg/mL，例如，至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少10μg/mL、至少20μg/mL、至少40μg/mL、至少80μg/mL或至少100μg/mL。将一种或多种抗生素溶液中的每一种与包含目标微生物的样品的一个等分试样孵育。在一些情况下，对微生物具有特异性并包含指示部分的感染原与抗生素溶液同时添加。在一些情况下，将样品的等分试样与抗生素溶液孵育一段时间，然后添加感染原。可以检测指示部分，并且阳性检测指示抗生素溶液无效而阴性检测指示抗生素溶液有效，并且抗生素溶液的浓度是有效剂量。因此，在一些实施方案中，确定在杀死目标微生物中抗生素的有效剂量的方法包括将一种或多种抗生素溶液中的每一种与样品中的目标微生物分别孵育，其中一种或多种抗生素溶液的浓度是不同的并限定范围；将一种或多种样品中的微生物与包含指示部分的感染原孵育；检测一种或多种样品中感染原的指示部分，其中一种或多种样品的一种或多种中的指示部分的阳性检测指示用于处理一种或多种样品的一种或多种的抗生素溶液的浓度无效，并且缺乏指示蛋白的检测指示抗生素是有效的，从而确定抗生素的有效剂量。在一些实施方案中，测试两种或更多种抗生素溶液，并且在一种或多种抗生素溶液中最低浓缩溶液和最高浓缩溶液的浓度比范围是1:2至1:50，例如，1:5至1:30，或1:10到1:20。在一些情况下，一种或多种抗生素溶液的最低浓度是至少1μg/mL，例如，至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少10μg/mL、至少20μg/mL、至少40μg/mL、至少80μg/mL或至少100μg/mL。
在一些实施方案中，本发明包括用于在对抗生素敏感的微生物的存在下检测抗生素抗性微生物的方法。在某些情况下，可以使用抗生素抗性细菌的检测来防止感染在医疗机构中传播。在一些实施方案中，可以对医疗机构环境中的患者监测抗生素抗性细菌的定殖。然后可以采取预防措施以防止抗生素抗性细菌的传播。
在用于检测抗生素抗性微生物的方法的一些实施方案中，样品可以包含抗生素抗性细菌和对抗生素敏感的细菌。例如，样品可以包含MRSA和MSSA两者。在一些实施方案中，可以在存在MSSA的情况下检测MRSA，而不需要从样品中分离MRSA。在存在抗生素的情况下，MSSA不生成高于阈值的信号，但是样品中存在的MRSA能够产生高于阈值的信号。因此，如果两者都存在于样品中，则高于阈值的信号指示存在抗生素抗性菌株(例如，MRSA)。
因此，本发明的方面提供了用于通过指示部分检测测试样品中的微生物的方法。在一些实施方案中，当目标微生物是细菌时，指示部分可以与感染原例如指示物噬菌体缔合。指示部分可以与底物反应以发射可检测信号或可以发射内在信号(例如，荧光蛋白)。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示测试样品中存在少至50、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个目标微生物细胞。在一些实施方案中，即使目标微生物的单个细胞也可以产生可检测信号。在一些实施方案中，噬菌体是T4-样或ViI样噬菌体。在一些实施方案中，重组噬菌体衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体。在某些实施方案中，重组葡萄球菌属特异性噬菌体对葡萄球菌属具有高度特异性。
在一些实施方案中，由感染原编码的指示部分可以在感染原复制期间或之后检测到。适合用作指示部分的许多不同类型的可检测生物分子是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一些实施方案中，指示物噬菌体包含用作指示部分的酶。在一些实施方案中，指示物噬菌体的基因组被修饰以编码可溶性蛋白。在一些实施方案中，指示物噬菌体编码可检测的酶。指示物可以发光和/或可以通过颜色变化可检测到。各种合适的酶是可商购获得的，例如，碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
Figure BDA0002740551510000351
是指示部分。生成可检测信号的其他改造的萤光素酶或其他酶也可以是合适的指示部分。
因此，在一些实施方案中，所述方法、***或试剂盒的重组噬菌体是从野生型葡萄球菌属特异性噬菌体制备的。在一些实施方案中，指示基因编码发射内在信号的蛋白质，例如，荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或其他)。指示物可以发光和/或可以通过颜色变化可检测到。在一些实施方案中，指示基因编码与底物相互作用以生成信号的酶(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。在一些实施方案中，萤光素酶基因是Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、外部Gaussia萤光素酶、Lucia萤光素酶或改造的萤光素酶中的一种，例如，
Figure BDA0002740551510000352
Rluc8.6-535或Orange Nano-灯笼。
检测指示物可以包括检测光的发射。在一些实施方案中，可以使用光度计来检测指示物(例如，萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可以用光度计实现，或者也可以使用其他机器或设备。例如，分光光度计、CCD相机或CMOS相机可以检测颜色变化和其他光发射。绝对RLU对于检测很重要，但是为了可靠地检测单个细胞或少量细胞，信号背景比也需要高(例如，>2.0、>2.5或>3.0)。
