CN103990134A - 一种能共传输药物和基因的纳米囊泡、制造方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种能共传输药物和基因的纳米囊泡、制造方法及其应用,该纳米囊泡的成分为聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸),其制备方法是先用正丁胺引发天冬氨酸苄酯-N-羧基内酸酐开环聚合得聚天冬氨酸苄酯,将末端氨基羧基化后再经二异丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解得到末端羧基化的聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸),最后通过酰胺化反应得到聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)。本发明的纳米囊泡可作为亲水性药物与基因的共输送载体,囊泡的疏水层具有酸敏响应性,同时用于囊泡疏水层捆绑交联的二硫键兼具还原敏感性,纳米囊泡外层的聚乙烯亚胺层具有质子缓冲效应,因此有智能释放基因和药物的特点。
Description
技术领域
本发明属于高分子化学和生物医学工程领域,具体是涉及一种可作为传输新型药物和基因的双载体材料的纳米囊泡和其制造方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类的生存健康,对于癌症的治疗是目前最具有挑战性的课题之一。目前临床上多采用外科手术进行治疗,但这通常适用于肿瘤还没有开始向全身扩散的情况。放疗和化疗的应用显著提高了恶性肿瘤的治疗效果。其中化疗对于各种血液恶性肿瘤、胚细胞瘤等具有相当大的治疗潜力,但是化疗药物对正常组织和器官的毒副作用是困扰肿瘤化疗的主要问题。此外,随着分子生物学的发展,尤其是人类基因库的建立和人类疾病相关基因的阐明,癌症的基因疗法也应运而生。目前多采用裸DNA注射法,即将质粒DNA或RNA直接注入靶组织的方法,但由于体内核酸酶等对DNA的降解作用,基因表达的时间很短,严重影响治疗效果。研究表明,将基因治疗与药物治疗这两种手段结合起来,可以起到相互促进、相互结合的效果。例如,目前新兴的“***”基因疗法,即将无毒的抗肿瘤前药与相应的“***”基因结合起来,待基因成功转染进入肿瘤细胞后,表达的酶可以将抗肿瘤前药转化为高毒性的化疗药物,从而实现对肿瘤细胞的选择性杀伤,避免了对正常细胞的损害。要解决目前临床上化疗及基因治疗面临的问题并实现药物与基因协同治疗,关键在于构建行之有效的药物/基因共输送载体。该载体要能够将质粒DNA安全输送到肿瘤细胞的胞浆中,避免体内核酸酶的降解;同时将化疗药物或前药安全有效地递送至肿瘤部位使其发挥作用。
肿瘤组织与正常组织存在生理性差异,如肿瘤血管内皮细胞间隙大及肿瘤部位淋巴循环受限,导致纳米粒子在肿瘤部位的增强渗透存在滞留(Enhanced
permeability and retention)效应(EPR效应)。因此,纳米药物载体可以通过EPR效应被动靶向富集于肿瘤部位。此外,纳米药物载体还具有很多传统药物载体不具备的其他优点:能形成纳米颗粒包裹、浓缩、保护基因/药物,使其免遭生物酶的降解;比表面积大,具有生物亲和性,易于在其表面进行修饰,偶联靶向分子,实现对肿瘤的主动靶向识别;在循环***中的循环时间明显延长且不易被巨噬细胞清除;能够实现药物/基因的控制释放,提高基因/药物的生物利用度;代谢产物少、副作用小,无免疫排斥反应等。因此,多功能纳米药物载体的研发,被认为是解决目前化疗和基因治疗面临问题的有效途径,也是目前癌症治疗方面的一个重要研究领域。纳米载体的理化性能,如表面修饰、粒径和形貌、化学组成、表面电位等参数是影响纳米粒子的EPR效应(被动靶向性能)和主动靶向性能的关键因素,而聚合物纳米药物载体可以实现对以上参数的有效调控因此受到研究者的亲睐。
