CN101067600A - 水产病原菌群体感应信号分子的检测方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水产病原菌群体感应信号分子的检测方法及其专用试剂盒。该方法，包括将受试菌进行如下实验：1)与根癌农杆菌A136在添加了X－Gal或ONPG的平板上共同划线培养，观察是否显示蓝色；2)与紫色杆菌CV026在同一平板上划线培养，观察是否显示紫色；3)将受试菌划线接种于含500nM N－酰化高丝氨酸内酯的LB平板上培养，再将紫色杆菌CV026分别在受试菌划线旁平行划线，观察是否显示紫色变浅或褪去；4)与Esc.coli pSB403在平板上共同划线培养，观察是否发光；上述实验中，如果至少有一项实验显示阳性，则受试菌产生N－酰化高丝氨酸内酯。本发明方法准确率高，没有假阴性现象，易于定性定量分析，操作简便，成本低，获得结果迅速，适合大规模高效率检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法及其专用试剂盒。
背景技术
我国每年由细菌性病害所导致的水产养殖经济损失高达500亿元，水产病原菌主要为革兰氏阴性菌(姜兰，等.中国水产科学.9(2)：152-156，2002)，常见的包括Vibrio anguillarum、Aeromonas salmonicida、Aeromonas hydrophila、Yersiniaruckeri、Vibrio salmonicida、Vibrio vulnificus、Aeromonas salmonicida及Vibrio splendidus等(Jesper B.B.et al.Dis Aquat Org.65：43-52，2005)，这些病原菌均与水环境相关，与目前研究较多的植物性病原菌应区别开来(高轶静，南京农业大学硕士学位论文，中慢生华葵根瘤菌的群体感应***对其生长和共生结瘤的影响，2006)。常规化学药剂及抗生素的使用由于存在环境污染、食品安全隐患、诱导耐药菌株等风险，水产养殖实践中迫切需要开发新的防治途径与药物。
1994年，Fuqua等首次提出“群体感应(quorum sensing，简写QS)”一词来描述细菌细胞特定形式的分子通讯，即细菌产生信号分子并释放到环境中去，当环境中的信号分子达到一定的浓度后诱导细胞密度信赖的特定基因的表达，从而展现出新的行为特征(Fuqua W.G.et al.，Journal of Bacteriology.176：269-275，1994)。由信号分子介导的细胞-细胞间信号可调节细菌的许多功能，如抗生素的生物合成、毒性因子的产生、质粒结合转移等(陈峰.上海农业学报.21(1)：98-102，2005)，因此，群体感应途径成为了生物防治和治疗细菌性病害的新突破口，为解决目前因传统抗生素的滥用而日趋严重的耐药性问题提供了新的靶点(Lars R.et al.Journalof Microbiological Methods.44：239-251，2001)，也是目前国际上的热点研究议题。例如：通过合成一些群体感应信号分子结构类似物，与相应的受体蛋白竞争性结合，如海洋红藻(Delisea pulchra)能够产生一种和信号分子(N-酰化高丝氨酸内酯)结构类似的卤化呋喃酮(halogenated furanones)，将此物质与费氏弧菌V.fischeri一起培养会促进LuxR(一种信号分子受体蛋白)的降解，并因此破坏其QS行为(Haviv Y.S.et al.Cancer Res.62(15)：4273-4281，2002)，从而达到病害控制的目的。
对革兰氏阴性(G-)菌而言，大多数的这类信号分子都属于N-酰化高丝氨酸内酯(Acylated Homoserine Lactone，AHL)，其结构含有高丝氨酸内酯环和4-14个碳的酰基侧链，侧链的第三个碳原子被氧或羟基取代，或者是没有被取代，换言之，它们之间的主要区别在于N-侧链的长度，或3-碳位置的取代基的不同，或侧链中有无一个或多个不饱和键(Camara M.et al.Methods in Microbiol.27：319-330，1998)。对于AHLs的检测与鉴定，是通过群体感应途径进行水产病原菌控制研究的基础。
由于群体感应信号分子的浓度极低，一般手段无法检测出来。近年来采用了对扩散性信号分子敏感的微生物作为生物检测菌，使得对信号分子的快速生物检测成为可能。多数用于生物检测的菌是无法自身合成AHL的突变株，而当有外源AHL加入后才能表现出野生型的表型(陈峰.上海农业学报.21(1)：98-102，2005)。然而，已发表的生物报告***比较单一(詹克航，等.中华医学杂志.86(37)：2655-2658，2006)，在检测范围与准确率上均存在一定限制，并且会出现假阴性的报道(杨梦华，等.微生物学报.46(6)：1007-1010，2006)。有关水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的鉴定尚未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法及其专用试剂盒。
本发明提供的水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒，包括根癌农杆菌(Agrobac terium tumefaciens)A136、紫色杆菌(Chromobac terlerviolaceum)CV026、N-酰化高丝氨酸内酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)或邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)、和大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403。
为了使所述试剂盒的检测结果更加准确可信，所述试剂盒还包括阳性对照菌株液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01和费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1。