在一些实施方案中，指示物噬菌体被遗传改造以包含酶(例如，萤光素酶)的基因，所述酶仅在噬菌体特异性识别和感染的细菌的感染后产生。在一些实施方案中，指示部分在病毒生命周期的后期表达。在一些实施方案中，如本文所述，指示物是可溶性蛋白质(例如，可溶性萤光素酶)并且不与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
因此，在利用指示物噬菌体的一些实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，其包括以下步骤：捕获至少一种样品细菌；将至少一种细菌与多种指示物噬菌体孵育；允许进行感染和复制的时间以产生后代噬菌体并表达可溶性指示部分；和检测后代噬菌体，或优选地指示物，其中指示物的检测证明细菌存在于样品中。
例如，在一些实施方案中，可以通过结合平板的表面，或通过噬菌体滤器(例如，0.45μm孔径旋转滤器或平板滤器)过滤样品来捕获测试样品细菌。在一个实施方案中，将感染原(例如，指示物噬菌体)以最小体积直接添加至滤器上的捕获样品中。在一个实施方案中，随后将捕获在滤器或平板表面上的微生物洗涤一次或多次以除去过量的未结合的感染原。在一个实施方案中，可以添加培养基(例如，Luria-Bertani Broth，在本文中也称为LB，或Tryptic Soy Broth或Tryptone Soy Broth，在本文中也称为TSB)用于进一步的孵育时间，以允许细菌细胞和噬菌体的复制以及编码指示部分的基因的高水平表达。但是，测试测定法的一些实施方案的令人惊讶的方面在于具有指示物噬菌体的孵育步骤只需要用于单个噬菌体生命周期的足够长的时间。之前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多时间，使得噬菌体能复制几个周期。根据本发明的一些实施方案，指示物噬菌体的单个复制周期足以促进灵敏且快速的检测。
在一些实施方案中，可以将包含细菌的测试样品的等分试样应用到旋转柱上，并且在用重组噬菌体感染并且任选洗涤以除去任何过量的噬菌体之后，检测到的可溶性指示物的量将与由受感染的细菌产生的噬菌体的量成比例。
然后，可以测量和定量细菌裂解时释放至周围液体中的可溶性指示物(例如，萤光素酶)。在一个实施方案中，将溶液旋转通过滤器，并在添加指示物酶的底物(例如，萤光素酶底物)后，将用于测定法的滤液收集在新的容器中(例如，在光度计中)。可替代地，可以直接在滤器上测量指示物信号。
在各种实施方案中，纯化的亲本指示物噬菌体不包括可检测指示物本身，因为在用于与测试样品孵育前，亲本噬菌体可以被纯化。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本发明的一些实施方案中，亲本噬菌体可以被纯化以排除任何存在的指示蛋白(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，在感染宿主细菌后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物。因此，在许多实施方案中，不需要在检测步骤之前将亲本噬菌体与后代噬菌体分开。在一个实施方案中，微生物是细菌并且指示物噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示部分是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解时释放出来。
因此，在替代实施方案中，指示物底物(例如，萤光素酶底物)可以与保持在滤器上或结合到平板表面的样品的部分孵育。因此，在一些实施方案中，固体支持物是96-孔滤板(或常规96-孔平板)，并且通过将平板直接放置在光度计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测MRSA的方法，其包括以下步骤：用能够在感染时表达萤光素酶的多个亲本指示物噬菌体感染96-孔滤板上捕获的细胞；洗掉过量噬菌体；添加具有抗生素的LB肉汤并允许噬菌体复制和裂解特定金黄色葡萄球菌靶标的时间(例如，30-90分钟)；和通过添加萤光素酶底物并直接在96-孔平板中测量萤光素酶活性来检测指示物萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测指示MRSA存在于样品中。
在一些实施方案中，细菌的裂解可以在检测步骤之前、之中或之后发生。实验表明，在一些实施方案中，添加萤光素酶底物后可以检测到受感染的未裂解的细胞。据推测，萤光素酶可能离开细胞和/或萤光素酶底物可能进入细胞而没有完全的细胞裂解。因此，对于利用旋转滤器***的实施方案，其中在光度计中仅分析释放到裂解物中的萤光素酶(而不是仍然在完整细菌内部的萤光素酶)，检测需要裂解。然而，对于利用滤板或96-孔平板以及在溶液或悬浮液中的样品的实施方案，其中完整的和裂解的细胞在光度计中直接测定，裂解对于检测不是必需的。
在一些实施方案中，指示部分(例如，萤光素酶)与底物的反应可持续30分钟或更长，并且在各个时间点进行检测对于优化灵敏度可能是所希望的。例如，在使用96-孔滤板作为固体支持物和萤光素酶作为指示物的实施方案中，可以在初始以及以10-或15-分钟间隔获取光度计读数，直至反应完成。
令人惊讶地，利用高浓度的噬菌体用于感染测试样品已成功地实现了在非常短的时间框架中检测非常少量的靶微生物。在一些实施方案中，噬菌体与测试样品孵育只需要用于单个噬菌体生命周期的足够长的时间。在一些实施方案中，用于该孵育步骤的噬菌体浓度大于7x 106、8x106、9x 106、1.0x 107、1.1x 107、1.2x 107、1.3x 107、1.4x 107、1.5x107、1.6x 107、1.7x 107、1.8x 107、1.9x 107、2.0x 107、3.0x 107、4.0x 107、5.0x 107、6.0x107、7.0x 107、8.0x 107、9.0x 107或1.0x 108PFU/mL。
