CN106188555B - 一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系及制备方法和应用 - Google Patents
一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体公开了一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系及制备方法和应用。所述siRNA输送体系是由酸敏双亲性三嵌段聚合物将siRNA浓缩复合于纳米粒子核内，亚表层由PAsp(MEA)形成分子间二硫键实现对siRNA的保护并响应还原性胞浆内siRNA释放。所述酸敏双亲性三嵌段聚合物由聚乙二醇段‑中间段‑酸敏段三段共聚物构成，中间段为聚天冬酰巯基乙胺，酸敏段为聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯。siRNA输送体系可应用制备肿瘤智能靶向siRNA纳米药物，其对N/P比依赖程度低，可实现靶点快速且完全地释放siRNA。为基因输送体系提供一个新的思路，对制备肿瘤的临床诊断及治疗药物具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化学与生物医学工程领域，更具体地，涉及一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系及制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤，又称癌症，已经成为威胁人类健康和生命的重大疾病。对恶性肿瘤的预防、诊断和治疗一直是人们热切关注的问题，近年来随着科技的进步以及各国政府的重视，虽然在该方面取得了重大的进展，但各种治疗方法都遇到了不同的困难，难以同时实现高效、低毒副作用和高特异性治疗。
近年来，RNA干扰因其特异性靶向为肿瘤治疗提供了重要的参考手段，并表现出高效的前期实验室基因沉默效果。然而，因为siRNA的传输问题，其临床应用仍然面临着重大挑战。众所周知，传统的siRNA分子因其较大的分子量和本身所带的负电荷，极难穿过细胞膜实现胞吞；更重要的是，因其极易被核酸酶降解的特性，通常不能到达病灶部位；而即使局部给药且进入细胞，溶酶体酶的降解作用也阻断了其到胞浆发挥作用的可能。这就使得其直接临床应用几乎不可能。因此，稳定高效的siRNA传输***是实现肿瘤RNA干扰治疗的关键。从众多siRNA传输体系中脱颖而出的聚合物阳离子载体具备以下优势：更低的免疫原性和毒性(较病毒载体)，粒径的可调节性，容易实现多功能化及靶向分子的引入。迄今，较成熟的聚合物阳离子载体包括：聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、咪唑类聚合物、壳聚糖和阳离子树枝状大分子。阳离子聚合物通过聚电解质作用将阴离子的siRNA浓缩和封装，组装成纳米尺寸的复合物。这样siRNA被有效地保护，避免酶降解，同时够大的聚合物的氮和siRNA的磷的摩尔比(N/P比)下，即聚合物的阳离子富余时，纳米复合物表面会带正电，可解决裸siRNA难被细胞吸收的问题。然而，这种常用的纳米复合物，由于存在非特异性细胞吸收、血液循环时间短和易吸附血液内阴离子蛋白而聚集等问题，其体内应用大大受限。相反地，传统方法得到的负电纳米复合物(低N/P比复合)，往往因表面负电而难被细胞摄取。更有甚者，正电不足通常意味着siRNA未能被完全保护，这就使得siRNA易被酶降解而达不到输送目的。另外，这种不完全复合容易导致较大的纳米尺寸，易被网状内皮***(RES)吞噬，不易通过增强渗透滞留效应(EPR)实现肿瘤聚集。因此，有效的输送载体***应兼备上述两种纳米粒子的优点且能规避它们的缺点。
为了实现上述目标，一种“表面电位反转”的肿瘤靶向策略被提出并应用于基因的传输。具体地，使用聚(聚乙二醇-组氨酸-聚乙二醇-谷氨酸(poly(PEG-His-PEG-Glu))共聚物和PEI 25k与基因在特定的比例下复合，得到在生理环境条件下(pH 7.4)表面电位为负的纳米粒子，该纳米粒子能长时间在血液内稳定循环，而到达肿瘤部位后，由于弱酸的微环境(pH 6.8)和PEI的强质子缓冲效应，纳米粒子表面会电位转变为正电，能促进细胞胞吞，实现肿瘤的特定靶向。然而，这些明显的缺点制约该体系的进一步应用。首先，该复合物体系的表面电位反转特性对三者比例要求十分严格，在非常有限的比例范围内才能实现复合物表面电位的反转，难以控制；其次，PEI作为siRNA载体，依靠质子缓作用释放基因药物，过程缓慢且最终释放量过低，导致所用siRNA浓度偏高且浪费严重；再者，25kDa分子量支化PEI的使用，其毒性问题不适合长期治疗。因此，需要在上述策略的基础上开发一种新的基因输送体系解决以上各种问题。
发明内容