所述N-酰化高丝氨酸内酯可为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-C10-HSL、C8-HSL、3-Oxo-C8-HSL、3-Oxo-C12-HSL、3-Hydroxy-7-C14-HSL、C4-HSL、3-Hydroxy-C4-HSL和3-OH-C12-HSL(3-羧基十二碳-N-1-高丝氨酸内酯，OHHL)中的一种或一种以上任意组合。
本发明提供的革兰氏阴性病原菌产群体感应信号分子的快速检测方法，包括将受试菌进行如下所述四项实验：
1)将所述受试菌与报告菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136在同一添加了X-Gal或ONPG的固体平板上共同划线培养，观察根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136菌体是否显示蓝色，如果显示蓝色即为阳性，反之为阴性；
2)将所述受试菌与报告菌株紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026在同一固体平板上共同划线培养，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色，如果显示紫色即为阳性，反之为阴性；
3)将所述受试菌划线接种于含500nM N-酰化高丝氨酸内酯的LB平板上培养24-48小时，再将报告菌株紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026在受试菌划线旁平行划线，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色变浅或褪去，如果显示紫色变浅或褪去即为阳性，反之为阴性；
4)将所述受试菌与报告菌株大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403在固体平板上共同划线培养，观察大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403菌体是否发光，如果发光即为阳性，反之为阴性；
上述四项实验中，如果至少有一项实验显示阳性，则判断受试菌产生N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)群体感应信号分子，反之，则判断受试菌不产生N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)群体感应信号分子。
所述N-酰化高丝氨酸内酯可为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-C10-HSL、C8-HSL、3-Oxo-C8-HSL、3-Oxo-C12-HSL、3-Hydroxy-7-C14-HSL、C4-HSL、3-Hydroxy-C4-HSL和3-OH-C12-HSL(3-羧基十二碳-N-1-高丝氨酸内酯，OHHL)中的一种或一种以上任意组合。
所述方法中，还包括将检测表明产生AHLs群体感应信号分子的受试菌进行大量培养，提取AHLs信号分子，用该信号分子与受试菌反应阳性的报告菌株反应，结合薄层色谱法进行定性检测。
所述方法中，还包括将所述提取的AHLs信号分子利用井式生物扩散法测定AHLs活性。
受试菌大量培养所用培养基为ABT培养基，所述ABT培养基为含有0.4g/L(NH4)2SO4、0.6g/L Na2HPO4、0.3g/L KH2PO4、0.3g/L NaCl、1mmol/L MgCl2、0.1mmol/LCaCl2、0.01mmol/L FeCl3、2.5mg/L硫胺、质量百分含量为0.5％葡萄糖和质量百分含量为0.5％酸水解酪素的培养基；所述提取AHLs信号分子的方法是用在受试菌培养液的上清液中加入乙酸乙酯萃取得到AHLs。
所述薄层色谱法是将受试菌产生的AHLs提取物与标准品在薄层色谱板上点样，用甲醇溶液展开，然后利用与受试菌反应阳性的报告菌株检测其变色或发光位点，确定具体受试菌产生的AHL；当上述实验1)反应阳性时，所述薄层色谱法检测的标准品为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL和3-Oxo-C10-HSL等；当上述实验2)反应阳性时，所述薄层色谱法检测的标准品为C4-HSL，3-Hydroxy-C4-HSL等；当上述实验3)反应阳性时，所述薄层色谱法检测的标准品为C8-HSL，3-Oxo-C8-HSL，3-Oxo-C12-HSL，3-Hydroxy-7-C14-HSL等；当上述实验4)反应阳性时，所述薄层色谱法检测的标准品为3-羧基十二碳-N-1-高丝氨酸内酯(OHHL)。
所述方法中，所述受试菌是从病鱼和/或养殖水体和/或养殖底泥中分离获得。
所述方法中，所述固体平板为固体LB平板；所述受试菌与报告菌株共同划线培养的方法是使受试菌与报告菌株在同一平板上培养，菌落距离为1cm以下，所述方法优选为两株菌平行划线；所述受试菌与报告菌株共同培养的温度为25℃，培养的时间为24小时。
所述添加了X-Gal的固体平板中X-Gal的浓度为30-80μg/ml，优选为50.0μg/ml；所述添加了邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)的固体平板中邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)的浓度为40-80μg/ml，优选为60μg/ml；添加了N-酰化高丝氨酸内酯的固体平板中N-酰化高丝氨酸内酯的浓度为400-600nmol/L，优选为500nmol/L。
所述方法中，还包括与所述四项实验同步进行的对照实验，所述四项实验中，均以所述报告菌株单独划线培养为阴性对照；所述1)和3)中，以绿脓杆菌(P.aeruginosa)PA01单独划线培养或者与受试菌共同划线培养为阳性对照，所述2)中，以液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1单独划线培养或者与受试菌共同划线培养为阳性对照，所述4)中，以费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1单独划线培养或者与受试菌共同划线培养为阳性对照。