目前,单独递送药物或基因的纳米载体方面的研究较多,而同时输送药物/基因的纳米载体还鲜见报道。药物载体目前面临的最大问题是血液循环时结构不稳定及到达肿瘤部位后释药缓慢,前者影响纳米粒子在肿瘤部位的有效富集并造成药物丢失,进而削弱抑瘤效果且增加毒副作用;后者降低了药物的生物利用度并可能诱导肿瘤细胞产生多药耐药,影响后期治疗。一方面,可以采用还原敏感的二硫键对纳米载体进行交联捆绑,这是提高纳米粒子血液稳定性的有效手段,且二硫键在肿瘤细胞溶酶体内高的谷胱甘肽浓度下会快速断裂,有助于纳米粒子在肿瘤细胞内解体;另一方面,可以采用具有刺激响应功能的聚合物构建纳米载体,赋予纳米载体在肿瘤内环境的刺激响应下快速释药。目前,研究者多采用阳离子聚合物传输基因,阳离子聚合物链通过静电作用与基因的磷酸盐骨架复合后形成纳米粒子,然而这样形成的纳米粒子的粒径难以控制,粒径分散宽,且容易聚集沉淀,不利于体内应用。而将聚合物组装成纳米胶束或囊泡后再进行基因的负载就可以有效地解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在问题和不足,提供一种可作为传输药物和基因的双载体材料,能实现基因的有效转染及瘤内暴释药物,且二硫键交联捆绑稳定的酸敏响应型的纳米囊泡及其制造方法。
在上述基础上,本发明进一步的目的是提供一种纳米囊泡作为药物和基因双载体材料中的应用。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明所述的能共传输药物和基因的纳米囊泡,其特点是该纳米囊泡为由表层的聚乙烯亚胺和中间层的聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)构成且中间层带有可交联巯基的聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡,该纳米囊泡的中间层为疏水层,该疏水层具有酸敏响应性,能发生pH值敏感的亲-疏水性的转换;同时,用于中间层交联捆绑的巯基(二硫键)具有还原敏感性;此外,该纳米囊泡外层的聚乙烯亚胺层具有质子缓冲效应,能用于基因的传输,实现基因的溶酶体逃逸。
其中,上述聚乙烯亚胺为支化型,其数均分子量为600 Da,上述聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)的数均分子量为1~10 KDa。
本发明所述的能共传输药物和基因的纳米囊泡的制造方法,其特点是包括如下步骤:
A、用正丁胺为引发剂,引发β-天门冬氨酸苄酯N-羧酸酐聚合反应,反应结束后,将反应液沉淀、抽滤和洗涤后,真空干燥得到聚合物聚天冬氨酸苄酯;
B、采用马来酸酐对聚天冬氨酸苄酯末端的氨基进行羧基化反应,并将反应得到的产物冷冻干燥后,得到白色粉末状的羧基化聚天冬氨酸苄酯;
C、将羧基化聚天冬氨酸苄酯经二异丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解反应后,将反应物透析、旋干,得到羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸);
D、在催化剂的催化下,将羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)进行酰胺化反应,并将反应液透析、浓缩和抽干后,得到聚合物聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸);
E、将聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)溶于有机溶剂中,并在超声作用下将溶液滴至pH值为9的缓冲溶液中,通氧气2 h后,在pH值为7.4的缓冲溶液中透析三天,得到含有聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡的溶液。其中,上述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC∙HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
其中,上述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或二甲基酰胺(DMF)或甲醇。
本发明所述的纳米囊泡在传输药物和基因中的应用,其特点是应用方法如下:
首先将聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡作为载体与亲水性抗肿瘤前药按一定的比例混合共同形成为原料,然后将原料溶于有机溶剂中配制成溶液,在超声作用下将制得的溶液滴加至pH值为9的缓冲溶液中,通氧气,再经过透析除去未包裹的药物及有机溶剂,最后将溶液的pH值调至7.4,即得到载药纳米囊泡;将载药纳米囊泡与质粒DNA按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的一定摩尔比(即N/P比)混合均匀后振荡15 秒,于室温静置后得到载药-基因纳米囊泡。