本发明为了克服现有基因载体难以同时实现体内长循环和易被肿瘤细胞摄取的缺陷，提供一种酸敏双亲性三嵌段聚合物，所述三嵌段聚合物可以将siRNA浓缩复合于纳米粒子核内。
本发明的另一目的在于提供上述三嵌段聚合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系，该输送体系为同时具备上述两点性质的siRNA纳米药物，即体内循环表面带负电但在肿瘤组织可自行电位反转，实现肿瘤智能靶向。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述siRNA输送体系在制备肿瘤诊断药物和/或治疗药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种酸敏双亲性三嵌段聚合物，所述聚合物由聚乙二醇段-中间段-酸敏段三嵌段共聚物构成，所述中间段为聚天冬酰巯基乙胺，酸敏段为聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯，聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的pKa为6.3～6.8。
酸敏双亲性三嵌段聚合物中的PEG能提高稳定性和生物相容性；中间段以聚天冬氨酸为主链，易降解，巯基的引入可形成分子间二硫键，提高稳定性；酸敏段pH 5.0时完全质子化，可实现siRNA的负载，7.4时完全脱质子化，可实现siRNA的释放。
本发明的发明点在于酸敏段的筛选，由于酸敏段特殊的pKa，使最后得到的肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系对N/P比的依赖大大降低，并实现靶点快速且完全地siRNA释放。快速且完全地释放siRNA需要酸敏段需具备以下特征：有较强的质子缓冲效应，能保证siRNA的溶酶体逃逸；从溶酶体pH(～5.0)到胞浆pH(～7.4)时需具备差别很大的质子化程度，最好从完全质子化到完全脱质子化，这样才能实现siRNA的高效释放。聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(PDPA)的pKa在6.3～6.8，可满足上述要求。
更优选地，所述酸敏段聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的pKa为6.4。
优选地，所述酸敏双亲性三嵌段聚合物选用的PEG分子量为1000～5000Da；中间段交联层太薄则捆绑不牢，太厚则在细胞内难以被打开，因此，聚天冬酰巯基乙胺优选的分子量为800～2000Da；酸敏段因在胞浆环境中完全疏水，三嵌段聚合物易自组装成胶束，如果是由原来的纳米粒子解体再组装，则siRNA释放，而如果不是再组装则需要其粒径膨胀足够大，因此，聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯优选的分子量为8000～12000Da。
更优选地，所述聚乙二醇段的分子量为2000Da，聚天冬酰巯基乙胺的分子量为1000Da，聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的分子量为10000Da。
本发明保护如上所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物在制备siRNA输送体系中应用。
本发明保护如上所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物在制备肿瘤诊断药物和/或治疗药物中的应用。
优选地，如上所述酸敏双亲性三嵌段聚合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.以天冬氨酸和苯甲醇为原料，以浓硫酸为催化剂，制备天冬氨酸苄酯；
S2.以天冬氨酸苄酯为原料，缓慢加入三光气，回流制备得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)；
S3.以氨基聚乙二醇(PEG-NH2)作大分子引发剂，引发苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)开环聚合得到PEG-PBLA-NH2；
S4.以2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDAT)为链转移剂，AIBN作引发剂，引发单体2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DPA)的聚合，反应完后用过量AIBN将硫脱去得到PDPA-COOH；
S5.通过酰胺化反应将PEG-PBLA-NH2和PDPA-COOH对接；
S6.用半胱胺与上述对接产物通过氨解反应得到最终产物PEG-PAsp(MEA)-PDPA。
