CN106244707A

CN106244707A - 急性髓细胞性白血病应答法尼基转移酶抑制剂治疗的测定方法

Info

Publication number: CN106244707A
Application number: CN201610771284.3A
Authority: CN
Inventors: T.I.维纳; C.C.德雷乔; J.F.帕尔马; M.拉波尼
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2016-12-21
Also published as: CN103328971A; AU2011282614B2; AU2018241132A1; CN103328971B; AU2011282614A1; EP2598874B1; JP6896396B2; JP6034784B2; ES2705719T3; EP3489680A3; EP3489680A2; EP2598874A2; JP7055778B2; JP2019201663A; JP2022023109A; CA3186328A1; AU2016201250B2; AU2016201250A1; AU2016201250C1; EP2598874A4

Abstract

本发明的方法可以期望的准确度快速鉴定那些可能会对法尼基转移酶抑制剂和依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的一个或多个的组合治疗产生应答的AML患者，包括年老的AML患者在内。在一个实施例中，改善包括使用全血代替通常的骨髓样品，从而使检测更准确、快速、较少干扰，较少花费以及更少痛苦。该方法包括结合相对应的阈值评估两基因的表达比(RASGRP1：APTX)，对组合疗法的应答预测提供了足够的精度。优选实施方案为替吡法尼(R1 15777，)联合依托泊苷的组合治疗。进一步地，鉴定为很可能应答替吡法尼和依托泊苷组合治疗的老年AML患者具有媲美年轻患者最佳治疗条件下的完全恢复速度。

Description

急性髓细胞性白血病应答法尼基转移酶抑制剂治疗的测定方法

本申请是申请日为2011年7月28日，申请号为201180036893.X(PCT/US2011/045693)，发明名称为“急性髓细胞性白血病应答法尼基转移酶抑制剂治疗的测定方法”的发明专利申请的分案申请。

背景技术

美国的急性骨髓性白血病(AML)患病率较低，约5万患者，这被认为远低于美国对孤儿病20万患病人数定义的要求。老年人患急性骨髓性白血病的患病率更高，往往也更难治疗。老年患者通常被定义为至少60岁的病人(尽管一些分类要求病人至少65岁甚至70岁)以高比率死于这种疾病。老年急性骨髓性白血病患者的响应率和存活率平均为30％～50％，完全缓解的中位无复发生存期(RFS)只有9至12个月。很少有老年患者可以活过两年。

老年急性骨髓性白血病患者的治疗管理面临很多挑战。尽管约百分之七十(70％)的患者在常规诱导治疗下病情到缓解，但由于这种疗法的毒性作用以及给老年人带来的严重不良后果，导致常规诱导治疗通常不适用于老年患者。因此，老年患者的治疗方案通常仅仅是临床试验治疗或姑息治疗。不过，可以鉴别可能对常规诱导治疗响应的老年患者的亚组。例如，具有良好的细胞遗传学和不伴有高多药耐药蛋白(MDR1)表达的老年患者对诱导治疗应答良好。但是，延迟鉴别这些患者会延迟诱导治疗，例如等待细胞遗传学评估结果可能得花上一周或者更久，这会对患者的预后有明显的负面影响。响应不良的标记包括FLT3/ITD基因突变的出现以及CD34抗原表达。因此，对老年AML患者的有效治疗需要快速决策，这反过来需要快速测定选择适当的治疗。有些患者的治疗响应良好，而有些患者每况愈下，饱受治疗副作用之苦。

AML患者也可分为复发/难治性疾病患者以及初诊患者。处于复发或难治性疾病状态的患者不是对治疗毫无响应，就是疾病已经复发。复发性或难治性状态都与不良预后相关。

不幸的是，许多AML治疗取得初步成功后，紧随的往往是旧病复发。此外，还尚不清楚大多数治疗是否对所有患者有效，部分缓解很大程度上对延长生存期无效。

法尼基转移酶抑制剂(FTI)即使对老年患者而言也是一种可选的疗法。法尼基转移酶抑制剂(FTI)抑制碳法尼基部分与各种蛋白质的C-末端CAAX模序共价结合。很明显，相对于常规诱导治疗，老年患者对FTI的耐受性更好。但是，大约仅15％～25％的患者对法尼基转移酶抑制剂的治疗有响应。法尼基转移酶抑制剂例如替吡法尼通过竞争性抑制法尼基部分与信号分子如RAS(与癌症有着密切关系)等的结合来执行其功能。这种抑制预计会阻碍它们的功能。本申请中所关注的许多FTI在美国专利公开20030050323里描述。

替吡法尼，也称为R115777或其商品名为ZARNESTRA^TM，是第一种用于临床试验的法尼基转移酶抑制剂(FTI)，在许多疾病治疗上显示出良好的前景。它在血液***疾病方面显现出重要的作用，这些疾病包括AML、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、幼年型粒单细胞白血病(JMML)、骨髓纤维化与髓样化生(MMM)和慢性粒细胞性白血病(CML)，AML和MDS的完全缓解率高达15％左右。此外，替吡法尼常与其他治疗具有协同作用。这种协同作用常使老年患者有其它的选择，让他们能够承受法尼基抑制剂和另一种药剂的协同治疗。相比单独用一种药剂治疗，这种治疗的副作用是可以接受的，疗效更好。值得注意的是，之前的替吡法尼临床试验本身并不会显著增加存活率；与诸如阿糖胞苷(ARA-C)的另一药剂的协同治疗甚至可能增加死亡率。替吡法尼和依托泊苷的协同很可能克服这些缺点。

优选的FTI是替吡法尼，其能抑制多种肿瘤/细胞株的生长。具体地讲，表达N-ras基因或H-ras基因突变的细胞株表现出明显的细胞增殖抑制作用。然而，在进行测试时，仅约一半的K-ras基因突变细胞株会被FTIR115777抑制，加大剂量也同样如此。FTI R115777在抑制肿瘤/细胞株生长上也表现出和很多药剂的协同作用。值得注意的是，某些癌症和其他增殖性疾病特征在于突变存在于不同类型的ras突变的突变或者对其具有敏感性。因此，包括R115777在内的FTI不期望对所有类型的癌症和增殖性疾病都具有相同的效果。事实上，当K-ras起主要作用时，FTI对其不可能与只有N-ras基因或H-ras基因起重要的作用时同样有效。

规诱导治疗的另一可选疗法基于鬼臼毒素(Podophyllotoxin)，所述疗法在美国专利公开号US20030050323中有描述。鬼臼毒素是从曼德拉草里提取的。它是一种母体化合物，从该化合物中研发出的两种糖苷在治疗人类肿瘤方面有重大的治疗效果，所述肿瘤包括小儿白血病、肺小细胞癌、睾丸瘤、霍奇金病和大细胞淋巴瘤等。这些衍生物是依托泊苷(VP-16)，它的化学名是41-去甲表鬼臼脂素-9-[4，6-0-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡糖苷]和替尼泊苷(VM-26)，化学名为41-去甲基表鬼臼脂素9-[4，6-0-(R)-亚乙基-β-葡萄糖苷]。这些化合物的作用机理包括通过与DNA拓扑异构酶II的相互作用或自由基的形成诱导DNA链断裂。然而，依托泊苷和替尼泊苷都有毒副作用，尤其是骨髓抑制。

为了增强抗癌鬼臼毒素衍生物对肿瘤生长的抑制效果，为了找到一种使用低剂量抗癌鬼臼毒素衍生物的方法，本文探讨了和其它疗法组合的协同治疗。FTI，特别是替吡法尼，能与依托泊苷显示出协同作用，使得可以使用毒性小、效果好的剂量，这是老年AML患者重点考虑的因素。

替吡法尼协同一种鬼臼毒素衍生物(如依托泊苷)组合副作用具有更好的可接受性。然而，替吡法尼和依托泊苷的协同组合的有效率约为15％至25％，不同于年轻AML患者组的有效率通常为百分之七十(70％)。由于并不是所有AML患者都对FTI治疗应答，如果患者是无应答者，这就在实施FTI之前提出了一大挑战，那么用FTI治疗该患者是不可取的。

虽然首选的FTI，R115777是有效的联合用药，但是到现在还不能准确预测R115777与其它药剂联合用于特定患者的协同作用，部分原因是法尼基转移酶活性的抑制程度没有与临床变化良好地相关。例如，RAS基因突变状态被当作是患者对于FTI治疗响应的候选生物标记。所述原理基于这个临床前证据：许多癌症中，RAS基因特定点的突变会导致RAS途径的组成性激活。通常认为这种严重依赖于一个或两个途径激活的肿瘤肿瘤患者会对抑制发病途径的药物有响应。然而有时候，多个事件可以激活很多途径，已发现在没有活化的RAS突变的情况下，可以上调RAS。此外，正如美国专利公开号20070048782中指出的，目前还没有临床研究已证明RAS突变与FTI疗效之间的关联，所述专利以引用的方式在本发明中公开。事实上，尽管早期FTI临床研究多集中在表现RAS基因突变率高的癌症，但在这些试验中响应率非常低。因此，预测法尼基转移酶抑制剂与其它药剂组合用于特定患者的响应问题有待于找到一个合适的诊断方法，能快速、准确、费用适度地使预测能力具有临床用途。

发明内容

本发明鉴别能预测法尼基转移酶抑制剂与依托泊苷协同治疗应答的标记。这些标记可鉴别低应答特征的肿瘤治疗，所述低应答特征出现在可能应答者身上，同时可避免可能无应答者受到不期望的不良副作用的影响。

优选实施例能够可靠迅速地预测患者是否会对FTI协同治疗有应答，所述治疗包括FTI组合依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康，曲妥珠单抗和顺铂中的一个或多个。优选的，FTI组合治疗由替吡法尼和依托泊苷组成。此外，本公开能符合从众多可能的治疗方法中选取最有效的疗法这一需要，并且转到更有效的治疗。治疗具有多起因、多并发症、多治疗方法的AML的目标之一是及时准确地预测对患者特别是老年患者实施的特定疗法的有效性。本公开对FTI协同治疗可能的响应作了个性化预测，允许对应答者进行FTI协同治疗，同时对潜在无应答者采取替代疗法。

优选的治疗方法包括替吡法尼(可口服)和非肽类法尼基转移酶抑制剂，所述疗法在治疗包括老年AML患者在内的骨髓恶性肿瘤上表现出的AML和MDS完全缓解率高达15％，其中所述老年AML患者不是传统细胞毒性药物治疗的候选。替吡法尼在治疗高危骨髓增生异常和骨髓增殖性疾病方面也有效，所述骨髓增殖性疾病包括病因不明的骨髓组织异生和伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病。响应速率的改善期望对很可能无应答患者避免给服用替吡法尼。

本发明用于鉴别骨髓障碍患者是否可以成为FTI组合治疗的候选对象，所述方法包括施用第一测定并给出第一结果。如果这一结果或结果的倒数小于预定阈值，该受试者就被标记为不能用第一组疗法，所述疗法需要组合法尼基转移酶抑制剂和选自下列的一种药剂：依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂。如果受试者没有被标记，那么从治疗组里选定疗法用于该受试者。