使用这样的高浓度噬菌体的成功是令人惊讶的，因为大量的噬菌体之前与“自外裂解”相关，其杀死靶细胞并由此防止从早期噬菌体测定中生成有用的信号。本文中所述制备的噬菌体储液的清除可能有助于缓解该问题(例如，通过氯化铯等密梯度超离心的清除)，因为除了除去任何与噬菌体缔合的污染性萤光素酶，这种清除也可能除去菌蜕颗粒(具有丢失的DNA的颗粒)。菌蜕颗粒可以通过“自外裂解”裂解细菌细胞，过早地杀死细胞并由此防止指示物信号的生成。电子显微镜证明了粗制噬菌体裂解物(即，在氯化铯清除之前)可能具有高于50％的菌蜕。这些菌蜕颗粒可以通过刺穿细胞膜的许多噬菌体颗粒的作用引起微生物的过早死亡。因此，菌蜕颗粒可能引起之前的问题，其中报道了高PFU浓度是有害的。此外，非常干净的噬菌体制备允许在没有洗涤步骤的情况下进行测定，这使得可以在没有初始浓缩步骤的情况下进行测定。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，该浓缩步骤使得富集孵育时间更短。
测试方法的一些实施方案可以进一步包括确认性测定法。用于确认初始结果的各种测定法是本领域已知的，通常在较晚的时间点。例如，可以培养样品(例如，如实施例4中所述的
Figure BDA0002740551510000391
Figure BDA0002740551510000392
测定法)，可以利用PCR来确认微生物DNA的存在，或者可以使用其他确认性测定法来确认初始结果。
在某些实施方案中，除了用感染原的检测之外，本发明的方法组合使用结合剂(例如，抗体)从样品中纯化和/或浓缩目标微生物。例如，在某些实施方案中，本发明包括用于检测样品中目标微生物的方法，其包括以下步骤：使用对所述目标微生物具有特异性的捕获抗体在先前的支持物上从所述样品中捕获所述微生物；将所述样品与感染所述目标微生物的重组噬菌体孵育，其中所述重组噬菌体包含***到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在感染宿主细菌后噬菌体复制期间所述指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物；和检测所述指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测指示所述目标微生物存在于所述样品中。
例如，图8描绘了根据本发明的实施方案用于使用修饰的噬菌体检测目标细菌的杂交免疫噬菌体(HIP)测定法。首先将样品应用到用细菌特异性抗体包被的微量滴定板孔中802。然后将平板离心以促进细菌与捕获抗体的结合804。经过足够的时间以允许完全捕获细菌后，将含有细菌特异性的
Figure BDA0002740551510000393
-噬菌体的溶液添加至每个样品806。与噬菌体孵育导致单个或多个噬菌体与被捕获的细菌的结合和附着808。最后，孵育样品以促进噬菌体复制和荧光素酶表达，这导致细胞裂解并释放可溶性荧光素酶810。
合成生物学的最新进展增加了对治疗病原性疾病的基于噬菌体的治疗方法的兴趣(参见，例如，Phage Therapy in the Era of Synthetic Biology,Cold Spring HarbPerspect Biol 2016；8:a023879；以及美国专利号9,597,407和美国专利申请号20170266306和20160331804，其内容通过引用并入本文，如同完全详述于此一样。设计和改造噬菌体以检测来自患者的医学样品中的病原体是否存在特定微生物(例如，特定类型的细菌)可以增强这种治疗性噬菌体的有用性。
在一些实施方案中，指示物噬菌体可以用于测试初始患者样品中特定病原体(例如，特定属或种的细菌)的存在。在一些实施方案中，指示物噬菌体可以用于检测临床样品中的特定病原体。以这种方式，指示物噬菌体可以以与伴随诊断类似的方式使用，以便评估特定疗法(例如，特定抗生素、其他药物或治疗性噬菌体)的潜在功效，例如，在给定患者感染或其他致病性医学病况的情况下。在一些实施方案中，如前所述，可以通过对天然存在的噬菌体进行遗传修饰来制备诊断指示物噬菌体。
在一些实施方案中，通过合成技术制备的指示物噬菌体可以用于非临床用途。例如，指示物噬菌体可以用作食品安全诊断剂以鉴定食品中特定细菌的存在。在其他实施方案中，可以通过合成技术制备诊断指示物噬菌体。例如，可以设计和构建合成的噬菌体基因组，用于在各种类型的细菌中转化和繁殖相应的噬菌体。在一些情况下，合成生物学技术可以用于使用指示物噬菌体靶细菌来生成指示物噬菌体。在其他情况下，可以使用更方便的细菌来生成指示物噬菌体。例如，用于靶向李斯特氏菌属的指示物噬菌体的合成基因组可以在李斯特氏菌属或更方便的物种(例如，乳杆菌属(Lactobacillus))中生成。
在一些实施方案中，设计合成噬菌体以优化用于病原体检测测定法的所希望的性状。在一些实施方案中，采用生物信息学和遗传修饰的先前分析来优化所希望的性状。例如，在一些实施方案中，可以优化编码噬菌体尾蛋白的基因以识别并结合细菌的特定物种。在其他实施方案中，可以优化编码噬菌体尾蛋白的基因以识别并结合细菌的整个属或属内的特定组的物种。以这种方式，可以优化噬菌体以检测更宽或更窄的病原体组。在一些实施方案中，可以将合成噬菌体设计为改善报道基因的表达。另外和/或可替代地，在一些情况下，可以将合成的噬菌体设计为增加噬菌体的裂解量以改善检测。
在一些实施方案中，可以优化噬菌体的稳定性以改善保存期。例如，可以增加酶抗生素(enzybiotic)溶解度以便增加随后的噬菌体稳定性。另外和/或可替代地，可以优化噬菌体的热稳定性。耐热噬菌体在储存期间更好地保留功能活性，从而增加保存期。因此，在一些实施方案中，可以优化热稳定性和/或pH耐受性。