其中,上述聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡可用于癌症***基因疗法如5-氟胞嘧啶(5-FC)和胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的输送。在自组装过程中,PAsp(DIP/MEA)段自发地形成囊泡的疏水中间层,在通氧条件下囊泡被二硫键交联捆绑稳定,CD基因被压缩包裹于囊泡外表面的PEI层,囊泡亲水腔内含有抗肿瘤前药(5-氟胞嘧啶,可简写为5-FC)。
上述聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡与亲水性抗肿瘤前药的重量份数比为(10~1000):1,优选的重量份数比为(10~20):1。
上述载药纳米囊泡与质粒DNA按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的摩尔比为(0.1~40):1,优选的摩尔比为(4~10):1。
上述有机溶剂为DMSO或二甲基酰胺(DMF)或甲醇,其体积为原料重量的5~1000倍。
上述缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)该纳米囊泡由聚天冬氨酸类化合物制成,因此具有良好的生物相容性;
(2)该纳米囊泡的疏水层由可逆的二硫键交联捆绑,使得该囊泡在复杂的血液环境中具有良好的稳定性;交联的巯基(二硫键)能通过还原剂谷胱甘肽(GSH)打开,即该纳米胶束具有还原敏感响应性,且组成囊泡的聚天冬氨酸二异丙基乙二胺段具有酸敏响应性,因此可以实现肿瘤细胞溶酶体内的刺激响应释药;
(3)该囊泡表面的PEI层的质子缓冲效应有利于所负载的基因内吞进入细胞后进行溶酶体逃逸,避免了酶对基因的降解作用;
(4)该载药/基因纳米囊泡的平均粒径为113 nm,可以实现肿瘤部位的被动靶向聚集;
(5)表面电位为弱的正电性,有利于细胞内吞。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中空白纳米囊泡的透射电镜图。
图2为本发明实施例1中空白纳米囊泡的粒径分布图。
图3为本发明实施例1中pH 7.4加GSH打开二硫键后纳米囊泡解体后的透射电镜图。
图4为本发明实施例1中pH 7.4加GSH打开二硫键后纳米囊泡解体后的粒径分布图。
图5为本发明实施例2中载药/基因纳米囊泡的透射电镜图(N/P=10)。
图6为本发明实施例2中载药/基因纳米囊泡的粒径分布图(N/P=10)。
图7为本发明实施例4中载基因纳米囊泡的Zeta电位及粒径随N/P比的变化图。
图8为本发明实施例4中载基因纳米囊泡的凝胶阻滞电泳图。
图9为本发明实施例5中纳米囊泡的拉曼光谱图。
图10为本发明实施例6中载药/基因纳米囊泡的药物体外释放曲线。
图11为本发明实施例7中载药/基因纳米囊泡转染后的倒置荧光显微镜图。
图12为本发明实施例7中载药/基因纳米囊泡基因转染率的流式细胞仪检测图。
图13为本发明实施例8中基因表达随载基因纳米囊泡浓度的变化图。
图14为本发明实施例8中载基因纳米囊泡及载药/基因纳米囊泡的基因表达水平图。
图15为本发明实施例9中空纳米囊泡、单独载药或基因的纳米囊泡的细胞毒性图。
图16为本发明实施例9中载药/基因纳米囊泡的细胞毒性图。
其中,BLA-NCA为β-天门冬氨酸苄酯N-羧酸酐、PBLA为聚天冬氨酸苄酯、PBLA-COOH为羧基化聚天冬氨酸苄酯、PAsp(DIP/MEA)-COOH为羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)、PEI-PAsp(DIP/MEA)为聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)、PPDM/pCMVCD为负载pCMVCD的PEI-PAsp(DIP/MEA)纳米囊泡、PPDM/pEGFP为负载pEGFP的PEI-PAsp(DIP/MEA)纳米囊泡、PPDM/5-FC为负载5-FC的纳米囊泡。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案,实施例中除特殊说明外均为本领域常规步骤。
本发明基于两亲性共聚物PEI-PAsp(DIP/MEA)的纳米囊泡被用于抗肿瘤前药/“***”基因 —