选择预定阈值优选地是这样：如果从治疗组里选定的疗法具有有益的较高阴性预测值，就标记受试者，以在尽可能最大群体范围避免拒绝合理的有效治疗。因此，有效的高阴性预测值需要标记最不可能用法尼基转移酶抑制剂和其它药剂协同治疗的受试者。应当注意的是，可以把受试者标记为积极反应-确定受试者可能受益于治疗，或消极反应-确定受试者不会受益于治疗。因此，标记应理解为对群组进行鉴别甚至进行定义。

可选地，选择预定阈值可以这样：如果从治疗组里选定的疗法具有较高的阳性预测值，受试者就会被标记，以提高受益于治疗的可能性。如果有许多有区别的相互竞争的疗法可用，这种疗法通常会受到青睐。

此外，受试者被鉴别为可能受益于所述治疗组里选定的疗法，疗法的选取基于相对的阳性预测值-优选相对于治疗组的其它疗法而言。在一个优选的实施例中，骨髓障碍是急性骨髓性白血病。

另一方面，也可用本发明来鉴别下一步是否应切换到不同的未来治疗，以应对受试者对以前治疗的应答有所下降的情况。不同疗法可能包括姑息性治疗。可选地，不同疗法也可能是由FTI和其它药物如依托泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、盐酸托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂。

基于期望对治疗阳性应答的部分受试者来确定法尼基转移酶抑制剂和另一药剂的组合治疗的阳性预测值，其中所述的阳性应答包括完全缓解，所述完全缓解通过以下来定义：在所有细胞系正常成熟的情况下存在的原粒细胞小于5％，至少为1000/μL的ANC(中性粒细胞)和至少100,000/μL的血小板计数，外周血中没有原始细胞，骨髓中没有可鉴定的白血病细胞，清除了与疾病有关的细胞遗传学异常，以及清除了先前存在的任何髓外疾病。

此外，在优选实施例中，阳性应答还包括部分缓解，其中所述部分缓解的标准是在骨髓中存在三系造血细胞存在下，中性粒细胞绝对值和血小板恢复到上述规定水平，骨髓原始细胞数在5％和25％之间，骨髓原始细胞比例比基线至少降低了50％。并且，在另一个优选实施例中，阳性应答还包括血液***的改善。血液***改善被定义为：骨髓原始细胞中至少有50％的减少，或在任何可测量的髓外疾病中至少有50％的减少，中性粒细胞绝对值恢复至500至1000/μL，血小板计数恢复至20,000至100,000/μL，或输血需求改善。

在本发明的一个优选实施例中，用聚合酶链反应(PCR)来评估RASGPR1和APTX的基因表达水平。PCR反应可与参照的PCR反应在单管中进行。用于扩增的样品可以是(i)骨髓样品；和/或(ii)血液样品中的一个或多个。RASGRP1和APTX标记的表达水平比率，可用外部归一化参考来评估。在一个优选实施例中，扩增子的扩增包括：CTGGACGATCTCATTGACAGCTGCATTCAATCTTTTGATGCAGATGGAAACCTGTGTCGAAGTAACCAACTGTTGCAAG SEQ No.1用于RASGRP1和CGCTTCCGATTGGGCTACCACGCCATTCCGAGTATGAGCCATGTACATCTTCATGTGATCAGCCAGGATTTTGATTCT SEQ No.2用于APTX使用下列的引物进行

(i)5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’SEQ No.3 APTX上游引物

(ii)5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’SEQ No.4 APTX下游引物，

(iii)5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’SEQ No.5 RASGPR1上游引物，和

(iv)5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’SEQ No.6 RASGPR1下游引物。

两基因表达比(RASGRP1：APTX)的性能和实用性在预测临床意义上应答FTI如R115777，RASGRP1和APTX的鉴定通过：研究源自之前未经治疗的AML老年患者的骨髓，对N-RAS N-RAS高风险急性髓性白血病利用全局基因表达，和/或特定基因的定量PCR(qPCR)。微阵列分析把两基因的表达比率(RASGRP1：APTX)作为预测替吡法尼应答的最高精度。这种分类能预测复发或难治性AML患者对替吡法尼的应答，其阴性预测值和阳性预测值分别为92％和28％(比值比为4.4)。因此，对于新诊断AML患者和复发或难治AML患者，这种分类提高总应答率约50％，同时保持较高的NPV，且显著提高了患者的总生存期。两基因分类的操作可助借定量qPCR，其在一项研究中观察到的阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)分别为81％和50％(比值比4.3)。这些数据表明，一个简单的两基因表达测定可用来鉴别可能对替吡法尼(R115777)应答的AML患者。此外，这两个基因检测不仅可用于新诊断的患者，还可用于难治性或复发性AML，例如：用于诱导治疗之后，和用于提供维持治疗。

在一个示例性实施例中，按以下步骤快速确定RASGRP1：APTX基因比：收集外周血样品，从样品中分离RNA，用上述引物扩增扩增子，在通用RNA或其他外部参照中在同一组反应中使上面所述扩增子扩增，所述参照包括RASGRP1和APTX RNA株系，测量每个反应的C_t值，拒绝Ct是40cycles以上的样品或反应，优选拒绝Ct是37cycles以上的样品或反应，更优选拒绝Ct是35cycles以上的样品或反应，最优选拒绝Ct是30cycles以上的样品或反应。然后，RASGRP1：APTX比率按如下所述计算。

RASGRP1：APTX比率＝2^-((A-B)-(C-D))

其中A：样品RasGRP1 Ct值

B：JY(或通用)RNA(+)RasGRP1 Ct值

C：样品APTX Ct值

D：JY(或通用)RNA(+)APTX Ct值

把该测定得到的结果与应答比较。为了评估该检测的表现，曲线下面积(AUC)值优选地基于受试者工作特征(ROC)曲线分析计算，例如用医学统计软件包。

优选的方法中，如果该比率超过预定阈值，那么该患者归类于可能应答者。反之，他就是非应答者。优选地，预定阈值被定义为对应于所期望检测表现或其他标准表现的AUC，所述其他标准例如灵敏度或特异性或敏感性和特异性的最大化总和。因此，特定的阈值可能不同，例如，由于使用了RNA(Y或通用或其他RNA集)，但在分层患者中阈值的特定期望性能在RTPCR检测中允许使用不同的RNA参照和其他实验条件，同时生成可比较的患者分层。

本申请允许选取一个阈值，其中所述RASGRP1和APTX的表达水平比率和该阈值相比较，以鉴别对法尼基抑制剂和其它药剂组合治疗的应答者，其中所述另一药剂选自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂的组或其衍生物。在一个优选示例实施例中，阈值的选取包括：处理血样以生成RASGRP1和APTX的表达水平比率。选取阈值来提高下列一个或多个测量值：疗法的阳性预测值、鉴别应答者的阴性预测值、ROC分析中的AUC，灵敏度和特异性。在一个优选实施例中，RASGRP1或APTX的基因表达水平用RT-PCR测量，尽管可用其他测量基因表达的方法替代。

应当指出的是，不失一般性，可用其他外部参照RNA代替通用RNA(来自STRATAGENE^TM。然而，可能需要调整RASGRP1：APTX比率的预定阈值。利用ROC估计预定阈值以保持曲线下面积(AUC)的恒定。例如，参考JY RNA(从JY细胞系获得)确定5.2的阈值。换用可广泛获取的标准化的通用RNA，把阈值调整至7.3以确保曲线下面积(AUC)恒定。在参照RNA的情况下，阈值差异反映了RASGRP1和APTX的相对差异。其它药剂在阈值计算中可进一步造成差别。

此外，也可基于所需的灵敏度或特异性要求(若有的话)调整所述阈值。因此，当假定的非应答者是替代疗法的候选对象时，以下这点是可取的：选择一个能使适宜于任一疗法的患者数量最大化的阈值，以在大多数患者中提高抗AML的整体可能性。在这点上，鉴于年轻患者接受诱导治疗的能力带来的缓解率相对较高，可使用不同阈值以用来评估没进行诱导治疗的老年患者，还可用来评估只用法尼基转移酶抑制剂治疗或把法尼基转移酶抑制剂和另一种药剂协同治疗的年轻患者。选择这样的阈值可反映较高的特异性来鉴别对法尼基转移酶抑制剂如替吡法尼的治疗可能应答的患者。作为另外一种选择，协同法尼基转移酶抑制剂的诱导治疗(即使不知是否是协同作用的)会向患者提供及时有效的治疗，而及时性是对抗AML的一个关键因素。这确保患者不会被可行的疗法排斥。

任选地，在一个示例性实施例中，扩增并检测来自HMBS的RNA以核对样品的完整性，从而当HMBS RNA异常低值时，把该样品标记为可疑样品。HMBS RNA的优选扩增子是CCTGCCCACTGTGCTTCCTCCTGGCTTCACCATCGGAGCCATCTGCAAGCGGGAAAACCCTCATGAT Seq.No.7，扩增使用的引物CCTGCCCACTGTGCTTCCT SEQ No.8 HMBS上游引物，和ATCATGAGGGTTTTCCCGCT，SEQ No.9 HMBS下游引物。

扩增子的检测优选使用下列探针：

FAM-CATTCAATCTTTTGATGCAGATGGAAACCTG-BHQ1，RASGPR1，Taqman探针，SEQNo.10；

Gold 540-CACGCCATTCCGAGTATGAGCCATGTAC-BHQ2，APTX，TaqMan探针，SEQ No.11；以及

Cy5-GCTTCACCATCGGAGCCATCTGCA-BHQ1，HMBS，TaqMan探针，SEQ No.12。容易注意到，不失一般性，这些探针可以是多种多样，不仅有序列的选择，还有探针上面的特定标记。

本发明也说明了两基因比RASGRP1：APTX可通过qPCR迅速检测，所述qPCR检测使用标准化试剂在单管中进行。所述检测有预测实用性，能从包括老年患者在内的新诊断AML、复发性或难治性AML患者中的鉴别出可能应答者。另外，所述检测可用外周血样品代替骨髓样品，相比获得外周血样品，获得骨髓样品需要进行更进一步侵入性操作。

这两基因的比率可用于给患骨髓疾病的受试者处方替吡法尼的方法中。一个评估RASGRP1和APTX表达的方法在例如骨髓或血液样品中进行，其通过用如下列的至少一种引物来扩增来自核糖核酸靶标的信号：

(i)5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’

(ii)5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’

(iii)5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’和

(iv)5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’。

接下来，RASGPR1基因表达水平是相对于APTX、β-肌动蛋白和HMBS表达水平中的一个或多个评估的，优选地以多重形式在单管中进行。确定RASGRP1相对于APTX的表达水平比。若受试者的该比率大于阈值(优选约5.1或约5.2)，替吡法尼就可处方给受试者。在一个优选的实施方案中，替吡法尼和另一与其协同的药剂一起处方。此类药剂可以是依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、盐酸托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的任一种或其衍生物。最优选的是给予替吡法尼和依托泊苷。

本发明也涉及对确诊患骨髓障碍的患者施用替吡法尼和依托泊苷的方法。如上所述，先确定RASGRP1和APTX的表达比是否超过约5.1或5.2的阈值。如果所述比值超过该阈值，给予替吡法尼。上述内容和其它的细节借助下面的附图进行描述，连同其基于的说明书部分以及美国专利7,932,036共享内容，其在此通过引用全文并入。

附图说明

图1描述了RASGRP1基因在AML中作为应答替吡法尼的预测的表现。准确率(A)和在AML初诊患者中使用RASGRP1基因分类的Kaplan-Meier生存曲线(B)。