本发明的三株报告菌株：
报告菌株之一根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136，含有traG：lacZ融合基因以及traR基因(Fuqua C.and Winans S.C.J Bacteriol.178：435-440，1996)。本身不产生AHLs，外源AHLs可诱导lacZ基因大量表达，水解X-Gal、ONPG(邻硝基酚β-D-半乳糖苷)等底物，产生明显的颜色变化(Shaw P.D.et al.，ProcNatl Acad Sci USA.94：6036-6041，1997)。该报告菌株检测谱较广，对绝大多数Oxo-、Hydroxy-、Unsubstituted等HSL检测敏感，但对C4-HSL等不敏感(Shaw P.D.et al.Proc Natl Acad Sci USA.94：6036-6041，1997)。
报告菌株之二紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026，它产生紫色色素的能力由AHLs调控的，该细菌缺失合成AHLs的功能基因，不能合成AHLs，不产生紫色色素，而当有外源AHLs分子时，其限制酶CviR产生紫色色素(Throup J.P.etal.Bioluminescence and Chemi luminescence：Fundamental and Appl ied Aspects.89-92，1995)。该报告菌主要对短链或中链Alkanoyl-AHLs检测敏感(McClean K.H.et al.，Microbiology.143：3703-3705，1997)；呈显色状态(添加外源AHLs，如N-hexanoyl-L-homoserine lactone(HHL))的紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026，由于一些长链AHLs可抑制限制酶CviR，故当培养基中加入长链AHLs时所积累的紫色杆菌素量将会较少(Throup J.P.et al.Bioluminescence andChemiluminescence：Fundamental and Applied Aspects.89-92，1995)。
报告菌株之三大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403，基于lux R构建，自身不能够分泌3-羧基十二碳-N-1-高丝氨酸内酯(OHHL)，而在外源OHHL条件下可诱发生物发光(Lars R.et al.Journal of Microbiological Methods.44：239-251，2001)。
实验证明，本发明的方法检测水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子(AHLs)准确率高，没有假阴性现象，可进行定性与定量分析。另外本发明的方法利用共同划线培养的方法检测，操作简便，成本低，获得结果迅速，适合大规模高效率检测。根据本发明的方法所有的菌株和材料制成的专用的试剂盒更方便了操作。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，所有实验均在无菌条件下进行。
下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明的方法，用下述三种报告菌株经组合成检测***：
报告菌株一：
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136(购自Oxoid，West Heidelberg，Victoria，Australia)。
报告菌株二：
紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026(Hach Company，Loveland，Colo.USA)。
与呈显色状态(添加HHL)的紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026(HachCompany，Loveland，Colo.USA)。
报告菌株三：
大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403(D IFR，TUD，DK-2800Kgs Lyngby，Denmark)。
实施例1、一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法
1、水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒的制备
1)报告菌株的培养
将上述报告菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136在添加4.5μg/ml(终浓度)四环素、50.0μg/ml(终浓度)奇霉素的LB固体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母浸出物，0.5％NaCl，1.2％琼脂)上划线，在25℃培养1天；
将紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026在添加20.0μg/ml(终浓度)卡那霉素的LB固体培养基上划线，在25℃培养1天；
将大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403添加四环素20.0μg/ml(终浓度)的LB固体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母浸出物，0.5％NaCl，1.2％琼脂)上划线，在25℃培养1天。