5-FC/pCMVCD的共传输,所得纳米囊泡的大小、形状等基本性能分别采用动态光散射、透射电子显微镜等来测定,其对抗肿瘤前药5-FC的包负能力及pCMVCD基因的复合性能则分别采用紫外可见分光光度计和凝胶阻滞电泳进行测定,并通过倒置荧光显微镜及流式细胞技术仪测定C6脑胶质瘤细胞中纳米囊泡对pCMVCD基因的转染性能,通过荧光定量PCR测定pCMVCD基因转染后在mRNA水平上的表达情况,最后空纳米囊泡的细胞毒性及载药/基因的纳米囊泡对肿瘤细胞的杀伤效果均采用经典的四唑盐(MTT)法进行分析。
以下实施例中,如无特殊说明,均为本领域常规实验试剂和操作步骤。实施例中缓冲溶液以pH值表示,如pH 5.0的缓冲液是指磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,pH 7.4的缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS),pH 9的缓冲液指碳酸盐缓冲液。其中,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 5.0)配制方法为: 将浓度为0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液103 mL和浓度为0.1 mol/L柠檬酸溶液97 mL混合,即得。磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的配制方法为:称取氯化钠80 g,氯化钾2 g,十二水合磷酸氢二钠23.13 g,磷酸二氢钾2 g于1000 mL的容量瓶中,用蒸馏水定容至1000 mL,摇均,将所得溶液稀释10倍后使用。碳酸盐缓冲液(pH 9)配制方法为:称取无水碳酸钠10.6 g及碳酸氢钠75.6 g溶于蒸馏水中稀释至1000 mL。
实施例 1 PEI-PAsp(DIP/MEA)纳米囊泡的制备
1. 聚合物PBLA的制备:
该聚合物以正丁胺为引发剂,通过BLA-NCA的开环聚合反应得到。取2.49 g BLA-NCA(0.01 mol)加至100 mL反应瓶中,加入6 mL DMF进行溶解,然后再加入60 mL 无水CH2Cl2,充分摇匀。之后加入20 μL正丁胺(0.0002 mol),充分摇匀后密封,于35 ºC搅拌反应72 h。反应结束后,将反应液滴入过量的冷***(如500 mL)中沉淀,经抽滤和无水***的反复洗涤,真空干燥得到最终产物;
2. 聚合物PBLA-COOH的制备:
称取2.06 g Ba-PBLA(0.2
mmol)加于100 mL三口瓶中,于80 ºC真空干燥5 h,加入20 mL新蒸的氯仿(CHCl3),待其溶解后再加入0.2 g丁二酸酐(2 mmol, ~10 eq.),70 ºC搅拌回流反应48 h。反应完毕后,往反应瓶加入20 mL高纯水,再继续40 ºC搅拌回流反应0.5 h,然后旋转蒸发除去氯仿,把水倒掉,再重复一次。这样,利用热水法将未反应的丁二酸酐水解成丁二酸而溶于水,聚合物不溶于水,达到去除丁二酸酐的目的。产品冷冻干燥后得到白色粉末状固体;
3. 聚合物PAsp(DIP/MEA)-COOH的制备:
称取1.56 g PBLA-COOH(0.15 mmol)于10 mL反应管,加入5 mL DMSO进行溶解。加入1.04 mL N,N-二异丙基乙二胺(6 mmol, ~40 eq),充分摇匀,密封后置于40 ºC油浴搅拌加热12 h。然后再加入半胱胺盐酸盐0.51 g(4.5 mmol, ~30 eq.)和0.65 mL三乙胺(4.5 mmol, ~30 eq.)。于35 ºC下充分搅拌反应12 h。反应完毕,将反应物在甲醇中透析、旋干,得到终产物;
4. 聚合物PEI-PAsp(DIP/MEA)的制备:
称取1.31 g PAsp(DIP/MEA)-COOH(0.12
mmol)于10 mL反应瓶中,加入4 mL DMSO和4 mL CHCl3进行溶解,然后加入0.034
g EDC∙HCl(0.18 mmol, ~1.5 eq)和0.021 g NHS(0.18 mmol, ~1.5 eq),充分摇均溶解,反应30 min后加入0.079
g PEI(0.13 mmol, ~1.1 eq),摇均。密封反应瓶,室温反应48 h。然后将反应液装在1000 Da在无水甲醇中透析。透析完毕,经浓缩、抽干得到最终产物;