图2描述了RASGRP1：APTX基因对作为AML中对替吡法尼应答的预测。初诊AML患者(A)的总生存期和两种基因分类的复发/难治性AML患者(C)的总生存期用Kaplan-Meier生存曲线描绘。示出了初诊AML患者(B)和复发/难治性AML患者(D)中两基因分类的准确率。

图3描述了使用qPCR的RASGRP1：APTX基因分类的表现。(A)归一化的20位应答者和10例进行性患者的RASGRP1：APTX Ct值。这20个独立样品和10个实验样品于基因芯片上分别列示。水平轴表示群体均值。(B)示出了30例新诊断的AML患者中RASGRP1基因分类的准确率，用临界值0分类患者。(C)C用Kaplan-Meier生存曲线描绘了分类患者的相关总生存期。

图4描述了RASGRP1基因作为预测复发和难治性AML患者对替吡法尼治疗的应答的表现。在复发和难治性AML患者中用RASGRP1基因分类的准确性(A)和Kaplan Meier生存曲线(B)。

图5描述了非FTI治疗的AML患者的总生存期，其中所述患者是用RASGRP1：APTX基因表达比分类的。RASGRP1和APTX三个cDNA探针存在于可用的数据集里。我们首先计算每个基因的平均值，然后计算这些值的RASGRP1：APTX比率。比率高于1的患者被归类为病情进展者；比值低于1的患者被归类为应答者。然后进行Kaplan Meier分析。

图6示出了Affymetrix和qPCR数据的相关性。通过Affymetrix基因芯片和定量PCR(qPCR)进行分析的9个RNA样品，通过线性回归分析进行比较。Y轴以归一化的ΔCt形式来绘制相应于RASGRP1：APTX比率的qPCR值。应该指出的是，严格来说，尽管会交替使用这些术语，但这个值不是一个比率，而是一个相对于比率的归一化的Δ-Ct。结果是，随着RASGRP1水平上升，相应的Ct值会降低，而其它保持不变，ΔCt值会降低。X轴代表从同一样品的芯片数据中获得的相应RASGRP1：APTX比率值，该值随比率升高而升高。因此，表示归一化的ΔCt和芯片之间相关性的线斜率为负值，其中所述芯片生成RASGRP1：APTX比率。

图7描绘了以多重形式在单管中扩增RasGRP1，APTX和HMBS RNA，显示了密切相关性、低变异性和高重复性。

图8和图13描述了老年AML患者替吡法尼+依托泊苷研究第2阶段中改良的qPCR测定的准确度，采用了最佳临界值5.2分类的患者的Kaplan Meier分析。

图9和图14描绘了ROC分析，指出：2基因比差值的80％(AUC＝0.80)作为用来预测完全缓解(CR)患者组的整体应答的应答标准。

图10和图15表明在没有接受FTI治疗的患者中2基因比率和临床应答或总生存期之间没有相关性。结合阿糖胞苷、蒽环霉素和第三种药剂(夫拉平度、依托泊苷)大剂量诱导化学疗法治疗的41例AML患者的总生存期：用高低2基因比的分类。

图11描述了比较和确定优选样品采集问题中的工作流程。

图12A和图12B显示了样品采集操作方案对两基因检测结果的影响。图12B具体地显示了每一个病人的散点，所述散点表明样品采集方案的影响。Y轴显示了样品中RASGRP1：APTX对校准/参考RNA中RASGRP1：APTX的比值，其中校准/参考RNA在此为JY RNA。因此，Y轴值是用ΔΔCt法得到两个比率的比率。优选的测定中，所用阈值基于所期望的患者分类，所述分类使用定量RASGRP1和APTX水平的ΔΔ Ct法。

具体实施方式

本发明中提及的治疗剂包括FTI。它们有多种形式，但是都有干扰或减轻蛋白质的法尼基化的基本抑制功能，所述蛋白质与癌症和增殖性疾病相关。优选地，FTI是那些适用于白血病如AML治疗的。

许多FTI都在本发明披露的范围内，也包括在以下美国专利描述：5,976,851；5,972,984；5,972,966；5,968,965；5,968,952；6,187,786；6,169,096；6,037,350；6,177,432；5,965,578；5,965,539；5,958,939；5,939,557；5,936,097；5,891,889；5,889,053；5,880,140；5,872,135；5,869,682；5,861,529；5,859,015；5,856,439；5,856,326；5,852,010；5,843,941；5,807,852；5,780,492；5,773,455；5,767,274；5,756,528；5,750,567；5,721,236；5,700,806；5,661,161；5,602,098；5,585,359；5,578,629；5,534,537；5,532,359；5,523,430；5,504,212；5,491,164；5,420,245；5,238,922和美国专利公开20030050323。非肽性酶，即所谓的“小分子”疗法，是优选的。更优选的FTI是喹啉或喹啉衍生物，例如：

7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-2，3-二氢-邻-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮，

7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-1，2-二氢-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮，

8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-1，2-二氢-4H-吡咯并[3，2，1-c]喹啉-4-酮，和

8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-氯酚-基)-2，3-二氢-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮。最优选的FTI的是(B)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。

期望对治疗的应答进行分类，便于了解治疗效果和对比不同的治疗方法。评估治疗有很多标准。比如，一些实施例中，一千个中性粒细胞计数可足以确定应答；而其他实施例可能需要1,400或1,500个中性粒细胞。同样，血小板计数可能会是从10万到14万不等。需要一定比例的某一细胞系的改善，在其它评估中或需要两种甚至是所有三种细胞系的改善。此类变化确定的持续时间是一两个月甚至更久。在一个优选的实施例中，对FTI治疗有应答的患者在接受FTI治疗后骨髓里原始细胞至少减少了50％。通常情况下，部分缓解所需的改善程度是往往可变的，不同的研究者和/或医生之间对以血液改善为代表的改善程度的评估差别极大。本权利要求范围内涉及到用来评估施用FTI治疗的应答的可选替代标准，旨在预测疗效，除非明确表明了相反意图。

在一个优选的实施方案中，阳性治疗应答包括完全缓解(CR)、部分缓解(PR)，和血液***改善(HI)。其它的疾病描述是疾病进展(PD)，余下的是被视为疾病稳定(SD)的无应答者。阳性应答的分类在下文中描述。

完全缓解(CR)的表现是在所有细胞系正常成熟的情况下存在的原粒细胞小于5％，至少为1000/μL的ANC(中性粒细胞)和至少100,000/μL的血小板计数，外周血中没有原始细胞，骨髓中没有可鉴定的白血病细胞，清除了与疾病有关的细胞遗传学异常，以及清除了先前存在的任何髓外疾病。A必须在初次建档的4-6周确认完全缓解(CR)。如果可能的话，应至少进行一个骨髓活检确认CR。如果是完全缓解(CR)，那么骨髓应表现出正常，即不到百分之五的原粒细胞，正常成熟，没有发育不良。在外周血中，血红蛋白大于11克，中性粒细胞每平方毫米超过1500，血小板超过10万，没有原粒细胞，没发育不良的情况。此外，假设AML得以治愈，完全缓解(CR)患者的复发风险理想上应和普通人群患AML的风险是相同的。

部分缓解(PR)可通过以下表现来鉴别：骨髓中有三系造血细胞，ANC和血小板恢复到上述规定水平，但骨髓原始细胞数在5％～25％之间，骨髓原始细胞比例比基线至少下降50％。必须在初次建档的4-6周，确认部分缓解(PR)。

血液***改善(HI)可通过以下表现来鉴定：骨髓原始细胞中至少有50％的减少，或在任何可测量的髓外疾病中至少有50％的减少，中性粒细胞绝对值恢复至500至1000/μL，血小板计数恢复至20,000至100,000/μL，或输血需求改善。

疾病稳定(SD)可以通过不符合CR，PR，HI，或PD标准的任何治疗应答来鉴定。

疾病进展(PD)可以通过以下任一表现来鉴定：

·＞骨髓原始细胞比率在最好评估的基础上增长50％以上

·＞循环原始细胞增长50％

·出现新的循环原始细胞(至少连续两次)

·髓外疾病发育

·在骨髓原始细胞足够高的患者身上，病情进展应取决于外周血标准，新的循环原始细胞的出现(至少连续两次)，和/或髓外疾病的进展情况，其中所述高比例骨髓原始细胞使得无法根据骨髓原始细胞大于＞50％确定疾病进展。

优选通过符合CR或PR(不论先记录哪一个)的时间测量标准来测定应答持续时间，直到客观记载疾病复发或进展的第一个日期为止。通过首先符合CR的时间测量标准测定CR的持续时间，直到客观记载疾病复发的第一个日期为止。

测量病情稳定患者的病情稳定持续时间，所述测量时间从开始治疗起，止于符合病情进展标准。

无进展生存期(PFS)时间从开始研究算起，算到客观记载疾病进展或复发的第一天，或者到因任何原因出现死亡的时间为止。总生存期时间从参与研究算起，到死亡为止。

基因组内仅仅存在具有表达蛋白质或肽的潜在核酸序列(“基因”)，不能用以证明蛋白质或肽是否在特定的细胞内表达或表现。特定的基因是否能表达蛋白质或肽或者在何种程度上会发生这样的表达，如果有的话，将取决于各种复杂的因素。不论在理解和评估这些因素上有多大困难，测定基因的表达可提供有关细胞对给定的特定刺激反应的有用信息，所述刺激比如药物或其它治疗剂的引入诱导刺激。对于基因活性或非活性程度的相对指示可见于基因表达谱。基因表达谱可用来鉴别和治疗可能受益于一个特定治疗的患者，也可用来排除对一个特定治疗的患者进行治疗，该患者可能从药物或治疗中受益很少或者根本不受益。

用于建立基因表达谱(包括那些用于得到相关生物途径的)的优选方法包括确定产生的可以编码蛋白质或肽的RNA的量。这可以通过逆转录PCR(RT-PCR)、竞争性逆转录PCR(RT-PCR)、实时定量逆转录PCR(RT-PCR)、差异显示逆转录PCR(RT-PCR)、Northern杂交分析和其他相关的测试来完成。当可以用单个PCR反应引导这些技术时，最好扩增拷贝DNA(cDNA)或者复制产自mRNA的RNA(cRNA)。确定基因表达的一些方法可见于美国专利6,271,002；6,218,122；6,218,114；和6,004,755中。