2)阳性对照菌株的培养
阳性对照菌株液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1(DIFR，TUD，DK-2800Kgs Lyngby，Denmark)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01(DIFR，TUD，DK-2800 Kgs Lyngby，Denmark)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1(DIFR，TUD，DK-2800Kgs Lyngby，Denmark)分别在LB固体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母浸出物，0.5％NaCl，1.2％琼脂)上划线，在25℃培养1天。
3)水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒的制备
将步骤1)培养的报告菌株(每个菌株一个划线平板)、步骤2)培养的阳性对照菌株(每个菌株一个划线平板)、20mg/ml X-Gal溶液，5ml、和N-己酰高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone，HHL)1μg组合成配套使用的快速检测试剂盒。
为了菌株方便保存，其中，各菌株也可用液体LB培养基在25℃摇培至0D值为0.2-0.6后，收集菌液，加入体积百分含量为20％(终浓度)的甘油，方便低温(-80℃)保存。试剂盒中的各试剂也可根据用量调节。
2、水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测
1)水产革兰氏阴性病原菌的分离和培养
从患有爆发性弧菌病的川纹笛鲷(Lutjanus sebae)，取自广东省湛江市东海岛海水养殖网箱，分离方法同文献(莫照兰等.微生物学报.42(3)：263-269，2002)，结果得到一株革兰氏阴性病原菌，经形态特征、生长条件上、生理生化、16S rRNA序列分析(莫照兰等.微生物学报.42(3)：263-269，2002)、和单克隆抗体免疫荧光技术进行血清型分析鉴定(余俊红等.海洋水产研究.23(2)：38-44，2002)，结果表明分离得到的革兰氏阴性病原菌为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01(可购自Oxoid，West Heidelberg，Victoria，Austral ia)。
将该病原菌株鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01接种在ABT培养基(1L ABT成分含量：0.4g(NH4)2SO4、0.6g Na2HPO4、0.3g KH2PO4、0.3g NaCl、1mM MgCl2、0.1mMCaCl2、0.01mM FeCl3、2.5mg硫胺含0.5％葡萄糖和0.5％酸水解酪素)上，在25℃培养1天，作为受试菌备用。
另外，我们从浙江嘉兴地区养殖池塘底泥中分离到嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)C2(可购自Oxoid，West Heidelberg，Victoria，Australia)，从浙江嘉兴地区养殖池塘草鱼肠道内分离到嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3(可购自Oxoid，West Heidelberg，Victoria，Australia)，从天津罗非鱼体表分离到杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01(可购自Oxoid，West Heidelberg，Victoria，Australia)(分离和鉴定方法同鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01的分离和鉴定方法)。
2)水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子(AHLs)的快速检测
利用步骤1制备的试剂盒或者直接用需要的菌株和试剂，用平行划线法检测受试病原菌是否产生AHLs，具体操作如下：
①将步骤1)得到的受试菌(鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C2、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3或杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01)分别与报告菌株紫色杆菌(Chromobacterlerviolaceum)CV026在3.5cm LB平板上平行划线，使两株菌菌落间的距离不超过1cm，液化沙雷氏菌(Serra tia Liquefaciens)MG1作为阳性对照菌单独在3.5cm LB平板与报告菌株平行划线，紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026单独在3.5cm LB平板上平行划线作为阴性对照，将划线的平板均在25℃培养24h。培养后，观察培养基上菌体的颜色变化。记录紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026菌体是否显示紫色，如果显示紫色即为阳性，反之不显紫色为阴性；