一些细菌的物种建立生物膜壁以保护自身免受免疫***的攻击。这些生物膜可能使有效地靶向细菌变得困难。已经鉴定出能够分解细菌生物膜的许多酶(例如，糖苷水解酶PelAh和PslGh)。在一些实施方案中，可以修饰噬菌体以编码可溶性或融合病毒粒子蛋白，以允许掺入酶来分解生物膜。
在一些实施方案中，遗传修饰的噬菌体或合成来源的噬菌体包含可检测指示物。在一些实施方案中，指示物是萤光素酶。在一些实施方案中，噬菌体基因组包含指示基因(例如，萤光素酶基因或编码可检测指示物的另一基因)。
在另一方面，本发明可以包括：一种用于选择用于受试者的治疗的方法，其包括：(i)从所述受试者获得生物样品；(ii)使用指示物噬菌体检测所述生物样品中的特定微生物或微生物类别；和(iii)基于在所述生物样品中检测到的特定微生物的鉴定来选择治疗。
在一些实施方案中，无论是否合成制备的，指示物噬菌体都可以用于在开始某种类型的治疗之后检测患者样品中的病原体。在一些实施方案中，治疗可以是基于噬菌体的治疗剂。在其他实施方案中，治疗可以是抗生素(例如，传统的抗生素，例如青霉素或环孢霉素)。在其他实施方案中，治疗可以是另一种类型的药物或疗法。以这种方式，指示物噬菌体可以用于监测任何类型的治疗或疗法的进展或功效。在一些实施方案中，指示物噬菌体可以用于检测和监测在开始治疗后数小时或数天采集的患者样品的病原体含量。在一些实施方案中，指示物噬菌体可以用于在慢性感染的情况下监测样品，并且可以是在治疗开始后的数天、数周、数月或数年。
本发明的***和试剂盒
在一些实施方案中，本发明包括***(例如，自动化***或试剂盒)，其包括用于进行本文中公开的方法的组分。在一些实施方案中，指示物噬菌体包含在根据本发明的***或试剂盒中。本文描述的方法也可以利用这样的指示物噬菌体***或试剂盒。鉴于进行方法需要少量的试剂和材料，本文中所述的一些实施方案特别适用于自动化或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒的每个组分可以包含可以从第一个位点传送至第二个位点的自给单元。
在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的***或试剂盒。在某些实施方案中，所述***或试剂盒包括将样品与对目标微生物具有特异性的感染原孵育的组分和用于检测指示部分的组分，其中所述感染原包含指示部分。在本发明的***和试剂盒两者的一些实施方案中，感染原是感染目标细菌的重组噬菌体，并且重组噬菌体包含***到噬菌体的晚期基因区域中的指示基因作为指示部分，使得在感染宿主细菌后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物。一些***进一步包括用于在固体支持物上捕获目标微生物的组分。
在其他实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的方法、***或试剂盒，其包括对目标微生物具有特异性的感染原组分和用于检测指示部分的组分，其中所述感染原包含指示部分。在一些实施方案中，噬菌体是T4-样、ViI、ViI-样、葡萄球菌属特异性噬菌体。在一个实施方案中，重组噬菌体衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体。在某些实施方案中，重组噬菌体对特定细菌具有高度特异性。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体是对葡萄球菌属高度特异性的。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌的存在下区分克罗诺杆菌属(Cronobacter)。在另一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌的存在下区分葡萄球菌属。在某些实施方案中，所述***或试剂盒检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施例中，所述***或试剂盒检测样品中的少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定细菌。
在某些实施方案中，所述***和/或试剂盒可以进一步包括用于洗涤所捕获的微生物样品的组分。另外地或可替代地，所述***和/或试剂盒可以进一步包括用于确定指示部分的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中的微生物的量。例如，在某些实施方案中，所述***或试剂盒可以包括用于测量萤光素酶活性的光度计或其他设备。
在一些***和/或试剂盒中，相同的组分可以用于多个步骤。在一些***和/或试剂盒中，步骤是自动化的或通过使用者经由计算机输入来控制和/或其中液体操作机器人进行至少一个步骤。
因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的***或试剂盒，其包括：用于将所述样品与对所述目标微生物具有特异性的感染原孵育的组分，其中所述感染原包含指示部分；用于在固体支持物上从所述样品捕获所述微生物的组分；用于洗涤所捕获的微生物样品以除去未结合的感染原的组分；和用于检测所述指示部分的组分。在一些实施方案中，相同组分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤(例如，滤器组分)。一些实施方案另外地包括用于确定样品中的目标微生物的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中的微生物的量。这样的***可以包括与上述针对快速检测微生物的方法描述的那些类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌并且感染原是噬菌体。在计算机化的***中，***可以全自动化、半自动化或由使用者通过计算机指引(或其一些组合)。