5. PEI-PAsp(DIP/MEA)纳米囊泡的制备
将10 mg聚合物PEI-PAsp(DIP/MEA) (11525 g/mol)溶于1mL
DMSO中,在超声下滴至10 mL PBS (pH
9)中,将该溶液通氧气2 h后,在PBS
(pH 7.4)中透析三天,得到PEI-PAsp(DIP/MEA)纳米囊泡溶液。
所得PEI-PAsp(DIP/MEA)纳米囊泡的形态通过透射电子显微镜来观察,粒径大小则采用动态光散射***进行测量,测试结果分别见图1和图2。从透射电子显微镜图片可以明显地看出嵌段聚合物在水溶液中自组装成“空心球”;从动态光散射图可以看出,空白纳米囊泡的粒径为60~130 nm, 平均粒径为93 nm。
如果将胶束PBS(pH 7.4)溶液的pH值用HCl溶液调至5.0后,再加入10 mM的谷胱甘肽(GSH),囊泡会发生解体,其形态则通过透射电子显微镜来观察,结果见图3。囊泡的解体从动态光散射图中也可印证(如图4所示),粒径变为7 nm左右的聚集体。
实施例
2
载药物
-
基因纳米囊泡的制备
将1 mg 5-FC 和10 mg
PEI-PAsp(DIP/MEA)溶于1 mL DMSO中,冰浴超声作用下滴入10 mL pH 7.4的盐酸缓冲溶液中,通氧交联两个小时后,将所制得的囊泡溶液在pH
7.4的水中透析三天除去DMSO,采用450
nm的滤膜过滤除去其中大的聚集体,采用截留分子量10 KDa的超滤管超滤除去残留的少量5-FC,得到载5-FC的纳米囊泡;
按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的摩尔比(即N/P比)为10:1,将CD基因与负载5-FC的PEI-PAsp(DIP/MEA)囊泡溶液混合均匀后振荡15 S后于室温静置30 min,从而得到同时负载5-FC和CD的纳米囊泡。
所得载药物-基因纳米囊泡的形貌通过透射电子显微镜观察,结果见图5。纳米囊泡负载药物和基因后对形貌几乎没有影响,仍呈结构规整的圆球状。载药物/基因纳米囊泡的粒径大小采用动态光散射***进行测量,结果见图6。从动态光散射图可以看出,载药物/基因纳米囊泡的平均粒径为113 nm,比空囊泡略大。
实施例
3
纳米囊泡的载药率和包封率的测定
通过测量一系列已知浓度的5-FC溶液的紫外光谱图计算出吸光度对浓度的标准曲线(Y=0.000149+0.04347X, R=0.99994),将冻干的负载样品溶解在pH值为5的PBS缓冲液中,采用紫外可见分光光度计测定该样品溶液在275nm处的吸光度。将吸光度值代入标准曲线方程计算得到5-FC浓度,由此得出样品中5-FC的含量,根据冻干样品容器和冻干后样品的总质量得到干品质量,从而算出载药率与包封率,计算公式如下:
载药量=囊泡中5-FC的含量/囊泡的质量×100%
包封率=囊泡中5-FC的含量/5-FC的投料量×100%
按照实例2的方法制备交联载药纳米胶束,测得载药纳米胶束的载药量为4.14%,包封率为41.4%。
实施例
4
纳米囊泡的基因负载行为测定
采用动态光散射及Zeta电位仪对按照实例2的方法制备的载CD基因纳米囊泡的粒径及表面电位进行表征,见图7。随着N/P比逐渐增大,当N/P比从1/10逐渐增大到2时,复合物的粒径迅速减小,从386 nm变为133
nm,当N/P≥2时,随着N/P的增高,复合物的粒径逐渐变小最终趋向于与空囊泡的粒径一致;另一方面,当N/P比逐渐增大,Zeta电位由负值变为正值后,呈现逐渐增大趋势,并趋向于与空囊泡的表面电位一致,结合粒径和电位的变化规律得出结论,复合物在N/P比为2时载体和pDNA基本完全复合。一方面,表面带正电的纳米粒子能与细胞表面带负电的蛋白聚糖通过静电作用相互结合而易于被细胞内吞,然而较高的表面电位也会增加细胞毒性,另一方面,粒径在100
nm~200 nm的粒子易被细胞内吞,因此选择N/P比10的PPDM/pCMVCD进行下述的细胞实验,N/P比为10时复合物的粒径为113 nm左右,且表面带弱的正电(8.47 mV)。
凝胶阻滞实验用来进一步验证纳米囊泡负载CD基因的能力(图8)。裸DNA在电泳中跑出一前一后两条条带,跑在前边的亮度高的条带代表活性高的超螺旋SC构型,跑在后边的亮度很弱的条带代表无活性或低活性的松弛开环构型OC构型。当N/P=4时,载基因囊泡和载药物/基因的囊泡在凝胶电泳中均已看不到条带,表明此条件下CD基因已经完全被聚合物复合。而且载基因囊泡和载药物/基因的囊泡这两者完全复合的N/P比基本相同也表明负载5-FC后对囊泡负载基因的能力没有影响。