②将步骤1)得到的受试菌(鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C2、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3或杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01)分别划线接种于含500nM N-己酰高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone，HHL)的LB平板上，25℃培养24h，再将报告菌株紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026分别在受试菌划线旁平行划线，使两株菌菌落间的距离不超过1cm，然后继续于25℃下培养24h。绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01作为阳性对照，紫色杆菌(Chromobac terlerviolaceum)CV026单独在3.5cm LB平板上平行划线后25℃培养48h作为阴性对照，观察培养基上菌体的颜色变化。记录紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色变浅或褪去，如果显示紫色变浅或褪去即为阳性，反之如果紫色未变浅或褪去为阴性；
③将步骤1)得到的受试菌(鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C2、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3或杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01)分别与大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403平行划线于LB平板上，使两株菌菌落间的距离不超过1cm，25℃培养24h。费氏弧菌Vibrio fischeriMJ1，25℃培养24h，作为阳性对照菌单独在3.5cm LB平板与报告菌株平行划线。大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403单独在3.5cm LB平板上平行划线后25℃培养24h作为阴性对照。由光学照相机拍摄并记录生物发光现象。记录大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403菌体是否发光，如果发光即为阳性，反之如果不发光为阴性。
④将步骤1)得到的受试菌株(鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C2、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3或杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01)与根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)A136在含50.0μg/ml X-Gal的LB平板上平行划线，使两株菌菌落间的距离不超过1cm，25℃培养24h。绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01，25℃培养24h，作为阳性对照菌单独在3.5cm LB平板与报告菌株平行划线；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136单独在3.5cm LB平板上平行划线后25℃培养24h作为阴性对照。观察培养基上菌体的颜色变化，记录根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136菌体是否显示蓝色，如果显示蓝色即为阳性，反之为阴性。
上述检测中，如果受试菌至少有一项检测显示阳性，则判断该受试菌产生N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)群体感应信号分子，反之，则判断受试菌不产生N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)感应信号分子。其中，步骤③检测经判断存在发光反应，可直接断定AHLs为OHHL，对于其它反应需进一步鉴定。
上述测试结果表明，上述受试菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01与根癌农杆菌A136表现明显蓝色，其余呈阴性反应，证明鳗弧菌01存在群体感应信号分子AHLs，其特性报告菌株为根癌农杆菌A136。而目前常用水产革兰氏阴性致病菌AHLs仅依靠紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026与呈显色状态(添加HHL)的紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026双重检验，这样检测结果为阴性，则判断错误。全部上述受试菌检测结果如下表1，不难看见单一检测***容易导致假阴性结果，并且物理学的检测手段需要通过高效液相色谱技术进行检测，样品纯化要求高，在作定性分析时还需要通过质谱和核磁共振等仪器设备，不适当大规模鉴定与筛选使用(Bruhn et al.Dis Aquat Org.65：43-52，2005)。
表1 不同受试水产病原菌群体感应信号分子检测结果
| 受试菌 | 检测结果 | |||
| C.violaceumCV026 | C.violaceumCV026+HHL | Escherichiacoli pSB403 | A.tumefaciensA136 | |
| V.anguillarum 01 | - | - | - | + |
| A.hydrophila C2 | - | + | - | - |
| A.hydrophila C3 | + | - | + | - |
| A.salmonicida T01 | - | - | + | - |
表中，+表示反应阳性；-表示无明显反应，阴性。
3、AHLs提取