在一些实施方案中，***可以包括用于从样品中的其他组分分离出目标微生物的组分。
在一个实施方案中，本发明包括包含用于检测目标微生物的组分的***或试剂盒，其包括：用于从样品中的其他组分分离出至少一个微生物的组分；用于用多个亲本感染原感染所述至少一个微生物的组分；用于裂解所述至少一个受感染的微生物以释放所述微生物中存在的后代感染原的组分；和用于检测所述后代感染原，或具有更高灵敏度，由所述感染原编码和表达的可溶性蛋白的组分，其中所述感染原或所述感染原的可溶性蛋白产物的检测指示所述微生物存在于所述样品中。感染原可以包含葡萄球菌特异性NANOLUC噬菌体。
所述***或试剂盒可以包括用于检测后代感染原的各种组分。例如，在一个实施方案中，后代感染原(例如，噬菌体)可以包括指示部分。在一个实施方案中，后代感染原(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制期间表达的可检测部分，例如，可溶性萤光素酶蛋白。
在其他实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的试剂盒，***包括：用于将所述样品与对所述目标微生物具有特异性的感染原孵育的组分，其中所述感染原包含指示部分；用于在固体支持物上从所述样品捕获所述微生物的组分；用于洗涤所捕获的微生物样品以除去未结合的感染原的组分；和用于检测所述指示部分的组分。在一些实施方案中，相同的组分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外地包括用于确定样品中的目标微生物的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中的微生物的量。这样的试剂盒可以包括与上述针对快速检测微生物的方法描述的那些类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌并且感染原是噬菌体。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于从样品中的其他组分分离出目标微生物的组分。
本发明的这些***和试剂盒包括各种组分。如本文所使用的术语“组分”宽泛限定并且包括适用于进行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。组分不需要以任何特定方式整体连接或相对于彼此布置。本发明包括组分相对于彼此的任何合适的排列。例如，组分不需要在同一个空间中。但在一些实施方案中，组分在完整单元中彼此连接。在一些实施方案中，相同的组分可以进行多个功能。
计算机***和计算机可读介质
本发明的技术中所述的***或其任何组分可以以计算机***的形式来体现。计算机***的典型实例包括通用计算机、程序化微处理器、微控制器、外周集成电路元件和能够进行组成本发明技术方法的步骤的其他设备或设备的排列。
计算机***可以包括计算机、输入设备、显示单元和/或互联网。计算机可以进一步包括微处理器。微处理器可以连接通讯总线。计算机还可以包括存储器。存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机***可以进一步包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，例如，软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备还可以是用于将计算机程序或其他指令加载至计算机***中的其他相似工具。计算机***还可以包括通讯单元。通讯单元允许计算机通过I/O接口连接其他数据库和互联网。通讯单元允许将数据转移至其他数据库，以及从其他数据库接收数据。通讯单元可以包括调制解调器、以太网卡或能够使计算机***连接数据库和网络的任何相似设备，例如，LAN、MAN、WAN和互联网。计算机***因此有利于从使用者通过输入设备输入，通过I/O接口访问***。
计算设备通常将包括提供用于一般管理和操作计算设备的可执行程序指令的操作***，并且通常将包括存储指令的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，当通过服务器的处理器执行时，允许计算设备进行其预定的功能。用于计算设备的操作***和一般功能性的合适实施是已知的或可商购获得的，并且容易由本领域普通技术人员实施，特别是根据本文中的公开内容。
计算机***执行一套存储在一个或多个存储元件中的指令以处理输入数据。存储元件还可以按照需要容纳数据或其他信息。存储元件可以是存在于处理机中的信息源或物理存储元件的形式。
环境可以包括如上讨论的各种数据存储以及其他存储器和存储介质。这些可以存在于各种位置，例如，在一个或多个计算机本地(和/或存在于内部)的存储介质上或通过网络远程来自任一个或全部计算机。在特定组的实施方案中，信息可以存在于本领域技术人员熟悉的存储区网络(“SAN”)。类似地，用于执行归属于计算机、服务器或其他网络设备的功能的任何所需文件可以本地和/或远程存储，按照需要。在***包括计算设备的情况下，每个这样的设备可以包括可以通过总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这样的***还可以包括一个或多个存储设备，例如，磁盘驱动器、光存储设备和固态存储设备，例如，随机存取存储器(“RAM”)或只读存储器(ROM”)，以及可移动介质设备、存储卡、闪卡等。