实施例
5
纳米囊泡的交联度测定
采用拉曼光谱对囊泡中的二硫键进行定性表征,图9为氧化交联后的聚合物囊泡的拉曼光谱,图中可以清楚的看到位于510 cm-1处的二硫键的峰。
采用Ellman’s 试剂对囊泡中的二硫键进行定量测定,测量巯基含量的具体操作方法如下:氮气保护下配制浓度分别为0、2.5、5、10、20 μg/mL L-半胱氨酸的PBS(pH 7.4)溶液,向上述各溶液中加入0.6 mL(0.5 mg/mL)的 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB,即Ellman’s 试剂)后室温反应15 min,采用紫外分光光度计测量生成物5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)在412 nm波长处的吸光度,并对应不同L-半胱胺酸的浓度建立标准曲线(Y=0.079X-0.0117, R=0.999,Y-吸光度,X-TNB浓度)。之后,我们对待测囊泡的巯基含量进行测量,测得待测样品与DTNB反应后的紫外吸收度为0.2574,通过已知的标准曲线计算得到样品中L-半胱氨酸的含量为3.4 μg/mL (0.0281 μmol/mL),即样品中巯基的含量为0.0281 μmol/mL,理论上每个高聚物链上含有8个巯基,样品中含有0.1465 μmol/mL巯基,经计算得到聚合物囊泡中的巯基有80.82%交联形成二硫键。
实施例
6
载药物
/
基因纳米囊泡的药物体外释放
采用透析的方法研究载药物/基因纳米囊泡中5-FC的体外释放。取实施例2制备的载5-FC/pCMVCD的纳米囊泡(1mg/mL) 3 mL转移至透析袋(截留分子量:14000 Da)中,分别装入含30 mL PBS(pH7.4)缓冲溶液或含30 mL GSH(10 mM)的醋酸盐缓冲溶液(pH 5.0)广口瓶中。37 ℃恒温水浴摇床摇动,并间隔一定时间采集透析袋外面的2 mL溶液并补充相同体积的缓冲液,275 nm波长处测定5-FC的紫外吸收度,根据5-FC标准曲线计算囊泡中5-FC的含量。在分析5-FC释放行为中,以时间对5-FC累积释放量作图进行分析研究。其中,所得结果为三组平行测试实验的平均值,实验结果见图10。
选用PBS(pH 7.4)缓冲溶液和含有10 mM谷胱甘肽的醋酸盐缓冲溶液(pH 5.0)进行实验是为了模拟载体在血液循环过程中的生理环境和载体经肿瘤细胞内化后溶酶体的酸性还原性环境。在pH值为7.4缓冲溶液中,5-FC的释放非常缓慢,24小时的累计释放量仅为8.6 wt %,说明在pH值为7.4时实施例2制备的纳米囊泡是稳定的致密的载药体系。在含有10 mM谷胱甘肽的醋酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中,5-FC显示出暴释行为,3小时的累积释放量已达到70 wt %,24小时的累计释放量达到98.34 wt %,这是由于纳米囊泡在此条件下发生解体,所以药物快速释放。该实施例说明,交联纳米囊泡在血液循环过程中能保持结构稳定,避免了药物在输送过程中泄漏,而纳米囊泡到达肿瘤细胞中的酸性溶酶体后发生解体,快速的释放药物,进而提高了药物利用率及治疗效果。
实施例
7
载药
/
基因纳米囊泡的基因转染
首先进行基因转染实验,选取生长良好的C6细胞和293T细胞细胞种植于24孔培养板中(1×104 个细胞/孔),待细胞密度达到70~80%时可进行载体对CD基因(pCMVCD)的转染实验,另转pEGFP作对比。吸出培养基并用PBS将细胞表面清洗干净,将适量PBS稀释的PPDM/pCMVCD(载pCMVCD的纳米囊泡)及PPDM/EGFP(载EGFP的纳米囊泡)(含2 μg pDNA)后加入到培养孔中,于37 ºC、5%CO2 培养箱中孵育4h。吸出培养基并用PBS将细胞表面清洗干净后,每孔加入400 μL新鲜培养基继续培养48h。用倒置荧光显微镜观察基因在细胞内的表达情况,转染率采用流式细胞仪测定通过倒置荧光显微镜可以直接观察到细胞所表达的增强型绿色荧光蛋白的荧光强度(图11),说明聚合物载体负载pDNA 的转染效果良好;通过流式细胞仪定量检测基因的转染效率,如图12。在293T细胞中,PPDM/pEGFP组的转染率高达85.7%,PPDM/pCMVCD组的转染率也达到了73.5%。在C6细胞中,PPDM/pEGFP组的转染率达到了45.9%,PPDM/pCMVCD组的转染率也达到了34.7%。该实验结果说明纳米囊泡可以有效的转染基因。