一个优选的方法涉及计算出RASGRP1：APTX两基因的比，以确定一个人是否可能对施用一种FTI的治疗产生应答。用于基因表达值的术语“比”或“RASGRP1：APTX两基因比”在本专利中有一系列的技术解释，很容易从上下文中看出。基本的层面上，虽然形式可能会有所不同，但意义是一样的。比如，使用qPCR技术时，对应两个目的基因的比率的ΔC_t值很容易得到，这是本领域中普通技术人员众所周知的。该值可以这样产生：用每个基因表达水平的归一化C_t值，减去那个基因的平均C_t值，并除以该基因的C_t值中的标准偏差。两个基因归一化的C_t值之间的差异，即ΔC_t值，对应该基因表达比，当表达比增大，ΔC_t值减小，反之亦然。归一化ΔC_t值的例子可在图6中用于RASGRP1和APTX的Y-轴找到。本文中，这样的ΔC_t值，甚至是归一化ΔC_t值可被看作RASGRP1：APTX两基因的比。图3A例子中，显示了根据Y轴上的ΔC_t值，阈值为0，以致应答者都位于阈值下。例如分布在图6X轴上的数据，当两基因比RASGRP1：APTX用阵列数据表达时，0的阈值对应1的阈值。图6仅说明从一种确定RASGRP1：APTX比值的方法到另一种方法是很容易实现的。作为另外一种选择，基于把各种样品和标准校准/参考RNA比较的ΔΔC_t值，该比值可以表达为一个正数。使用这样常见的校准器可使检测更加便携可靠，因为阈值根据实验条件能够且事实会发生改变，因为阈值主要是通过其对测试环境中患者的分类表现来定义的。在一个使用RT-PCR的优选实施例中，正如本技术说明中其它地方描述的，两基因比RASGRP1：APTX可根据ΔΔC_t值表示为一个正数，用于对替吡法尼应答者和对替吡法尼无应答者进行分类的比值为一个5.2的值。RASGRP1：APTX两基因的比值，根据ΔΔC_t值可表达为一个正数，这样的例子可见于图12B的Y轴，这个基因比也被做为上下文明确了应该如何解释RASGRP1：APTX两基因比。严格地说，一个本技术领域的普通技术人员会了解到，一个阈值或RASGRP1：APTX两基因比值根据一个或者更多ΔΔC_t值可表达为一个值，以阵列数据的形式可表达为ΔC_t值，在没有额外信息辅助作图而可比性不能让他们找到已有的相互可兑换性时，这仅能表达为ΔΔC_t值。应按照以上内容去理解本权利要求书和说明书。为清楚起见，这两基因的比率RASGRP1：APTX被表示为ΔΔC_t比率RASGRP1：APTX或ΔC_t比率RASGRP1：APTX或ΔΔC_t阈值或ΔC_t阈值，当没有提供这样的解释，可从上下文轻易得到正确解释。

确立一个阈值来区分应答者和无应答者之后，在介质上确定两基因的比例，例如如下所述的计算机可读介质。获得包含病变细胞(如AML病例中造血原始细胞)的患者样品。在一个优选的实施例中，获得RNA样品，从病变的患者细胞扩增，所述扩增采用RT-PCR技术，两基因比的计算借助外部归一化参照。然后，在一个优选的实施例中，如果两个基因的比例大于预定阈值时，这个患者被归类为可能应答者，否则为非应答者。

同样，可以用两基因的比率监测整个FTI治疗过程中各个时期的治疗应答。如果两基因的比率与应答者是一致的，那么病人的治疗继续。如果不是，改变病人的治疗。在检测出临床标记或出现其它模糊的临床征象之前，这种分析允许干预和调整治疗。

优选的实施例可包括用于治疗、诊断、预测、肿瘤分期和评估疾病的基因表达谱的表示，这些病被还原为可自动读取的介质，如计算机可读介质(磁和光等)。优选的实施例还可包括此类介质中评估基因表达谱的说明。例如，优选的实施例可以包括一个内含计算机指令的CD-ROM，指导对上述基因组的基因表达谱的比较。优选的实施例中还可以数字化地记录基因表达谱，使之可以与患者样品的基因表达数据对比。作为另外一种选择，基因表达谱可以不同的表示格式进行记录。图像记录是一种此类格式。比如包含在“OMNIVIZ”和“树视图”计算机程序里面的聚类算法可以更好地帮助数据实现可视化。

一种药物的生物效应可受药物载体变化的影响，这种影响指一个或多个种类RNA的转录或降解速度上的变化、一种或多种多肽翻译或翻译后处理速度或程度变化、一种或多种蛋白质降解速度或程度变化、一种或多种蛋白质机能或活性的抑制或刺激等等。除了优选FTI，优选的药物还包括那些调控MAPK/ERK信号通路、TGF-β、WNT或者凋亡途径的。这些包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂、MEK激酶抑制剂、P13K激酶抑制剂、MAP激酶抑制剂、细胞凋亡调控子和及其组合。在这些示例性药物当中，最优选的是诺华制药的“GLEEVEC”酪氨酸激酶抑制剂、U-0126 MAP激酶抑制剂、PD-098059 MAP激酶抑制剂、SB-203580 MAP激酶抑制剂、反义基因、核酶和DNAzyme Bcl-XL抗凋亡剂。其它有效药物的例子包括但不限于美国专利6,306,897的calanolides；美国专利6,284,764中的取代双环化合物；美国专利6,133,305中的二氢吲哚化合物；美国专利6,271,210中的反义寡核苷酸。

有用的药物组合物包括由本文所描述的药物可由根据已知的方法配制，例如混合药学上可接受的载体。这类制剂的载体和方法的实例可在《Remington′s PharmaceuticalSciences》上找到。为了形成适用有效给药的药学上可接受的组合物，这种组合物将含有有效量的药物。有效量的药物视个体的病情、体重、性别和年龄等的各种因素而定。其他因素包括给药方式。药物组合物可通过皮下、局部、口服和肌注等各种途径提供给个体。

本发明所述药物包括基础药物分子的化学衍生物。也就是说，它们可能包含通常不属于基础分子部分的其它化学部分。这些部分可能改善基础分子的溶解度、半衰期、吸收等。另外，这些部分可能减弱基础分子的不良副作用，或减少基础分子的毒性。这些部分的例子可见于各种文献当中，比如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》。

根据本发明鉴别出的化合物可按适当剂量单独使用来获得最佳的抑制或活性，同时最大限度地减少任何潜在毒性，其中所述剂量由常规测试确定。此外，其他药物的共同给药或顺序给药也是可取的。

本文所述药物可在常规器皿里按多种剂型给药。例如，药物可采用诸如片剂、胶囊剂(每个包括定时释放和缓释制剂)、丸剂、粉剂、粒剂、酏剂、酊剂、溶液、悬浮液、糖浆和乳剂的形式，或通过注射方式给药。同样地，可采用诸如静脉内给药(注射和输液)、腹腔内、皮下、局部闭塞或局部不闭塞、肌肉注射等所有被药物领域的普通技术人员所熟知的形式。有效且无毒剂量的化合物可作为调节剂。

在不止采用一种活性剂的组合治疗中可同时施用活性剂，其中活性剂是按单独剂量配给的，或它们的每一种可在分别错开的时间给药。

给药方案利用本发明中所述的化合物或调控剂，根据下列一系列因素选择：类型、物种、年龄、体重、性别和患者的医疗状况；待治疗的病情的严重程度；给药途径；患者的肾和肝功能；所用的特定药物。熟练的医生或兽医可轻易地确定并开出有效量的药物以满足预防、对抗、控制健康状况进展。在产生疗效且无毒性的范围内实现药物浓度的最佳精度，这要求给药方案要基于药物能到达靶位点的动力学。这就涉及到药物分布、药物平衡、药物消除等考虑。

本文描述的药物组成活性成分，通常与合适的药用稀释剂、赋形剂或栽体(本文中统称为“载体”)混合给药，根据预期的给药形式和常规的药物实践合理选择赋形剂或载体，其中所述给药形式指口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等。

例如，对于以片剂或胶囊剂形式口服来说，可以将活性药物组分与口服、无毒性的药用惰性载体(例如乙醇、甘油、水等)组合。此外，在希望或必要时，也可以将合适的粘结剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括但不限于淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味剂，天然的和合成的树胶例如***胶，西黄蓍胶或藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等。在这些剂型中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

对于液体形式的活性药物成分，可以结合有适当风味的悬浮剂或分散剂，比如合成的和天然的树胶，比如黄蓍胶、***胶、甲基纤维素等。其它可用的分散剂还可包括甘油等。对于肠胃外给药，无菌混悬剂和溶液剂是期望的。当需要静脉内给药时，采用等渗制剂，其通常包含合适的防腐剂。

化合物或调控剂可通过注射由溶解在惰性液体载体中的活性成分构成的剂型，作为非肠道给药的替代。所述注射可以是肌内、管腔内、气管内、或皮下注射。可注射的剂型由混合了适当惰性液体载体的活性成分组成。可接受的液体载体包括植物油，如花生油、棉子油、芝麻油等，以及有机溶剂，如丙酮缩甘油、环亚甲基甘油醚等。作为一种替代方法，也可以使用含水肠道制剂。植物油是优选的液体载体。通过将活性成分溶解或悬浮在液体载体中制备该剂型，使得在最终剂型含有0.005％至10重量％的活性成分。

本发明的所有引用在此并入本文作为参考。此外，也通过引用并入的先前提交的美国专利申请：2001年10月30日提交的60/340,938、2001年10月30日提交的60/338,997、2001年10月30日提交的60/340,081、2001年10月30日提交的60/341,012、2002年10月30日提交的10/283,975、2006年10月30日提交的11/589,660，包括所有引用的参考文献。本发明公开了下列非限制性实施例作进一步的说明。

实例1

材料和方法

临床评估

在一个示例里，从开放标签、多中心、不对照的第2阶段研究里收集骨髓样品，该研究对过去未经治疗的高风险AML老年患者采用替吡法尼(R115777，)和法尼基转移酶抑制治疗的疗效和安全性进行研究。

样品采集与处理

经患者同意后，可在替吡法尼治疗前收集骨髓标本，随后在现场对单核细胞进行加工处理。用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释骨髓抽取物，用ficoll-diatrizoate(1.077g/ml)离心分离。用PBS洗涤富氧白血病血细胞两次，于含有10％DMSO的PBS中重悬，并立即在-70℃至-80℃冷冻。利用Trizol试剂盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)从细胞样品中提取总RNA。通过评估安捷伦生物分析仪上核糖体的存在来确定RNA质量。质量好的样品采用基因芯片分析进一步处理。根据生产商(Qiagen，Santa Clarita，CA)的操作说明，从经过Trizol处理的同一骨髓样品中分离DNA。检测样品的全局基因表达、N-RAS突变，和/或特异性基因的定量PCR(如图1)。

N-RAS基因突变状态

如前面所述，用PCR和RFLP分析确定N-RAS中的激活突变分析。End等人(2001)。N-RAS基因的外显子1和2在单个多重反应中同时扩增，将等分试样用于第二轮PCR。第二轮扩增中，自然或引物诱导的限制性内切酶位点的抗裂解表明了突变的存在，所属突变在被分析的基因座破坏了上述位点。用于分析的限制性内切酶的特异位点是Bsl I(N-ras密码子12和13)，Msc I(N-ras密码子61，位置1和2)，和Bfa I(N-ras密码子61，位置3)。反应过夜消化，在安捷伦生物分析仪上对PCR产物进行分析。

基因芯片分析

根据Affymetrix(Santa Clara，CA)的规程合成cDNA和cRNA。由于许多样品的产量低，按照前面所述的美国专利公开号20070048782，进行两轮线性扩增。为了杂交，在40mMTris-乙酸盐、pH值为8.1、100mM的醋酸钾和30mM的醋酸镁中，11微克的cRNA在94℃的环境中孵育35分钟来实现随机片段化。片段化的cRNA放在设定在每分钟60转的45℃的摇床中16h，使之杂交U133A阵列。杂交后，洗涤阵列(用6x SSPE和含有Triton X-100(0.005％)的0.5x SSPE)，并用链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE；Molecular Probes，Eugene，OR)染色。使用Agilent G2500A GeneArray(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)的扫描仪，对结合有标记物的探针进行量化。