一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系，所述siRNA输送体系是由如上所述三嵌段聚合物将siRNA浓缩复合于纳米粒子核内，亚表层由PAsp(MEA)形成分子间二硫键实现对siRNA的保护并响应还原性胞浆内siRNA释放。所述siRNA输送体系纳米粒子因其小粒径和表面负电荷可在血液内长时间稳定循环，通过EPR效应富集到肿瘤部位。到肿瘤环境后，因微环境pH值的改变，纳米粒子会因大量叔胺的质子化而表现出一定的正电，利于细胞吸收。本发明的siRNA输送体系解决现有基因载体难以同时实现体内长循环和易被肿瘤细胞摄取的缺陷，即可在体内循环表面带负电但在肿瘤组织可自行电位反转，实现肿瘤药物智能靶向。
更优选地，所述肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系的制备方法，包括以下步骤：将三嵌段聚合物PEG-PAsp(MEA)-PDPA溶解在pH值为5.0的缓冲溶液中，并在当前pH值下与siRNA按特定的N/P比复合30min，同样pH条件下，往溶液中通入氧气鼓泡30min让亚表层的巯基充分交联成二硫键，最后将溶液的pH值调至7.4。
本发明为了避免在负电情况下siRNA不能被完全地复合，引入一种新颖的制备方式。具体地，在pH 5.0时复合siRNA，此时酸敏段叔胺的质子化高，聚合物含较多的正电离子，能siRNA很好地浓缩复合纳米粒子核内。同时，在亚表层引入可逆的还原敏感层，将siRNA捆绑保护起来。接下来，将溶液的pH值调到7.4，此时酸敏段因大部分叔胺基脱质子化导致疏水，会形成胶束结构，而由于亚表层二硫键的捆绑，粒径变化不大，且siRNA更受限于胶束核内，被更好地保护，该胶束由于核内siRNA的存在，会呈现出较弱的负电荷。此纳米粒子因其小粒径和表面负电荷可在血液内长时间循环，大大增加了其通过EPR效应富集到肿瘤的概率。在pH 6.5时，即siRNA输送体系到达肿瘤环境后，因微环境pH值的改变，纳米粒子会因大量叔胺的质子化而表现出一定的正电，利于细胞吸收。
本发明还保护肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系在制备肿瘤诊断药物和/或治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系及其优选制备方法，所述siRNA输送体系是由酸敏双亲性三嵌段聚合物将siRNA浓缩复合于纳米粒子核内，亚表层由PAsp(MEA)形成分子间二硫键实现对siRNA的保护并响应还原性胞浆内siRNA释放。siRNA输送体系在血液循环时，具有超高的稳定性，大大提高了血液循环时间和肿瘤富集；而肿瘤微环境的pH响应性让其能高效地被肿瘤细胞摄取，溶酶体逃逸时GSH浓度的大大升高和pH值的变化，触发载体因质子化程度降低完成从亲水到疏水的转变，高效释放siRNA，或可显著提高siRNA干扰效果，本发明的siRNA输送体系解决现有基因载体难以同时实现体内长循环和易被肿瘤细胞摄取的缺陷，即可在体内循环表面带负电但在肿瘤组织可自行电位反转，实现肿瘤药物智能靶向，为基因输送体系提供一个新的思路。
附图说明
图1为三嵌段聚合物的制备及智能靶向和siRNA胞浆释放示意图。
图2为三嵌段聚合物PEG-PAsp(MEA)-PDPA的制备路线图。
图3为三嵌段聚合物在不同pH值下的粒径电位图。
图4为三嵌段聚合物(N/P 18)在不同条件孵育1.5h后的凝胶阻滞电泳图。
图5为三嵌段聚合物的细胞毒性测试。
图6为不同pH条件下细胞对三嵌段聚合物的吸收效率。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1三嵌段聚合物的合成
(1)苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)的合成，反应机理及过程如下：
先合成合成β-天门冬氨酸苄酯。取500mL单口茄形瓶，依次加入100mL无水***，12mL H2SO4(98％)和120mL苯甲醇(1.2mol，1.04g/mL，108.06g/mol)，搅拌后旋蒸掉***。搅拌下分三次加入L-天冬氨酸共16g(0.12mol，133.04g/mol)。室温下搅拌反应12h后，先加入240mL 95％乙醇稀释，再滴加60mL吡啶，析出白色沉淀。置于冰箱冷冻过夜后抽出固体，纯水洗涤。得到的粗产品用纯水在80℃重结晶两次，得到纯净的天冬氨酸苄酯。
再由天冬氨酸苄酯合成BLA-NCA。于一干燥的500mL圆底两口瓶内加入8.0g(0.032mol，223.23g/mol)天冬氨酸苄酯，在N2的保护下，加入约200mL新蒸的乙酸乙酯，在90℃下回流。4.2g(0.0142mol，298.75g/mol)三光气的新蒸乙酸乙酯溶液缓慢滴加入苄酯溶液中，在90℃下，搅拌回流直至溶液变澄清。冰盐浴骤冷，快速用冷的饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次、冷的饱和并氯化钠溶液洗涤一次，萃取分液，乙酸乙酯层经无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩后，加入新蒸石油醚沉淀。白色沉淀过滤后，用乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行重结晶，溶液冷却后，最后收集得到白色针状晶体。