实施例
8
载药
/
基因纳米囊泡转染后基因表达量的
RT-PCR
检测
按照实施例7,待基因转染完成后进行RNA抽提:(a)倒去培养基后用PBS冲洗几遍,每孔中加入1 mL TRIzol混匀后静置10 min。(b)转入离心管中,每管加200 μL氯仿剧烈震荡后静置5 min,离心15 min(4 ºC, 12000 r/min),样品出现分层,其中最上层含RNA样品。(c)将含RNA层移至另一离心管中,并加入600 μL异丙醇混匀后静置10 min,离心15 min(4 ºC, 12000 r/min)。(d)弃去上清后离心管中的沉淀用500 μL 75 %乙醇洗涤后离心收集。(e)待乙醇挥发干,加入35 μL超纯水于-80 ºC保存。RNA反转录,将反转录的样品-80 ºC保存。取2 μL RNA反转录产物作为模板,目的基因pCMVCD及内参GAPDH上下游引物各0.04 μL,按照试剂盒说明书操作。95 ºC变性5 min,95 ºC/15 S,60 ºC/15 S,60 ºC/15 S,共40个循环。
Real-time
PCR被用来检测在mRNA水平CD基因表达的效果。N/P比10的情况下,用不同浓度的PPDM/pCMVCD处理C6脑胶质瘤细胞,结果图13所示,随着CD基因浓度的增加,CD基因表达量有增加趋势。2.6 μg/mL的CD基因表达效果显著好于0.6 μg/mL,而且与2.6μg/mL CD基因相比,更高剂量的CD基因的表达能力并没有显著提高。此外, PPDM(空囊泡)和PPDM/5-FC(载药囊泡)复合CD基因后处理的细胞CD基因在mRNA水平上都有明显表达(6.6045 VS 0.0004, 6.4011 VS 0.0004),见图14。
实施例
9
载药
/
基因纳米囊泡的肿瘤细胞毒性分析
实验对象为实施例2制备的载药/基因纳米囊泡,并以空囊泡及单独载药或基因的纳米囊泡做对比。细胞增长的抑制率即细胞毒性通过经典的MTT进行分析。脑胶质瘤细胞C6细胞在每孔0.3×104数量级的96孔板中进行种植培养。在对数级增长阶段进行收割,并最终用含有10% FBS的RPMI-1640培养基调整成170 μL。24 h之后,在每孔板中加入设定浓度的空囊泡、载药纳米囊泡、载基因纳米囊泡、载药/基因纳米囊泡。在经过72 h培养后,在每孔板中加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT盐溶液(0.9%氯化钠)继续在37 ºC培养箱中培养4 h以允许活性细胞经过还原反应把黄色MTT转化为深兰色甲瓒晶体,然后这种晶体溶解于100 μLDMSO中,通过酶标仪在540 nm及655 nm对每个板孔进行检测。
各实验组的细胞毒性分析见图15、16。由图15可见,空囊泡及单独载药或基因的纳米囊泡毒性均很低。囊泡未负载5-FC和CD基因时,当空囊泡浓度为40 µg/mL时,细胞活性90%以上。当浓度增大为100 µg/mL,细胞活性依然高于80%。所以说明:单独载药或基因的纳米囊泡的毒性相比与空囊泡变化不大。
5-FC在CD基因表达的胞嘧啶脱氨酶的作用下转化为化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)才能杀死肿瘤细胞。实施例2中的纳米囊泡联合传输CD基因和5-FC作用于C6细胞所产生的细胞毒性见图16。从图中可以看出,阴性对照组(pEGFP)组随着5-FC浓度的增加,细胞毒性基本不变。即便5-FC浓度达到120 µg/mL,细胞活性依然高于80%。而载药/基因纳米囊泡,随着5-FC浓度的增加,细胞毒性急剧增加。5-FC浓度达60 µg/mL,细胞活性已为35.98%。说明联合治疗组(PPDM/5-FC/pCMVCD)实现了5-FC和pCMVCD的协同治疗,明显抑制肿瘤细胞的活性。
本发明是通过实施例来描述的,但并不对本发明构成限制,参照本发明的描述,所公开的实施例的其他变化,如对于本领域的专业人士是容易想到的,这样的变化应该属于本发明权利要求限定的范围之内。
Claims (10)
1.一种能共传输药物和基因的纳米囊泡,其特征在于该纳米囊泡为由表层的聚乙烯亚胺和中间层的聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)构成且中间层带有可交联巯基的聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡。