每个阵列的总荧光强度被调整到600的均值。通过计算信号对噪声比(原始的平均信号/噪声)，使芯片的性能定量化。如果它们的信噪比为小于20，或目前寻呼(presentcalls)在芯片上小于30％，那么从下一步分析中移除芯片。如果它们的目前寻呼存在至少10％的芯片上，进一步分析只包含基因。约12,000 Affymetrix公司探针组保持遵循这个临界值。基因表达数据的质量进一步通过受基于主成分分析的离群数据辨识以及基因强度的正态分布分析控制(Partek Pro V5.1)。微阵列数据已经存放在NCBIs基因表达汇编里(GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

应答定义

当患者有完全缓解(CR)、部分缓解(PR)，以及血液改善(HI)时，就可以定义为对替吡法尼应答。简单地说，把HI定义为所有骨髓原始细胞计数不到5％或骨髓原始细胞至少减少一半。把疾病进展(PD)定义为骨髓原始细胞或骨髓原始循环细胞比基线增加＞50％，或出现新的循环原始细胞(至少连续2次)。疾病稳定(SD)定义为任何不符合CR、PR、HI、或PD标准的应答。

把统计分析

用ROC分析测试单个基因和/或多个基因分类的整体预测值。用以下基因筛选标准对响应者和疾病进展患者中的差异表达基因进行筛选：鉴别应答者的特异性为100％为敏感性＞＝40％，T-检验p值(log2异方差转换后的数据)＜0.05，倍数变化＞2。通过这些标准的基因用AUC(ROC曲线下面的区域)分级。

建立一个分类，用应答评分计算每位患者对替吡法尼治疗应答的可能性。所述应答评分被定义为加权表达信号和作为权重的t-统计量之间的线性组合。阈值由试验组的ROC曲线确定，以确保敏感性为100％和特异性达到最高。用为了确定预测所需的基因数量，使用留一交叉验证法(LOOCV)。基于基因的不同数量，记录“left-out”样品的应答评分。对于基因数量不一的预测表现，根据以下因素来评估预测的表现：误分率、灵敏度、特异性、测量两个预测组的Kaplan-Meier曲线分离的p值。相应地选出最好的预测。

Top Scoring Pair(TSP)算法最早是由Geman等提出的(2004)。本质上，该算法是根据事件频率的绝对差值(Dii)排列所有基因对(基因i和j)，其中在C1和C2类的样品中，基因i的表达值比基因j的要高。如果有多个得分高的对(共享同一个Dij)，选择排名次要的最高对，在所选的基因基因对内基因表达水平倒置在每级都会出现。在所有样品中，选择频率最高的得分高的对为候选对，其中所述最高频率指绝对Dij＞大于2倍变化的。然后在一独立的测试数据集中评估候选对。

在试验数据集中使用缺一交叉验证法(LOOCV)以评估该算法如何执行。根据最大的误分率，评估预测的表现。所有统计分析都使用R(R Development Core Team，2006)。

实时定量RT-PCR

根据销售商的说明，对于每个样品，1μg总RNA(以OD₂₆₀评估)的逆转录使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)。然后将样品放在25℃下10分钟，然后37℃下30分钟以获得最佳的RNA转换。QPCR分析使用ABI Prism 7900HT序列检测***(Applied Biosystems，Foster City，CA)所有样品重复测定三次。每个反应包含5μlUniversal PCR预混液，其中包含UNG(Applied Biosystems，Foster City，CA)，4.5μl cDNA模版和0.5μl 20x测定所需的基因表达检测预混液或9pmol的正向和反向引物，和2.5pmol探针(Applied Biosystems，Foster City，CA)，总反应体积为10μl。所有引物、探针组的选择都依据所使用的小扩增子大小(小于100个核苷酸)和FAM荧光探针。使用的探针和引物为APTX(产品编号4331182 Applied Biosystems)和RASGRP1(产品编号4351372Applied Biosystems)。RASGRP1：APTX表达比的计算为：通过减去样品集里平均Ct归一化Ct值，除以标准偏差，然后算出各基因(APTX-RASGRP1)归一化的Ct值的差值。

结果

本研究旨在探讨过去未经治疗的高风险急性髓性白血病老年患者在法尼基转移酶抑制剂替吡法尼的2期临床试验中的基因表达谱。Lancet等人(2006)。在用替吡法尼治疗前采集67例患者的骨髓样品，用Ficoll-密度离心法富集白血病骨髓细胞(表1)。把来自13位应答者(9 CR，4 HI)、8位病情稳定患者以及13位疾病进展患者的高质量的总RNA扩增、标记、和Affymetrix U133A基因芯片杂交。用qPCR评估总30个样品以验证具体基因，并评估32个样品的N-RAS突变状态。

表1：特征患者比较。

CR＝完全应答；PR＝部分应答；HI＝血液学改善，SD＝疾病稳定，PD＝疾病进展，NE＝无法评估；PGx＝药物基因组

Ras突变状态和病人结果。

筛选来自32AML患者骨髓的DNA以进行N-Ras激活突变(密码子12，13，61)。34％的患者(11/32)表现出N-Ras基因突变，一位患者在多个密码子突变(表2)。N-RAS基因突变状态和对替吡法尼的应答或总生存期之间没有统计上的显著相关性。

表2：

ND＝尚未确定；WT＝野生型；CR＝完全应答；PR＝部分应答；HI＝血液学改善，SD＝疾病稳定，PD＝疾病进展，OS＝总生存期。

来自新诊断AML队列的预测基因的鉴定

下个目标是对新诊断AML病人能预测对替吡法尼应答的基因进行鉴定。为此，在13例应答者(9CR和4HI)和13例疾病进程患者身上进行探索性实验。病情稳定的患者不列入这项分析中，因为不能清楚地鉴别他们是应答者还是无应答者。可用同样的方法来鉴定复发和难治性AML(20070048782)的标记，确定了45组能预测响应的探针组(相应于38个独特的基因)(表3)。旨在鉴别可以预测应答者的基因选择标准：高灵敏度(约100％)、特异性阈值40％和平均基因表达差异至少2倍。基于曲线下面积(AUC)对基因进行排序，其中所述曲线下面积(AUC)是根据试验组的受试者工作特征(ROC)分析定义的。此值表示基因的整体预测值，AUC为1.0时表示完全分类。首先用LOOCV方法对试验组里的每个基因进行初步测试。最上方的基因，RAS鸟苷释放蛋白1(RASGRP1)显示0.95的AUC。

表3：新诊断AML患者中预测应答替吡法尼的45探针组

Spec＝特异性，FC＝倍数的变化，AUC＝受试者工作特征分析的曲线下面积，t统计量为负值表明应答者的基因应答。

对增加分类中基因数量是否能够提高其预测值，也进行了检验。检验采用留一交叉检验法，并作图表示每个分类的灵敏度、特异度及整体误差率，发现仅顶部基因提供了最佳预测值(数据没有显示)。以线性方式增加分类中的基因并未提高其预测值。采用高灵敏度的临界值，LOOCV表明RASGRP1基因表达允许：NPV 88.9％，PPV70.6％，总体预测精度76.9％(图1A)。此外，Kaplan Meier分析显示应答者(386天)和疾病进展应答者(68天)在中位总生存期上存在显著差异(图1B)。因此，单基因的过度表达以高阴性预测值预测了初诊AML患者对替吡法尼的应答，其中所述患者具有。

Top Scoring Pair分类的鉴定

RASGRP1预测值无法通过线性增加所述分类的基因数提高。用另一种基因选择算法筛选可单独提高RASGRP1预测值的基因。为了这个目的，最高得分对算法(TSP)被用来鉴别具有最高预测精度的最佳基因对。Geman等人(2004)。用所述方法获取两个基因表达的最大差异，所述方法也在研究基于定量聚合酶链反应的诊断方法中发挥作用。测试集里的最高分对是RASGRP1和aprataxin(APTX)。RASGRP1和APTX在应答者中分别被表达过度和表达不足。健全的LOOCV显示：在整体误差率仅为8％(图2A)的样品测试集中，最高分配对(TSP)提供85.7％的NPV和91.7％的PPV。预测的应答者和无应答者的总生存期相差357天(图2B)。这些数据表明建模算法的具有低的相关预测误差率。

在独立的复发性或难治性AML中验证RASGRP1：APTX分类

对最高分对(TSP)分类的外部检验是在基因芯片数据集里进行，所述数据集包含54位复发性AML或难治性AML患者的样品。因为尽可能捕获更多的潜在应答者十分重要，所以诊断测定应具有高度的灵敏度(以及高度的阴性预测值)，所述诊断测定能预测对癌症治疗的可能应答。因此，为了确定一个能测试TSP分类的合适临界值，除了保持特异性的水平可接受，还需取得一个能预测应答者的高灵敏度。在测试集中，得到的特异性水平约为30％到100％，而相应的敏感性水平在100％到80％之间。为确保分类能够预测尽可能多的应答者，在测试集中，利用可提供约60％特异性的保守临界值进行检测。该临界值应用于复发性及难治性AML独立检测组中，RASGRP1：APTX基因分类用92％NPV和27.6％PPV(相比较18.5％患病率)对应答者分类(图3C)。应答者的相关比值比是4.38。虽然与单独RASGRP1的预测精度相似，但TSP分类的应用显示了更好的NPV，和改善的预测应答者和进展者之间在98天的总生存期上的差异(图3A)，相比之下，RASGRP1的相应数值为56天(图4)。

QPCR验证RASGRP1：APTX表达比率

两个基因的表达比率可以用与临床更加相关的QPCR检测***。三十个样品(20PD，6CR，3HI和1PR)为qPCR提供了足量的总RNA。因此，在来自初诊AML临床研究的30个样品(10个应答者，20个疾病进展)中，作为替吡法尼应答预测的RASGRP1：APTX基因表达比率利用qPCR评估。在基因芯片平台上检测其中的九个样品，而另外21个样品因RNA质量问题没有被采用。因此，该实验集的三分之二由完全独立的样品组成。

九个样品的评估显示两个平台的RASGRP1：APTX基因表达比率呈正相关(r＝0.74)(图6)。通过使用临界值0，两基因分类以PPV和NPV分别为50％和81％准确预测了三十位患者中的二十位的治疗效果(图3B)。预测耐药患者的中位总生存期为82天，而归类为应答者的患者的中位总生存期为295天(图3C)。

RASGRP1：APTX分类在没有FTI治疗时无预测实用性

在独立的基因芯片数据组中，测试两个基因表达比率，所述基因芯片数据组由116位接受化疗方案的AML患者组成。RASGRP1：APTX分类用于这组患者，采用与接受tipifanib疗法人群相似的临界值，二者的总生存期上并未出现显著差别(图5)。当使用其他范围的临界值时，也观察到显著的生存期差异(表4)。这表明RASGRP1：APTX分类特异性地用于对接受过替吡法尼治疗的患者分类，与非-FTI不相关。另一方面，当预测标记应用到复发和难治的AML患者，在总生存期方面有很明显的分层。