这样的设备还可以包括如上所述的计算机可读存储介质读取器、通讯设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通讯设备等)和工作存储器。计算机可读存储介质读取器可以连接计算机可读存储介质或配置成接收计算机可读存储介质，所述存储介质表示远程、本地、固定的和/或可移动的存储设备以及用于临时和/或更永久地含有、存储、传输和接收计算机可读信息的存储介质。***和各种设备通常还将包括一些软件应用、模块、服务器或位于至少一个工作存储设备内的其他元件，包括操作***和应用程序，例如，客户应用程序或Web浏览器。应当理解，替代实施方案可以具有来自上述的多种变体。例如，还可以使用定制的硬件和/或可以在硬件、软件(包括便携式软件，例如，小应用程序)或两者中进行特定元件。此外，可以使用与其他计算设备(例如，网络输入/输出设备)的连接。
用于包含编码或部分编码的非瞬态存储介质和计算机可读介质可以包括本领域已知或使用的任何合适介质，包括存储介质和通讯介质，例如但不限于在任何方法或技术中实施用于存储和/或传送信息(例如，计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的易变和非易变、可移动和不可移动的介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其他光学存储、磁盒、磁带、磁盘存储或其他磁存储设备，或可以用于存储所需信息并可以由***设备访问的任何其他介质。基于本文中提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将理解用于实施各种实施方案的其他方式和/或方法。
计算机可读介质可以包括，但不限于，能够向处理器提供计算机可读指令的电、光、磁或其他存储设备。其他实例包括，但不限于，软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、闪存(例如，NAND闪存或NOR闪存)、ASIC、配置的处理器、光存储器、磁带或其他磁存储，或计算处理器可以从其读取指令的任何其他介质。在一个实施方案中，计算设备可以包括单一类型的计算机可读介质，例如，随机存取存储区(RAM)。在其他实施方案中，计算设备可以包括两种或更多种类型的计算机可读介质，例如，随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和高速缓冲存储器。计算设备可以联通一个或多个外部计算机可读介质，例如，外部硬盘驱动器或者外部DVD或Blu-Ray驱动器。
如以上讨论的，实施方案包括配置成执行计算机可执行程序指令和/或访问存储在存储器中的信息的处理器。指令可以包括由编译器和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言编写的代码生成的处理器特定指令，所述计算机编程语言包括，例如，C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems,MountainView，Calif.)。在一个实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其他实施方案中，设备包括两个或更多个处理器。这样的处理器可以包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。这样的处理器可以进一步包括可编程电子设备，例如，PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑设备(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电子可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)，或其他类似的设备。
计算设备包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置成通过有线或无线通讯链接来通讯。例如，网络接口可以允许通过以太网、IEEE802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外等通过网络通讯。作为另一个实例，网络接口可以允许通过例如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窝通信网络的网络来通讯。在一些实施方案中，网络接口可以允许与另一个设备点对点连接，例如，通过通用串行总线(USB)、1394FireWire、串联或并联，或相似接口。合适的计算设备的一些实施方案可以包括两个或更多个网络接口，用于通过一个或多个网络的通讯。在一些实施方案中，除了网络接口以外或替代网络接口，计算设备可以包括数据存储。
合适的计算设备的一些实施方案可以包括多种外部或内部设备或与多种外部或内部设备通讯，所述设备例如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、扬声器、一个或多个麦克风，或者任何其他输入或输出设备。例如，计算设备可以与各种使用者接口设备和显示器通讯。显示器可以使用任何合适的技术，包括但不限于，LCD、LED、CRT等。
用于通过计算机***执行的指令集可以包括指示处理机进行特定任务(例如，组成本发明技术的方法的步骤)的各种命令。指令集可以是软件程序的形式。此外，软件可以是分开的程序的集合、具有更大程序的程序模块或程序模块的部分的形式，如在本文中的技术中。软件还可以包括以面向对象编程形式的模块编程。通过处理机的输入数据的处理可以是响应使用者命令、之前处理的结果或由另一个处理机作出的要求。
尽管已经参照某些实施方案公开了本发明，在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围和精神的情况下，对所述实施方案的多种修改、变化和改变都是可能的。因此，认为本发明不限于所描述的实施方案，而是具有由以下权利要求的语言限定的完整范围及其等价体。