将上述受试菌株(鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)C2，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3或杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01)分别接种于ABT培养基，在25℃、150rpm下培养24h。8000g离心30s，分别取上清10ml，加入等体积的乙酸乙酯(另加入终浓度为0.5％的蚁酸进行酸化)，充分振荡30s，重复三次，吸取有机相后再加入10ml的乙酸乙酯进行相同处理，重复两次，将三次吸取液合并，于旋转蒸发仪蒸干并回溶至2ml经酸化乙酸乙酯中，再次蒸干后分别溶至500μl经酸化乙酸乙酯中，-20℃下保存备用。
4、井式生物扩散法测定AHLs活性
通过与受试菌共同培养显阳性的报告菌株来测定AHLs活性。具体方法如下所述：
1)含有报告菌株的平板制备：
将生物报告菌株(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136)、紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026、大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403分别接种到报告菌株根癌农杆菌A136在添加抗生素的LB培养液中，在25℃有氧条件下培养24h得到培养液。其中，根癌农杆菌A136用抗生素为4.5μg/ml(终浓度)四环素和50.0μg/ml(终浓度)奇霉素；紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026用抗生素为20.0μg/ml(终浓度)卡那霉素；大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403用抗生素20.0μg/ml(终浓度)四环素。将得到的培养液分别用于如下处理：
取1ml根癌农杆菌A136培养液接种到50ml ABT培养液中，在25℃曝气条件下培养24h，然后将培养液全部倒入装有100ml 46℃添加有1.2％琼脂和75μg/ml X-gal的ABT培养基(液体)的三角瓶中摇匀，再迅速将按20ml/皿的量倒入培养皿中得到含有根癌农杆菌A136的平板。
取2份1ml紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026的LB培养液，分别接入50ml LB培养液中，在25℃曝气条件下培养24h，然后将培养液分别倒入装有100ml 46℃添加1.2％琼脂的LB培养基(液体)或添加1.2％琼脂和75nMN-hexanoyl-L-homoserine lactone(HHL)的LB培养基(液体)的三角瓶中摇匀，再迅速将按20ml/皿的量倒入培养皿中得到含有紫色杆菌(Chromobacterlerviolaceum)CV026的平板或含有紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026和HHL的平板。
取1ml大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403LB培养液，接入50ml LB培养液中，在25℃曝气条件下培养24h，然后将培养液倒入装有100ml 46℃添加1.2％琼脂的LB培养基(液体)的三角瓶中摇匀，再迅速将按20ml/皿的量倒入培养皿中得到含有大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403的平板。
上述所有培养基中均加有相应的抗生素，其中，根癌农杆菌(Agrobac teriumtumefaciens)A136用抗生素为4.5μg/ml(终浓度)四环素和50.0μg/ml(终浓度)奇霉素；紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026用抗生素为20.0μg/ml(终浓度)卡那霉素；大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403用抗生素20.0μg/ml(终浓度)四环素。
2)点样测定：将上述步骤1)得到的平板，在中心区刺成6mm小孔(点样孔)，将步骤3得到的各受试菌的AHLs提取物(Ai；浓度Ci)或合成HHLs(Sigma；选择通过步骤5进行AHLs快速定性检测时判定的最大成分AHL作为活性检测标准物，各受试菌的AHLs提取物的活性检测标准物具体如表2所示)(Ao；浓度Co＝1500nM)(对照)分别点样于与其反应可显阳性的平板的小孔中，点样量分别为60μl。点样后，分别将平板置于25℃培养48h后测量变色圈直径(Ri(AHLs提取物变色圈直径)与Ro(合成HHLs变色圈直径)，mm)。
则：各受试菌的AHLs提取物的活性(浓度)计算公式为Ci(nM)＝Co(nM)×Ri(mm)/Ro(mm)检测结果如表2所示。
表2.不同受试水产病原菌群体感应信号分子AHL成分与活性
| 受试菌 | TLC检测标准物(HSL) | TLC结果(HSL) | 活性检测标准物 | 活性和定性检测平板所含报告菌和辅助成分 | AHL活性(nM) |
| V.anguillarum 01 | 3-OH-C6、3-OH-C8、3-OH-C10、3-Oxo-C10 | 3-OH-C6、3-Oxo-C10 | 3-OH-C6 | A.tumefaciensA136 | 1230.0 |
| A.hydrophila C2 | C8，3-Oxo-C8，3-Oxo-C12，3-Hydroxy-7-C14 | 3-Oxo-C8、3-Hydroxy-7-C14 | 3-Hy dr oxy-7-C14 | C.violaceumCV026+HHL | 870.2 |
| A.hydrophila C3 | C4，3-Hydroxy-C4，OHHL | C4，OHHL | OHHL | Escherichiacoli pSB403 | 435.7 |
| A.salmonicida T01 | OHHL | OHHL | OHHL | Escherichiacoli pSB403 | 1895.0 |
注：HSL为Homoserine Lactone，高丝氨酸内酯；OHHL为3-羧基十二碳-N-1-高丝氨酸内酯.