表4：

OS＝总生存期

实例2

该实施例描述了一个改良RT-PCR测定，适于将两基因测定应用到FTI联合治疗中。在分析检测中为以下3标记设计Taqman检测：RASGRP1(激活RAS的鸟苷酸交换因子)，APTX(参与DNA切除修复的Aprataxin)和HMBS(作内部参考)。HMBS作为内部参照用于一个实施例，但在其它实施例中省略。本申请的摘要部分和序列部分列出了Taqman引物探针组及其扩增子。即，对APTX-SEQ#3-4和2，RASGRP1引物探针组SEQ#56和1；和HMBS-SEQ#7-9。

在单管多重形式下利用ABI-7500平台以评估2基因比率表现，其中所述评估利用FAM-标记的RASGRP1，Gold 540-APTX和Cy5-HMBS，从而发展并优化定量RT-PCR检测。JY细胞RNA和通用RNA(Stratagene)用作外部归一化。

RASGRP1：APTX比率＝2^-((A-B)-(C-D))

其中A：样品RASGRP1 Ct值

B：JY(或通用)RNA(+)RasGRP1 Ct值

C：样品APTX Ct值

D：JY(或通用)RNA(+)APTX Ct值

如果提供其他来源的细胞RNA用于检测，用于外部归一化的个别细胞RNA对测定分析参数(特别是是阀值)重新计算。用于外部归一化的参照RNA优选自在给定条件下生长的细胞系，其中所述参照RNA对FTI相对不应答。不受理论的限制束缚，一个合适的参照RNA可能源自对FTI有中性应答的细胞系。除了对FTI治疗无应答的患者，这样的细胞系参考也可源自基于两个基因测定在阈值区域的测试患者。因此，不受理论的约束，这样的患者会成为完善改良参照RNA的可能来源用于两个基因比率测试。当细胞系在两个基因测定中用作外部参考时，完善和估测细胞系的可行方法之一是选择一个趋向提高阈值的细胞系。这个标准是合理的，因为这样的细胞系把测定的两个基因比率降低(由于两个被测基因应答之间可能的相关性)到最小。此外，考虑到绝对定量的影响，也可使用给定的APTX和RASGRP1 RNA组合来选择外部参考，通过用AUC使应答者和非应答者之间的区别最大化。外部参考的选择并非是两个基因测定中阈值变化的唯一来源。

完善两个RT-PCR形式，并用标准曲线分析评估它们的表现。无论是利用3个标记的原始C_ts，还是利用源自它们的2基因比率值(R2＝1-0.93，P＜0.000；表5)，这两种形式在高Pearson相关性时显示等同表现。

表5：RUO和GMP RT-PCR检测中Pearson相关性

RUO使用由(Cat.No.4392938)商售获取的RNA-to-CtOne StepRT-PCR试剂盒。根据制造商的说明书，放入50ng的总RNA，这个形式的反应体积是20μl。根据制造商的说明，这种形式反应体积20μl，50ng总RNA。

GMP形式基于BLN RT-PCR试剂盒组分(Breast LymphNode(BLN)Test Kit，IVD，Cat #2900004)及BLN Enzyme Mix，IVD，P/N7700040和BLN Base Master Mix，P/N 7700031用于RT-PCR预混。利用下述优化的RT步骤，该GMP形式具有50ng RNA输入的25μl反应。

GMP形式中RT-PCR多重规程

在三重qRT-PCR检测中，用总RNA中的50ng作为目标输入，其中所述三重qRT-PCR检测在Applied Biosystems Prism 7500序列检测***上操作，反应体积是25μL。把RNA样品(包括归一化参考RNAs)在冰上解冻，并将其稀释至10ng/μl。该qRT-PCR操作需要来自BLN RT-PCR Kit(Breast Lymph Node(BLN)Test Kit，IVD，Cat#2900004)的试剂：BLN Enzyme Mix，IVD，P/N 7700040和BLN BaseMaster Mix，P/N 7700031。

25X探针-引物混合液制备包括：400nM SEQ No.1和2，分别地，和200nM FAM-标记的RasGRP1(SEQ No.10)；400nM SEQ No.3和4，以及200nM Gold 540-APTX(SEQ No.11)，和400nM SEQ No.8和9a，以及200nM Cy5-HMBS(SEQ No.12)，如表6所示。

表6：25X探针/引物混合液

3plex-1(25X)	序列	Add/rxn原液	500	最终浓度.
					标记				在25μL中
RASGRP1	RASGRP1 SEQ No.1	0.10	50.00	0.4μM
						RASGRP1 SEQ No.2	0.10	50.00	0.4μM
	RASGRP1(Fam)SEQ No.10	0.05	25.00	0.2μM
					APTX	APTX SEQ No.3	0.10	50.00	0.4μM
	APTX SEQ No.4	0.10	50.00	0.4μM
						APTX SEQ No.11(Gold)	0.05	25.00	0.2μM
HMBS	HMBS SEQ No.8	0.10	50.00	0.4μM
						HMBS SEQ No.9	0.10	50.00	0.4μM
	HMBS SEQ No.12	0.05	25.00	0.2μM
						idTe	0.25	125.00
	总计	1.00	500.00

每个反应包含9μL的BLN Base预混液、10μL的2.5X BLN酶混合液和1μl 25X的引物/探针混合液。引物/探针混合液中，正向和反向引物的最终浓度为400nM，每个指标的荧光探针的最终浓度为200nM。把来自患者样品或归一化参照的5μl总RNA加到20μl的RT-PCR预混液里。

基于用作外部归一化参照的JY细胞RNA，确定阈值/监界值为5.2。

qRT-PCR按照如下循环参数进行：在95℃下1分钟以变性；在58℃30分钟(RT反应)；5％比率升至70℃，以及孵育2分钟，接下来40个循环的95℃15秒(变性)和60℃下1分钟(退火/延伸)。在一个单管多重装置GMP RT-PCR形式中，优化的探针引物浓度，得到一个对来自骨髓和外周血样品的RNA靶标的高强高敏感的检测，检测在0.6ng水平下的Ct值约31，即在Ct值的低变异性和高度再现性的范围中(图3)。基于GMP级试剂配制和用于FDA许可的BLN试剂盒(例如Tth聚合酶(酶混合液)和基础预混液)生产的基础，该反应形式适用于商业测试。表7中提供了一些基于规程的预混液细节。

表7：基于规程的预混液

数据分析

1.采用标准

获取自ABI7500数据输出文件的循环阈值(CT)用于数据分析。如下选择每个标记“未检测到”的C_t限值：

HMBS(内部对照标记)Ct值不应大于30；

RASGRP1 C_t-不大于35并且

APTXCt-不大于35。

如果一个样品具备RASGRP1或APTX两个标记中任何一个超过C_t临界值的话，则被视为“未检出(No Test)”(从数据分析中排除)。表8中列出的结果显示了单重和三重(单管)形式下RT-PCR在比较斜率和PCR效率时的等效。表9显示延伸RT步骤至30min时的进一步改进。

利用RT-PCR GMP格式，通用RNA(来自AGILENT^TM)和JY RNA对照(源自室内培养的细胞系)与第2阶段T+E研究的37个患者样品运行RT-PCR。该分析随后用40个患者样品重复。基于结果的POC曲线分析，列于表10的两种分析结果表明，使用JY或通用RNA参照就利用调整阈值的原始C_t归一化而言，测定的表现等同。

通用RNA作为外部参照时的阈值为7.3，而JY RNA作为外部参照时的阈值为5.2。在这些阈值测定中，计算处理的CR作为应答标准，处理的所有其他的应答类型被视为非应答。

虽然在2基因检测中的阈值是无量纲的(即为RASGRP1与APTX比率)，不受理论的约束，据信该阈值可依赖于标准条件和所用的试剂。因此，相对于基于标准表现的指定阈值是优选的，例如基于标准的ROC曲线。因此，可以调整阈值/临界值以满足其他要求，如外部参照变化时保持AUC值恒定。在这种情况下，使用通用RNA代替JY RNA作为外部参照导致较高的阈值/临界值7.3，而AUC不变。

实例3

这个例子显示了两基因检测在新诊断的AML患者中是有效的。2基因应答预测分析测试首先在一组84位初诊AML患者的白血病细胞中进行，所述患者参加了替吡法尼和依托泊苷的第1阶段剂量研究，其采用在Blood 2008，111：2589中描述的RT-PCR技术方案。第一阶段试验的临床计划描述于Blood 2009，113：4841。

简而言之，对来自该研究的51个未公布评估的患者样品进行了分析，以对2基因检测的性能表现初步评估。表11汇总了阈值为5的，RR代表表现CR或PR应答者的应答速度，PPV为阳性预测值，NPV为阴性预测值。51例患者中的13个应答的RR值为约0.25。在两基因检测那些超过阈值5的人中，一半(18中的9个)应答为约0.5的PPV。在不超过阈值的患者中，33人中有29个不应答，导致NPV为0.88。

比较RUO和GMP RT-PCR形式

使用RUO和优化的GMP RT-PCR形式基因表达图谱，对来自初诊AML患者的33份骨髓标本的临床应答评估进行了分析。数据组的一个患者样品不满足分析纳入标准，因此被排除出两个数据组。最好应答表现的病人注释列于表12。

在随后的数据对应中，对33名患者再次进行了分析，发现有7个完全缓解(CR)，4HI，3PR，7PD和11SD病例(表13)。当使用CR作为应答标准时，7例患者被列为应答者且25个列为非应答者，而当使用CR/PR/HI作为应答标准时，12例患者被列为应答者且20例患者列为无应答。

对测试结果进行初步统计分析以评估分离“正常”(应答者，R)与“不正常(非应答，NR)可能的临界值，应答患者表现出CR，PR或HI，两种RT-PCR形式的ROC曲线分析表明几乎等同的检测性能，而2基因的AUC值比率等于71％(表14)。基于ROC曲线分析算法，当使用JYRNA作为归一化参照时，RUO方案的临界值被确定为4.7，GMP形式的临界值为5.2。不受理论的约束，基于采用的形式基础上的阈值和其他参数的差异被认为是，在某种程度上，由于RT-PCR程序和统计误差的特异性或效率。

表14：RUO和GMP形式比较

对于表12和表13列出的数据，在后期的数据分析中，视应答者为仅表现出完全缓解(CR)的患者，PR和HI患者被纳入非应答者组(见表15中结果)，其相应于RUO方案的阈值为5.1，而基于ROC曲线分析算法的GMP格式相应的阈值为5.2。

当GMP RT-PCR数据组使用临界值5.2时，总应答率(患者表现出CR或PR或HI)从38％(ORR)增加至86％(PPV)，而使用JY RNA时阴性预测值为76％(表16)。换言之，两基因检测实际应答中86％的病人被列为应答者，这是一种改进。这一结果可与年轻患者诱导治疗的70％应答相媲美。换言之，在GMP的RT-PCR形式检测中表现出2基因比率值大于5.2的那些患者中有86％(6/7患者)对替吡法尼和依托泊苷的组合治疗有应答(对应于PPV为86％)。与此相反，2基因比率值小于或等于5.2的患者中仅有24％(6/25患者)对替吡法尼和依托泊苷的组合治疗有应答，但在2基因检测中未检测到。应当指出的是，可以调整阈值/临界值以满足其他要求，如外部参照变化时保持AUC值恒定。在这种情况下，使用通用RNA代替JY RNA作为外部参照导致在一个约8的较高阈值/临界值(从约5)。