2.根据权利要求1所述能共传输药物和基因的纳米囊泡,其特征在于上述聚乙烯亚胺为支化型,其数均分子量为600
Da,上述聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)的数均分子量为1~10 KDa。
3.一种能共传输药物和基因的纳米囊泡的制造方法,该方法用于制造如前述任一权利要求所述的纳米囊泡,其特征在于包括如下步骤:
A、用正丁胺为引发剂,引发β-天门冬氨酸苄酯N-羧酸酐聚合反应,反应结束后,将反应液沉淀、抽滤和洗涤后,真空干燥得到聚合物聚天冬氨酸苄酯;
B、采用马来酸酐对聚天冬氨酸苄酯末端的氨基进行羧基化反应,并将反应得到的产物冷冻干燥后,得到白色粉末状的羧基化聚天冬氨酸苄酯;
C、将羧基化聚天冬氨酸苄酯经二异丙基乙二胺和半胱胺酸混合氨解反应后,将反应物透析、旋干,得到羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸);
D、在催化剂的催化下,将羧基化聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)与聚乙烯亚胺进行酰胺化反应,并将反应液透析、浓缩和抽干后,得到聚合物聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸);
E、将聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)溶于有机溶剂中,并在超声作用下将溶液滴至pH值为9的缓冲溶液中,通氧气2 h后,在pH值为7.4的缓冲溶液中透析三天,得到含有聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡的溶液。
4.根据权利要求1或2所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于应用方法如下:
首先将聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡作为载体与亲水性抗肿瘤前药按一定的比例混合共同形成为原料,然后将原料溶于有机溶剂中配制成溶液,在超声作用下将制得的溶液滴加至pH值为9的缓冲溶液中,然后通氧气,再经过透析除去未包裹的药物及有机溶剂,最后将溶液的pH值调至7.4,即得到载药纳米囊泡;将载药纳米囊泡与质粒DNA按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的一定摩尔比混合均匀后振荡15 秒,于室温静置后得到载药/基因纳米囊泡。
5.根据权利要求4所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于上述聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡与亲水性抗肿瘤前药的重量份数比为(10~1000):1。
6.根据权利要求5所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于上述聚乙烯亚胺-b-聚天冬氨酸(二异丙基乙二胺/半胱胺酸)纳米囊泡与亲水性抗肿瘤前药的重量份数比为(10~20):1。
7.根据权利要求4所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于上述载药纳米囊泡与质粒DNA按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的摩尔比为(0.1~40):1。
8.根据权利要求7所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于上述载药纳米囊泡与质粒DNA按照聚合物中氨基与质粒DNA中磷酸根的摩尔比为(4~10):1。
9.根据权利要求4所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于上述有机溶剂体积为原料重量的5~1000倍。
10.根据权利要求4所述纳米囊泡于传输药物和基因方面的应用,其特征在于上述缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
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