实施例
在以下实施例中描述的结果证明了在得到结果的缩短时间内检测到少量细胞，甚至是单个细菌。
实施例1.在培养基中孵育样品后，使用金黄色葡萄球菌特异性噬菌体NanoLuc指示物噬菌体进行细菌检测
通过向丰富培养基中添加135μl含有金黄色葡萄球菌的样品来使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的样品产生易感性。丰富培养基包含亚抑制性抗生素(头孢西丁)以允许MRSA的特异性富集和诱导。将样品在丰富培养基中孵育1-2小时。使样品易感后，将另外的头孢西丁添加到培养基中并将样品孵育另外的2小时。将金黄色葡萄球菌特异性噬菌体NanoLuc指示物噬菌体添加到样品中并孵育2小时。添加裂解缓冲液和
Figure BDA0002740551510000481
试剂。孵育5分钟后，使用
Figure BDA0002740551510000482
96仪器进行生物发光测量。信号/背景比≥750RLU指示金黄色葡萄球菌的阳性检测。信号/背景比<750RLU指示样品对金黄色葡萄球菌呈阴性。
表1.1噬菌体介导的金黄色葡萄球菌的检测
Figure BDA0002740551510000491
Figure BDA0002740551510000501
表1.2噬菌体介导的金黄色葡萄球菌的检测
Figure BDA0002740551510000502
Figure BDA0002740551510000511
表1.3噬菌体介导的金黄色葡萄球菌的检测
Figure BDA0002740551510000512
Figure BDA0002740551510000521
表1.4噬菌体介导的金黄色葡萄球菌的检测
Figure BDA0002740551510000522
表1.5噬菌体介导的金黄色葡萄球菌的检测
Figure BDA0002740551510000523
实施例2.在培养基中孵育样品后，使用葡萄球菌属特异性噬菌体
Figure BDA0002740551510000531
指示物噬菌体诊断和监测葡萄球菌属感染
从患者获得临床样品。将临床样品与葡萄球菌属特异性噬菌体
Figure BDA0002740551510000532
指示物噬菌体孵育2小时。孵育后，添加裂解缓冲液和
Figure BDA0002740551510000533
试剂。与裂解缓冲液和
Figure BDA0002740551510000534
试剂孵育5分钟后，使用
Figure BDA0002740551510000535
96仪器测量生物发光以确定葡萄球菌属存在于临床样品中。信号/背景比≥750RLU指示葡萄球菌属的阳性检测。信号/背景比<750RLU指示样品对葡萄球菌属呈阴性。
具有对葡萄球菌属呈阳性的样品的患者用对葡萄球菌属具有特异性的治疗性噬菌体治疗。用对葡萄球菌属具有特异性的治疗性噬菌体治疗72小时后，从患者获得第二临床样品。然后将临床样品与葡萄球菌属特异性噬菌体
Figure BDA0002740551510000536
指示物噬菌体孵育2小时。孵育后，添加裂解缓冲液和
Figure BDA0002740551510000537
试剂并孵育5分钟。然后，使用
Figure BDA0002740551510000538
96仪器测量生物发光，以监测治疗后临床样品中葡萄球菌属存在的变化。信号/背景比≥750RLU指示葡萄球菌属的阳性检测。信号/背景比<750RLU指示样品对葡萄球菌属呈阴性。如果样品对葡萄球菌属呈阳性，继续使用对葡萄球菌属具有特异性的治疗性噬菌体的治疗并继续使用葡萄球菌属特异性噬菌体
Figure BDA0002740551510000539
指示物噬菌体监测治疗功效。

Claims (36)

1.一种重组噬菌体，其包含***到噬菌体基因组的晚期基因区域中的指示基因。
2.权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体特异性感染葡萄球菌属(Staphylococcus)。
3.权利要求2所述的重组噬菌体，其中所述葡萄球菌属是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
4.权利要求3所述的重组噬菌体，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林的。
5.权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述指示基因是密码子优化的并且编码产生内在信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。
6.权利要求5所述的重组噬菌体，其进一步包含在密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
7.一种混合物组合物，其包含至少两种不同类型的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体中的至少一种包含根据权利要求1所述的指示基因。
8.一种制备重组指示物噬菌体的方法，其包括：
选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；
制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；
将所述同源重组质粒/载体转化到靶病原菌；
用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而使所述质粒/载体和所述噬菌体基因组之间发生同源重组；和
分离重组噬菌体的特定克隆。