对仅表现出完全恢复的应答者的随后分析列于表17，显示了优异的NPV值和更高的灵敏度和相媲关的特异性。

Kaplan-Meier曲线分析中危险比(HR)为2.3表示了正向的趋势，在老年初诊AML患者中与替吡法尼和依托泊苷组合相比较有利于2基因检测在R和NR预测应答中的有效性(图8和图13，二者在用于鉴定应答者的定义中不同)。基于检测性能特性的等效性，GMP形式期望被进一步发展为伴侣诊断分析。

进一步的GMP RT-PCR形式测试

随后，通过向现有的一组33个骨髓样品增加4个评估全血样品，在37例患者中用进一步改进的单管多重RT-PCR检测法进行了测试。就三个标记而言由于骨髓和全血样品均源自相同的原始Ct值，它们被合并在一个单一的数据组，归纳于表18。接收器-操纵子特征(ROC)分析表明2基因比率的差值为80％(AUC＝0.80)在完全缓解(CR)患者组中用于预测整体应答的应答标准，相应的整体应答ORR(24％)计算为CR(9)/总患者N(37)。示于图9和图14。在2基因比率临界值为5.2时检测灵敏度为67％，特异性为93％。

在表18的应答者定义范围内，表18中扩展的患者组整体检测表现在表19中描述。

实例4

该实施例表明，与先前的实施例一致，两基因检测法对于包含FTI的治疗是特异性的。另一药剂的协同存在没有明显降低FTI对于两基因检测有效性的需求。

然而简单地，在一组通过2基因检测鉴定患有AML的患者中，对这种患者利用包含FTI(如Zarnestra)的组合治疗可能是有效的，但是可以预期的是，当组合治疗中不存在一种FTI时，2基因检测法将不会有帮助的。

为了实验性评估2基因检测的特异性，测试了来自没有被FTIZarnestra治疗过的AML患者中的41个样品，以确认应答是否与与2基因检测结果相关。这些患者均采用ARA-C，蒽环类和VP16(AcDVP16，N＝23)和FLAM(n＝18)组成的传统化疗方案治疗。图10表明2基因比率和临床应答或总生存期之间没有显著关联性。因此，这些结果进一步证实了2基因比率检测法不能在非FTI-治疗的AML患者中预测治疗应答。ROC AUC测定为为0.5，表明了在预测不包括FTI的化疗方案的临床应答中没有显著价值。

此外，当受试者基于2基因比的中位数(0.959)被列为或高或低比率，即第25分位数(0.561)，第75分位数(1.248)，总生存期没有表现出有益效果。生存分析如下：1)所有患者，2)仅VP16和3)仅FLAM。结果(图10和15，所有患者)显示，在中值比率分层的两组之间以及治疗方案分层的两亚组之间总生存期(天数)没有显著差异。使用在第25和75分位数(数据未示出)的切点时也发现了这一点。

实例5

本实施例说明并非所有的样品采集技术是等效的。依赖于样品收集方案的过度RNA降解和其他来源的变异可以影响两基因检测。

样品收集方案通常需要在两基因检测的实施之前使用骨髓样品。对于AML患者这不仅是相当侵扰性的，也是痛苦的。新的方案允许使用全血，如本例中所述。

为检测等效性确定一个优选的样品采集方案(样品类型)，试验研究在两种类型的样品(骨髓与全血)中进行，分别使用三(3)个收集方案(Paxgene***与一个在肝素和EDTA管中的标准收集方法，以及通过Ficoll-Paque离心法)。对约翰·霍普金斯大学SidneyKimmel Comprehensive Cancer Center提供的11例AML患者进行了测试。

根据在图11中所示的工作流，对两个样品类型的每一个均用三种采集方法，从每个患者抽取大约11毫升的血液和8-10mL的骨髓。依据实验设计测试了以下六项方案，如图11所示：

方案1：PAXgene^TM骨髓***目录No.764114(PreAnalytix，A QIAGEN/BD COMPANY)。收集2毫升容积的BMA于PAXgene^TM骨髓管，并在冷冻冷藏包上环境温度下24小时内转运到VRX。收到样品时使用PAXgene骨髓RNA试剂盒分离RNA(Cat.No.764133)。

方案2：在肝素钠管(2mL样品量)收集BMA，并在冷冻冷藏包上环境温度下24小时内运到VRX。Ficoll-Hypaque密度梯度离心步骤与细胞沉淀在-80C直接冷冻和用QiagenBlood Mid试剂盒提取RNA在Veridex中进行。

方案3：在EDTA管(2mL样品量)收集BMA，并在冷冻冷藏包上环境温度下24小时内运到VRX。Ficoll-Hypaque密度梯度离心步骤与细胞沉淀在-80C直接冷冻和用BloodMidi试剂盒提取RNA在中进行。

方案4：PAXgene^TM血液***。在PAXgene^TM血液试管中采集2.5mL血液(Cat.no.762165，PreAnalytix，A QIAGEN/BD COMPANY)并在冷冻冷藏包上环境温度下24小时内运到VRX。使用PAXgene Blood RNA试剂盒(Cat.no.762164)在Veridex内分离RNA。

方案5：在肝素钠管(4mL血液)收集全血，并在冷冻冷藏包上环境温度下24小时内运到VRX。将3mL血液转移到4毫升CPT管，随后Ficoll分离单核细胞和在-80C直接冻结细胞沉淀在Veridex中进行。使用Qiagen Blood Midi试剂盒提取RNA。

方案6：在EDTA管收集全血(4mL血液)，并在冷冻冷藏包上环境温度下24小时内运到VRX。将3mL血液转移到4毫升CPT管，随后Ficoll分离单核细胞和在-80C直接冻结细胞沉淀在Veridex中进行。使用Qiagen Blood Midi试剂盒提取RNA。

基于Agilent BioAnalyzer QC得出的结果，相对于最常用于临床实验室设置的肝素和EDTA方案，对所有11例患者的骨髓和血液样品使用PAXGene***均得出质量良好的RNA。

RNA完整性评估(RNA QC)的直接方法是在Agilent BioAnalyzer上运行RNA和计算RIN值(RNA完整性数目)。按照Qiagen公司的PAXgene***建议，RNA具有RIN7及以上(至10)被认为是质量良好的目标。请参阅表17中用于11例患者样品的稳定性研究的用RIN值列出的附加数据。突出显示为黄色的RIN值对应于质量差的RNA样品(来自肝素和EDTA管)。基于可评估的基础上获取样品，相比其他2种类型的收集管，PAXgene***生成的只有良好质量的RNA。在表20中，NE代表没有评估；NA表示无法获取；约2至5的RIN值表示降解的RNA；为约5至7的RIN值表示勉强合格RNA。

由于样品制备步骤后样品量不足，样品标记NE为没有分析。

图12(板A和B)示出了骨髓样品数3和6展示了肝素的管中大量RNA降解，该降解升高了2基因比率值。原始Cts与RIN值呈负相关：对于低RIN值高Cts均产生在肝素和EDTA方案的所有3个通道。

如图12A和12B所示，两基因检测中没有样品超过阈值5。由于采集方案的变化导致的两基因检测中的散点见图12B。肝素和Paxgene骨髓采集方案为这些患者定义了两种极端的边界，患者3和6有最分散的散点。表20中的数据检查显示，全血采集方案很好地与彼此关联，而对于骨髓采集方案却不能说具有相同情形。事实上，基于表20和图12A和12B，可以认为两基因检测优选使用全血进行。为确保一致性，PAXgene PB方案是优选的。不受理论的约束，据信RNA降解在骨髓样品比全血中可能会更迅速地发生，因此EDTA(肝素)管和PAXgene***之间显示了低水平的相关性。

此外，肝素管收集骨髓样品看起来比其他方法更不可靠，值得注意的细节是整体提高样品的采集方法用于检测而不是提高本发明批露的两基因检测。

图11中的六(6)种收集/处理方案与Pearson相关系数(R2)和骨髓(BM)和血液样品p值(PB)均列于表21。对于从肝素，EDTA和PAXgene管的血液样品(以红色突出显示的值)中获得的RNA样品，其两基因比率之间可观察到良好的相关性。然而，PAXGene骨髓样品和其他收集方法之间的相关性可观察到较差。这个观察与当骨髓样品在处理前24小时内在环境条件下被存储(转移)时肝素管缺乏稳定导致RNA模板不稳定是一致的。根据这些样品中观察到的RNA的完整性和2基因比值的可靠性，这些观测也支持PAXGene全血***作为优选的收集/处理方案。

实例6

基于前面实施例3部分描述的患者，该实施例示出了替吡法尼剂量调整以平衡毒性与用两基因检测协助的直接FTI联合治疗患者的治疗有效性。以后的分析在确定更好的替吡法尼和依托泊苷剂量策略的背景下进行分析，还通过视CR为应答，其余为无应答者改进了关于RUO和GMP RT-PCR形式的分析。这种后续分析的结果已列于前面所描述的实施例。

讨论

在癌症病人的临床管理中，对患者群分类以预测治疗应答变得越来越有价值。例如，为了提供优质治疗需要伴随诊断以对那些作为针对性治疗例如用于转移性乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin，Genentech)和用于大肠癌的西妥昔单抗(Erbitux，Merck)治疗候选者的患者分类。预测生物标志物也用于治疗胃肠道间质瘤的伊马替尼(格列卫，诺华药厂)，治疗肺癌的厄洛替尼(Tarceva，OSI Pharmaceuticals)和吉非替尼(Iressa，Astra-Zeneca)。目前还没有可利用的方法以预测包含FTI的组合疗法的应答。

RASGRP1在仅用一种FTI处理的交叉验证组中以总体预测精度77％被认定为最强的单预测基因表达标记。RASGRP1是一种特异性激活RAS的鸟嘌呤核苷酸交换因子。RASGRP1的表达已在脑细胞，T-细胞，单核细胞谱系的细胞和原始的造血前体细胞中发现。

本发明提供了作为应答FTI组合治疗的强力预测因子的RASGRP1和APTX表达比值。在新诊断组的AML中上述两基因分类表现了预测实用性。

本发明所公开的简单qPCR为基础的诊断方法比基因表达法在临床上具有更广泛的实用，这是由于它能够检测低质量的临床样品，而这些临床样品通过目前的微阵列技术可能无法成型。另外，该测定可以检测到全血样品中的信号，而不再需要骨髓细胞样品。基于样品、外部参照和仅RASGRP1以及APTX的简单比率计算从而选择某种外部参照的方法使得两基因检测法对患者尤其是老年患者在确定FTI组合疗法是否能帮助他们对抗AML时带来可能。

本发明公开的在当前替吡法尼+依托泊苷试验背景下收集的骨髓提取物回溯性分析验证了2基因签名对替吡法尼应答可作为重复性的预测。分析还表明了对那些很可能应答替吡法尼与那些不应答替吡法尼的AML患者进行事先判断是可能的。数据证实了这样一种观念，即2基因签名对替吡法尼(或法尼基转移酶抑制剂)是相对特异性的，因为在RASGRP1：APTX mRNA比率和两个密集研究化疗方案(其中每个包括ara-C和一种蒽环类与一种第三药剂(flavopiridol或etoposide))之间没有出现预测性关联。在替吡法尼+依托泊苷II期临床试验的背景下虽然阳性预测值为78％，但测试的阴性预测值(NPV)略低(87％)于替吡法尼单药治疗研究报道的NPV(其在约95％的范围内)。这种单一和联合疗法之间NPV明显的差异，在某种程度上与对依托泊苷应答相关。