(2)PEG-PBLA-NH2的合成，反应机理及过程如下：
称取2g PEG-NH2(1mmol)70℃真空干燥4h，冷却后氮气保护下，先用20mL新蒸CH2Cl2溶解，再加入BLA-NCA的DMF溶液(1.5g溶解在2mL无水DMF中)，充分搅拌，反应开始有大量小气泡生成。密封反应瓶，35℃的油浴中加热搅拌反应72h。反应结束后，沉淀在大量的冷无水***(约500mL)中，经离心和无水***洗涤，真空干燥得到PEG-PBLA-NH2。
(3)PDPA-COOH的合成，反应机理及过程如下：
经碱性氧化铝柱除去阻聚剂的单体DPA(2.10g，9.88mmol)，链转移剂DDAT(90.0mg，0.247mmol)和AIBN(2.0mg，0.012mmol)加入到25mL的反应瓶中，Ar保护下加入10mL新蒸的二氧六环溶解，待全部溶解后，通Ar气鼓泡30min除掉体系中的氧气，密封反应瓶并在80℃下反应8h。反应结束后，骤冷，然后用3500Da的透析袋在二氧六环中透析两天除掉未反应的单体，然后再用水透析两天除去二氧六环，最后冻干得到黄色固体PDPA-DDAT。PDPA-DDAT用15mL二氧六环溶解，并加入20倍过量的AIBN(0.9g)，待完全溶解后，通Ar气鼓泡30min除氧，在80℃下反应8h。反应结束后，迅速冷却到室温，然后把反应溶液转移到3500Da的透析袋在二氧六环中透析三天除去小分子，然后再用水透析两天，最后冻干得到白色固体PDPA-COOH。
(4)PEG-PAsp(MEA)-PDPA的合成，反应机理及过程如下：
三嵌段聚合物由酰胺化对接反应得到。将1.2g PDPA-COOH，24mg NHS，40mg DCC加入到50mL的反应瓶，并用20mL的CHCl3溶解，在室温下搅拌反应1h。0.71g的PEG-PBLA-NH2用10mL的CHCl3溶解后，加入到上述反应溶液中，继续在室温下反应两天。反应结束后，反应溶液用针筒过滤器滤去不溶物DCU后沉淀在无水***中，抽滤收集沉淀，抽干溶剂得到白色固体PEG-PBLA-PDPA。终产物由PEG-PBLA-PDPA通过巯基乙胺氨解反应得到。1.5g PEG-PBLA-PDPA，0.9g巯基乙胺用30mL的DMF溶解，在35℃下反应48h后，反应液用3500Da的透析袋在无水甲醇中透析3d，旋干溶剂得到白色固体终产物PEG-PAsp(MEA)-PDPA。
实施例2纳米复合物的制备及表征
取实施例1制备得到的三嵌段聚合物溶解在pH 5.0的PBS中，然后按纳米复合物制备方法准备纳米粒子，选取N/P为18，24和30的复合物，测定其水力学直径及表面电位，结果如图3所示，由于亚表层二硫键的限制，三嵌段聚合物粒径没有明显的pH依赖关系，均小于100nm。电位结果显示，pH 5.0时，聚合物酸敏段叔胺完全质子化，能将siRNA很好地复合，复合物带正电；当pH值变为7.4后，由于大量的叔胺脱质子化造成PDPA段疏水，会形成类似胶束的结构，将siRNA包裹在胶束核内，此时纳米粒子表面会因siRNA存在而呈负电性，即得到了表面带负电的稳定siRNA输送体系；到肿瘤组织略酸微环境(pH 6.5)后，此时PDPA段有接近50％的质子化程度，会与siRNA有一定的复合作用，且正电足够，纳米粒子表面均带正电。电位和粒径的结果证实了该复合物体系，在较宽的N/P比范围内，都能得到在pH 7.4和6.5条件下具有相反的表面电性纳米复合物，可大大提高肿瘤富集，提高体内应用效率。
实施例3三嵌段聚合物内siRNA释放研究
为了确认siRNA的敏感释放，进行了体外模拟释放实验。按纳米复合物制备方法，将聚合物和FITC-siRNA按N/P比为18准备复合物，并分别在不同条件孵育：(1)为同样量的纯FITC-siRNA；(2)pH 5.0；(3)pH 5.0+10mM GSH；(4)pH 7.4；(5)pH 7.4+5μM GSH；(6)pH7.4+10mM GSH，1.5h后将混合液做凝胶阻滞电泳实验。结果如图4，在pH 5.0时，即使有高浓度的还原剂存在，也没有siRNA的释放(无游离条带)，说明在溶酶体pH下，siRNA仍被聚合物保护，避免被酶降解；只有当pH值上升到7.4，且GHS浓度较高(10mM)时，有一条明亮的siRNA游离条带跑出。该实验很好地证明高还原剂浓度和胞浆环境pH是触发siRNA释放的两个必需条件。
实施例4三嵌段聚合物的细胞毒性检测