9.权利要求8所述的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括：
确定选择的噬菌体的基因组的晚期区域中的天然核苷酸序列；
注释所述基因组并鉴定所述选择的噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计用于所述主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列，其中所述序列包含密码子优化的指示基因；和
将设计用于同源重组的所述序列掺入质粒/载体中。
10.权利要求9所述的方法，其中设计序列进一步包括在所述密码子优化的指示基因的上游***非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
11.权利要求8所述的方法，其中所述同源重组质粒包含在所述密码子优化的指示基因上游的非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
12.权利要求8所述的方法，其中所述野生型噬菌体是葡萄球菌属特异性噬菌体并且所述靶病原菌是葡萄球菌属。
13.权利要求12所述的方法，其中所述葡萄球菌属是金黄色葡萄球菌。
14.权利要求13所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林的(MRSA)。
15.权利要求8所述的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明指示基因表达的克隆的有限稀释测定法。
16.一种用于检测样品中的葡萄球菌属的方法，其包括：
将所述样品与衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体的重组噬菌体孵育，所述重组噬菌体包含***到噬菌体基因组的晚期基因区域中的指示基因；和
检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测指示葡萄球菌属存在于所述样品中。
17.权利要求16所述的方法，其中所述葡萄球菌属是金黄色葡萄球菌。
18.权利要求17所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林的。
19.权利要求16所述的方法，其中所述样品是食品样品、环境样品、水样品、商业样品或临床样品。
20.权利要求16所述的方法，其中所述方法检测食品安全行业的标准尺寸的样品中的少至10、9、8、7、6、5、4、3、2个或单个细菌。
21.权利要求19所述的方法，其中所述食品样品包括肉、鱼、蔬菜、蛋或婴儿配方粉。
22.权利要求16所述的方法，其中所述样品与包含至少两种不同类型的重组噬菌体的混合物组合物孵育，其中所述重组噬菌体中的至少一种包含根据权利要求16所述的指示基因。
23.权利要求16所述的方法，其中首先将所述样品在有利于生长的条件下孵育9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少或2小时或更少的富集时间。
24.权利要求16所述的方法，其中得到结果的总时间小于12小时、小于11小时、小于10小时、小于9小时、小于8小时、小于7小时或小于6小时。
25.权利要求16所述的方法，其中通过检测所述指示物生成的信号背景比是至少2.0或至少2.5。
26.一种用于检测葡萄球菌属的试剂盒，其包括衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
27.权利要求26所述的试剂盒，其中所述葡萄球菌属是金黄色葡萄球菌并且所述葡萄球菌属特异性噬菌体是金黄色葡萄球菌特异性噬菌体。
28.权利要求27所述的试剂盒，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林的并且所述金黄色葡萄球菌特异性噬菌体是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌特异性噬菌体。
29.权利要求26所述的试剂盒，其进一步包括用于与指示物反应以检测由所述重组噬菌体表达的可溶性蛋白质产物的底物。
30.一种用于检测葡萄球菌属的***，其包括衍生自葡萄球菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
31.权利要求30所述的***，其中所述葡萄球菌属是金黄色葡萄球菌。
32.权利要求31所述的***，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林的。
33.一种用于选择用于受试者的治疗的方法，其包括：
(i)从所述受试者获得生物样品；
(ii)使用指示物噬菌体检测所述生物样品中的特定微生物或微生物类别；和
(iii)基于在所述生物样品中检测到的特定微生物的鉴定来选择治疗。
34.权利要求33所述的方法，其中所述指示物噬菌体是合成制备的噬菌体。
35.权利要求33所述的方法，其中所述指示物噬菌体是遗传修饰的天然存在的噬菌体。
36.一种用于监测患有致病性医学病况的受试者的治疗功效的方法，其包括：
(i)从所述受试者获得生物样品；
(ii)使用指示物噬菌体检测所述生物样品中的特定微生物或微生物类别；
(iii)开始用于所述受试者的治疗；
(iv)从所述受试者获得与第一生物样品相同类型的第二生物样品；
(v)使用所述指示物噬菌体检测所述第二生物样品中的所述特定微生物或微生物类别；和
(vi)基于在所述第一生物样品和第二生物样品中检测到的量确定所述受试者中所述特定微生物或微生物类别的减少、增加或稳定水平。
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