概括地说，本领域技术人员将理解本发明在不偏离其教导或精神的情况下可以多种变化和替代来实现。例如，使用两基因比的一个代数或数学的变量可用于实施该发明。下面所附权利要求的范围包含多种此类修改。另外，每个参考文献和引用在此通过引用将其全部内容并入本文。

序列

RASGRP1扩增子SEQ No.1

ctggacgatctcattgacagctgcattcaatcttttgatgcagatggaaacctgtgtcgaagtaaccaactgttgcaag

APTX扩增子SEQ No.2

cgcttccgattgggctaccacgccattccgagtatgagccatgtacatcttcattgtgatcagccaggattttgattct

APTX UPPER引物SEQNo.3

cgcttccgattgggctac

APTX LOWER引物SEQ No.4

agaatcaaaatcctggctgatc

RASGRP1 UPPER引物SEQ No.5

ctggacgatctcattgacagctgcattcaatcttttgatgcagatggaaacctgtgtcgaagtaaccaactgttgcaag

RASGRP1 LOWER引物SEQ No.6

cttgcaacagttggttacttcg，

HMBS扩增子SEQ No.7

ccttgcccactgtgcttcctccctggcttcaccatcggagccatctgcaagcgggaaaaccctcatgat

HMBS UPPER引物SEQ No.8

cctgcccactgtgcttcct

HMBS LOWER引物SEQ No.9

atcatgagggttttcccgct

RASGRP1 TAQMAN探针SEQ No.10

FAM-cattcaatcttttgatgcagatggaaacctg-BHQ1

APTX TAQMAN探针SEQ No.11

Gold 540-cacgccattccgagtatgagccatgtac-BHQ2

HMBS TaqMan探针SEQ No.12

Cy5-gcttcaccatcggagccatctgca-BHQ1，

参考文献

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Claims

1.一种给诊断患有病症的患者施用替吡法尼和依托泊苷的方法，所述方法包括：

确定RASGRP1和APTX表达的比率是否超过ΔΔCt阈值，其中RASGRP1和APTX表达各自的水平使用ΔΔCt方法计算，所述阈值对应于测试群体ROC分析中指定的灵敏度或特异性或灵敏度和特异性的最大化总和；以及

如果该比率超过ΔΔCt阈值，那么施用治疗有效量的替吡法尼。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RASGRP1和APTX表达比率使用下列至少一种引物确定：

(i) 5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’

(ii) 5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’

(iii) 5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’和

(iv) 5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其中相对于APTX、β-肌动蛋白和HMBS中的一个或多个评估RASGPR1表达水平。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ΔΔCt阈值为约5.2。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ΔΔCt阈值对应于约70%或更大的曲线下面积。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定以多重形式在单管中进行。

7.根据权利要求2所述的方法，还包括使用外部参照确定RASGRP1表达水平相对于APTX的比率。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述外部参照选自：一个或多个参考细胞系、JY RNA、通用RNA、标准化RNA参考和参考患者样品。

9.根据权利要求1所述的方法，其中样品包括下列中的至少一个：

(i) 骨髓样品；以及

(ii) 全血样品。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者用替吡法尼和协同替吡法尼的另一药剂治疗，其中所述协同替吡法尼的另一药剂是选自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的一种或其衍生物。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病症是AML。

12.一种给诊断患有病症的受试者处方替吡法尼的方法，所述方法包括：

使用下列至少一种引物以扩增来自核糖核酸靶标的信号的方式评价RASGRP1和APTX表达

(i) 5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’

(ii) 5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’

(iii) 5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’和

(iv) 5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，相对于APTX的表达水平评估基因RASGPR1表达的比率。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述测定以多重形式在单管中进行。

15.根据权利要求13所述的方法，还包括使用外部参照确定RASGRP1相对于APTX的表达水平比率。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将所述RASGRP1相对于APTX的表达水平比率与约5.2的ΔΔCt阈值相比。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将所述RASGRP1相对于APTX的表达水平比率与约4.7的ΔΔCt阈值相比。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将所述RASGRP1相对于APTX的表达水平比率与以下阈值相比，所述阈值对应于ROC分析中指定的灵敏度或特异性或灵敏度和特异性的最大化总和。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述曲线下面积为约70%或更大。

20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述外部参照选自：一个或多个参考细胞系、JY RNA、通用RNA、标准化RNA参考和参考患者样品。

21.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，样品包含下列中的至少一个：

(i) 骨髓样品；以及

(ii) 全血样品。

22.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，如果受试者RASGRP1相对于APTX的表达水平的比率大于阈值，则给受试者处方替吡法尼。

23.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，将替吡法尼与另一协同替吡法尼的药剂共同处方，其中所述另一协同替吡法尼的药剂是选自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的一种或其衍生物。

24.根据权利要求19所述的测定，其特征在于，所述另一协同法尼基转移酶抑制剂的药剂是依托泊苷。

25.一种鉴定用于诊断患有髓性病症的受试者的治疗的方法，所述方法包括：

施用第一测定，所述测定基于靶核糖核酸的至少一次扩增而具有第一结果；

基于第一结果和预定的阈值标记不可能受助于治疗组中一种或多种治疗的受试者，各所述治疗需要给予法尼基转移酶抑制剂和协同药剂，所述协同药剂选自：依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂；以及

响应没有被标记的受试者，从治疗组中选择治疗。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，选择所述预定阈值以具有对治疗组中一种或多种治疗的应答的高阴性预测值。

27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，选择所述预定阈值以对治疗组中一种或多种治疗具有高阳性预测值。

28.根据权利要求25所述的方法，还包括基于治疗的相对阳性预测值选择所述治疗。

29.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述髓性病症是急性髓细胞性白血病。

30.根据权利要求25所述的方法，还包括响应于检测到对过去治疗应答的降低，从过去治疗改变为未来治疗的步骤。

31.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，第一测定的阳性预测值基于被期望对法尼基转移酶抑制剂治疗表现出阳性应答的部分受试者来确定，其中所述阳性应答包括完全缓解。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述完全缓解通过以下来定义：在所有细胞系正常成熟的情况下存在的原粒细胞小于5%，至少为1000/µL的ANC和至少100,000/µL的血小板计数，外周血中没有原始细胞，骨髓中没有可鉴定的白血病细胞，清除了与疾病有关的细胞遗传学异常，以及清除了先前存在的任何髓外疾病。

33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述阳性应答还包括部分缓解和血液学改善中的一种或多种。

34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述部分缓解通过以下来定义：在骨髓中存在三系造血存在且ANC和血小板恢复到上述规定水平，但骨髓原始细胞为5至25%，以及骨髓原始细胞百分数从基线减少至少50%；以及血液学改善通过以下来定义：骨髓原始细胞至少有50%的减少，或任何可测量的髓外疾病至少有50%的减少，ANC恢复至500至1000/µL，血小板计数恢复至20,000至100,000/µL，或输血需求改善。

35.一种用于鉴定可能应答包括给予法尼基转移酶抑制剂的治疗的受试者的测定，其通过使用下列至少一种引物以扩增来自核糖核酸靶标的信号的方式评估RASGRP1和APTX的表达：

(i) 5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’

(ii) 5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’

(iii) 5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’和

(iv) 5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’。

36.根据权利要求35所述的测定，其特征在于，相对于APTX、β-肌动蛋白和HMBS中的一个或多个评估RASGPR1基因表达的水平。

37.根据权利要求35所述的测定，其特征在于，所述测定是以多重形式在单管中进行的。

38.根据权利要求35所述的测定，还包括使用外部参照确定RASGRP1相对于APTX的表达水平比率。

39.根据权利要求37所述的测定，其特征在于，所述外部参照选自：一个或多个参考细胞系、JY RNA、通用RNA、标准化RNA参考和参考患者样品。

40.根据权利要求35所述的测定，其特征在于，样品包含下列中的至少一个：

(i) 骨髓样品；以及

(ii) 血液样品。

41.根据权利要求38所述的测定，其特征在于，如果在受试者中的比率大于预定的阈值，则受试者被分类为可能应答法尼基转移酶抑制剂和与其协同的另一药剂一起的给药，其中所述与法尼基转移酶抑制剂协同的另一药剂是选自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的一种或其衍生物。

42.根据权利要求41所述的测定，其特征在于，所述法尼基转移酶抑制剂是替吡法尼，并且所述与法尼基转移酶抑制剂协同的另一药剂是依托泊苷。

43.一种在用于鉴定法尼基抑制剂和另一药剂的组合治疗的应答者的测定中选择阈值的方法，所述另一药剂选自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的一种或为其衍生物，所述方法包括：

处理血液样品以制备富含核糖核酸的制备物；

产生RASGRP1和APTX的表达水平比率；以及

在数据集中最大化一个或多个来自下列组的测量值：治疗的阳性预测值，鉴定应答者的阴性预测值，ROC分析中的AUC，灵敏度和特异性，其中将RASGRP1和APTX表达水平的比率与阈值相比。

44.根据权利要求43所述的方法，其中RASGRP1的表达水平利用RT-PCR测定。

45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，相对于被确定对应特定参考RNA标准品的阈值评估RASGRP1表达水平。

46.一种向诊断患有急性髓细胞性白血病的患者施用替吡法尼和依托泊苷的方法，所述方法包括：

确定RASGRP1和APTX表达的比率是否超过ΔΔCt阈值，其中RASGRP1和APTX表达各自的水平使用ΔΔCt方法计算，所述阈值对应于测试群体ROC分析中的灵敏度或特异性或灵敏度和特异性的最大化总和；以及

47.根据权利要求46所述的方法，其中使用下列至少一种引物确定RASGRP1和APTX表达比率：

(i) 5’-CGCTTCCGATTGGGCTAC-3’

(ii) 5’-AGAATCAAAATCCTGGCTGATC-3’

(iii) 5’-CTGGACGATCTCATTGACAGC-3’和

(iv) 5’-CTTGCAACAGTTGGTTACTTCG-3’。

48.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，相对于APTX、β-肌动蛋白和HMBS中的一个或多个评估RASGPR1表达水平。

49.根据权利要求46所述的方法，其中ΔΔCt阈值为约5.2。

50.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述ΔΔCt阈值对应约70%或更大的曲线下面积。

51.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述测定是以多重形式在单管中进行的。

52.根据权利要求47所述的方法，还包括使用外部参照确定RASGRP1相对于APTX的表达水平比率。

53.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述外部参照选自：一个或多个参考细胞系、JY RNA、通用RNA、标准化RNA参考和参考患者样品。

54.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，样品包括下列中的至少一个：

(i) 骨髓样品；以及

(ii) 血样样品。

55.根据权利要求46所述的方法，其特征在于所述患者用替吡法尼和与其协同的另一药剂治疗，其中，所述协同替吡法尼的另一药剂是选自依托泊苷、替尼泊苷、他莫昔芬、索拉非尼、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、曲妥珠单抗和顺铂中的一种或其衍生物。

56.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述诊断患有急性髓细胞性白血病的患者年龄是55岁或以上，优选60岁或以上，更优选地，65岁或以上。