5、AHLs快速定性检测
通过薄层色谱(TLC)进行AHLs定性检测：
按照表2所示的各受试菌株的标准物鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01产生的信号分子使根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136变色，因此选择3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL及3-Oxo-C10-HSL(Sigma)为AHLs标准液(600pmol)；其余受试菌也按照此原则选择AHLs标准物，具体如见表2所示。
将2μl上述检测阳性的受试菌(鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C2，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)C3，杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)T01)AHLs提取物或AHLs相应的标准液(受试菌AHLs提取物相应的检测标准物见表2，各600pmol)分别点样在C18反相薄层色谱板(20cm×20cm，TLC，Darmstadt，Germany)上，每个受试菌AHLs提取物样品或其标准液分别点在一张C18反相薄层色谱板上。将色谱板分别置于10ml甲醇溶液(60％，体积百分含量)中充分展开，待展开前沿接近色谱板边沿时(约4h)，将色谱板取出，干燥10min。
按照步骤4的步骤1)的方法制备表2所示含有报告菌株和辅助成分的平板，分别铺于点样有表2所示相应受试菌的AHLs提取物或AHLs相应的标准液的C18反相薄层色谱板上，待凝固后，置于密闭容器中25℃培养48h。
将各受试菌的AHLs提取物样本发光位点与其标准液的发光位点相比较，发现鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01含有的AHLs为3-OH-C6及3-Oxo-C10。其余受试菌检测方法同鳗弧菌(Vibrio anguillarum)01，测试结果如表2所示。
Claims (10)
1、一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒，包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136、紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026、N-酰化高丝氨酸内酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷或ONPG、和大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403。
2、根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照菌株液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1和费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1。
3、根据权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述N-酰化高丝氨酸内酯为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-C10-HSL、C8-HSL、3-Oxo-C8-HSL、3-Oxo-C12-HSL、3-Hydroxy-7-C14-HSL、C4-HSL、3-Hydroxy-C4-HSL和3-OH-C12-HSL中的一种或一种以上任意组合。
4、一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法，包括将受试菌进行如下所述四项实验：
1)将所述受试菌与报告菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136在同一添加了X-Gal或ONPG的固体平板上共同划线培养，观察根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136菌体是否显示蓝色，如果显示蓝色即为阳性，反之为阴性；
2)将所述受试菌与报告菌株紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026在同一固体平板上共同划线培养，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色，如果显示紫色即为阳性，反之为阴性；
3)将所述受试菌划线接种于含500nM N-酰化高丝氨酸内酯的LB平板上培养24-48小时，再将报告菌株紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026分别在受试菌划线旁平行划线，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色变浅或褪去，如果显示紫色变浅或褪去即为阳性，反之为阴性；
4)将所述受试菌与报告菌株大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403在固体平板上共同划线培养，观察大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403菌体是否发光，如果发光即为阳性，反之为阴性；
上述四项实验中，如果至少有一项实验显示阳性，则判断受试菌产生N-酰化高丝氨酸内酯群体感应信号分子，反之，则判断受试菌不产生感应信号分子。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将检测表明产生N-酰化高丝氨酸内酯群体感应信号分子的受试菌进行大量培养，提取N-酰化高丝氨酸内酯信号分子用薄层色谱法进行定性检测。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：受试菌大量培养用培养基为ABT培养基，所述ABT培养基为含有0.4g/L(NH4)2SO4、0.6g/L Na2HPO4、0.3g/L KH2PO4、0.3g/L NaCl、1mmol/L MgCl2、0.1mmol/L CaCl2、0.01mmol/L FeCl3、2.5mg/L硫胺、质量百分含量为0.5％葡萄糖和质量百分含量为0.5％酸水解酪素的培养基；所述提取N-酰化高丝氨酸内酯信号分子的方法是用在受试菌培养液的上清液中加入乙酸乙酯萃取得到N-酰化高丝氨酸内酯。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述受试菌是从病鱼和/或养殖水体和/或养殖底泥中分离获得。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述固体平板为固体LB平板；所述受试菌与报告菌株共同划线培养的方法是使受试菌与报告菌株的菌落距离为1cm以下，优选为两株菌平行划线；所述培养的温度为25℃，培养的时间为24小时。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述添加了X-Gal的固体平板中X-Gal的浓度为30-80μg/ml，优选为50.0μg/ml；所述添加了邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)的固体平板中邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)的浓度为40-80μg/ml，优选为60μg/ml；添加了N-酰化高丝氨酸内酯的固体平板中N-酰化高丝氨酸内酯的浓度为400-600nmol/L，优选为500nmol/L；所述N-酰化高丝氨酸内酯为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-C10-HSL、C8-HSL、3-Oxo-C8-HSL、3-Oxo-C12-HSL、3-Hydroxy-7-C14-HSL、C4-HSL、3-Hydroxy-C4-HSL和3-OH-C12-HSL中的一种或一种以上任意组合。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括与所述四项实验同步进行的对照实验，所述四项实验中，均以所述报告菌株单独划线培养为阴性对照；所述1)和3)中，以绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1单独划线培养或者与所述报告菌株共同划线培养为阳性对照，所述2)中，以液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1单独划线培养或者与所述报告菌株共同划线培养为阳性对照，所述4)中，以费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1单独划线培养或者与所述报告菌株共同划线培养为阳性对照。
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