采用MTT法检测了三嵌段聚合物在不同浓度下对鼠胶质瘤C6细胞的毒性。结果如图5所示，孵育较长时间(48h)后，聚合物浓度逐渐增加到500μg/mL时，仍未出现较大比例的细胞死亡，直到聚合物浓度达到1000μg/mL后，细胞存活率明显降低，但仍有60％以上的存活，说明聚合物毒性不大。MTT实验结果表明聚合物本身对C6细胞毒性均不大，这对于聚合物应用于体内研究相较于传统阳离子载体(PEI，PLL等)有明显的优势。
实施例5肿瘤特异性靶向研究
采用流式细胞技术进行了定量评价C6细胞对三嵌段聚合物在不同pH条件下的摄取情况。实验结果(图6)显示，在pH 7.4时，聚合物表面均带负电，与细胞膜表面负电相斥，所以较短时间内(8h)，细胞对其几乎没有吸收；而在pH 6.5时，聚合物由于表面带正电，易与细胞膜上负电蛋白相互吸附，实现细胞胞吞，转录效率相比于pH 7.4组提高了近30倍；证明了肿瘤组织环境有利于纳米复合物被细胞摄取，验证了纳米复合物的肿瘤特异性靶向。
Claims (9)
1.一种酸敏双亲性三嵌段聚合物，其特征在于，所述聚合物由聚乙二醇段-中间段-酸敏段三嵌段共聚物构成，所述中间段为聚天冬酰巯基乙胺，酸敏段为聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯，聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的pKa为6.3～6.8；所述聚乙二醇段的分子量为1000～5000 Da，聚天冬酰巯基乙胺的分子量为800～2000Da，聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的分子量为8000～12000 Da。
2.根据权利要求1所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物，其特征在于，所述聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的pKa为6.4。
3.根据权利要求1所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物，其特征在于，所述聚乙二醇段的分子量为2000 Da，聚天冬酰巯基乙胺的分子量为1000Da，聚(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯的分子量为10000 Da。
4.权利要求1至3任一项所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1. 以天冬氨酸和苯甲醇为原料，以浓硫酸为催化剂，制备天冬氨酸苄酯；
S2. 以天冬氨酸苄酯为原料，缓慢加入三光气，回流制备得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐；
S3. 以氨基聚乙二醇（PEG-NH2）作大分子引发剂，引发苄氧羰基天冬氨酸酸酐开环聚合得到PEG-PBLA-NH2；
S4. 以2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸为链转移剂，AIBN作引发剂，引发单体2-（二异丙基氨基）甲基丙烯酸乙酯的聚合，反应完后用过量AIBN将硫脱去得到PDPA-COOH；
S5. 通过酰胺化反应将PEG-PBLA-NH2和PDPA-COOH对接；
S6.用半胱胺与上述对接产物通过氨解反应得到最终产物PEG-PAsp(MEA)-PDPA。
5.权利要求1至3任一项所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物在制备siRNA输送体系中应用。
6.权利要求1至3任一项所述的酸敏双亲性三嵌段聚合物在制备肿瘤诊断药物和/或治疗药物中的应用。
7.一种肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系，其特征在于，所述siRNA输送体系是由权利要求1至3任一项所述酸敏双亲性三嵌段聚合物将siRNA浓缩复合于纳米粒子核内，由PDPA嵌段叔胺提供pH响应性，亚表层由PAsp(MEA)形成分子间二硫键实现对siRNA的保护并响应还原性胞浆内siRNA释放。
8.权利要求7所述siRNA输送体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将三嵌段聚合物PEG-PAsp(MEA)-PDPA溶解在pH值为5.0的缓冲溶液中，并在该pH值下与siRNA按特定的N/P比复合30 min，同样pH条件下，往溶液中通入氧气鼓泡30 min让亚表层的巯基充分交联成二硫键，最后将溶液的pH值调至7.4。
9.权利要求7所述肿瘤智能靶向和环境双响应性siRNA输送体系在制备肿瘤诊断药物和/或治疗药物中的应用。
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