CN115885987B - 一种靶向纳米载体及其制备方法和应用、靶向载药纳米载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向纳米载体及其制备方法和应用、靶向载药纳米载体及其制备方法,属于功能材料技术领域。本发明提供的靶向纳米载体包括纳米载体以及化学键合在所述纳米载体上的靶向物,其中,所述纳米载体为有机高分子聚合物或无机材料形成的纳米粒子,所述靶向物为天冬氨酸或天冬氨酸衍生物。本发明提供的靶向纳米载体能够主动穿透植物细胞壁和细胞膜,适用于对活体植物或组织等进行药物递送,能够降低用药剂量和成本、对搭载药物具有保护作用并提高药物效率、延长药物作用时间,降低毒性和污染性,降低耐药概率。
Description
技术领域
本发明涉及功能材料技术领域,尤其涉及一种靶向纳米载体及其制备方法和应用、靶向载药纳米载体及其制备方法。
背景技术
科学家们利用植物生物技术进行高产和抗逆作物筛选,改良药物生物合成以及发展可持续农业等。然而,即使经过数十年的发展,生物技术在植物科学乃至农业生产上的应用仍然面临各种各样的问题与挑战。植物细胞具有细胞壁,构成了外源生物大分子等药物递送的主要屏障。在植物遗传转化进行分子育种优化过程中,传统的基因枪具有造成目标组织损伤且基因表达水平低等不足,而农杆菌转化法最大的挑战是狭窄的宿主选择性和组织特异性。同时,这些方法所需的愈伤组织生成也限制了可应用的植物物种。而在传统的物理和化学农药及肥料应用方面,极低的利用率造成的过量施用及高残留则对生产安全和环境造成了巨大的压力。
纳米递送载体在生物医药领域被广泛应用,对人类健康有重要贡献,纳米递送能极大的减少药物用量,仅在需要的组织靶向聚集,能够降低用药成本、提高药物效率、延长药物作用时间、降低毒性和污染性,而且能够降低耐药概率。然而,当前用于植物的纳米递送载体极少,这是因为在植物体系中,细胞壁的存在形成了天然的屏障,使得几乎所有纳米载体都无法有效的穿透细胞壁进而在活体组织和细胞中进行递送,仅有的几例关于植物纳米递送载体的研究也需要外力辅助(如叶片注射、磁力等)实现其跨越细胞壁进入活体植物组织的目的。而针对植物生物技术尤其是农业生产中的应用往往需要庞大的样本量,即便在实验室中的操作应用也需要数百个样本,因而任何需要外力辅助的方法都较为繁琐并且效率低下。因此,开发能够主动穿透植物细胞壁并且进一步穿透细胞膜的纳米递送载体,同时不需要借助外力并且不引起组织损伤,能够轻易的施用于大量植物,用于对植物递送药物,是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向纳米载体及其制备方法和应用、靶向载药纳米载体及其制备方法,本发明提供的靶向纳米载体能够主动穿透植物细胞壁和细胞膜,适用于对植物递送药物。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种靶向纳米载体,包括纳米载体以及化学键合在所述纳米载体上的靶向物,其中,所述纳米载体为有机高分子聚合物或无机材料形成的纳米粒子,所述靶向物为天冬氨酸或天冬氨酸衍生物。
优选地,所述天冬氨酸提供的靶向基团包括式I~IV任一所示结构的基团:
优选地,所述纳米载体的粒径为10~1000nm。
优选地,所述有机高分子聚合物的数均分子量为3~50kDa。
优选地,所述有机高分子聚合物包括疏水性聚合物以及与所述疏水性聚合物共价连接的亲水性连接物,所述亲水性连接物与所述靶向物经化学键合连接。
本发明提供了上述技术方案所述靶向纳米载体的制备方法,包括以下步骤:
在溶剂存在条件下,在纳米载体上经化学键合修饰靶向物,得到靶向纳米载体。
本发明提供了上述技术方案所述靶向纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的靶向纳米载体作为活体植物植株、活体植物植株的组织、活体植物植株的器官、活体植物植株的细胞、体外培养的外植体、体外培养的愈伤组织、体外培养的植物组织或体外培养的植物细胞的主动靶向纳米载体的应用。
本发明提供了上述技术方案所述靶向纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的靶向纳米载体作为活体植物主动靶向纳米递送载体的应用。
本发明提供了一种靶向载药纳米载体,包括靶向纳米载体以及包载在所述靶向纳米载体中的药物,所述靶向纳米载体为上述技术方案所述靶向纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的靶向纳米载体。
优选地,所述药物包括小分子药物或生物大分子,所述靶向载药纳米载体的载药率为1~99%。
本发明提供了上述技术方案所述靶向载药纳米载体的制备方法,包括以下步骤:
将靶向纳米载体、药物与溶剂混合,进行包载处理,得到靶向载药纳米载体。
本发明提供了一种靶向纳米载体,包括纳米载体以及化学键合在所述纳米载体上的靶向物,其中,所述纳米载体为有机高分子聚合物或无机材料形成的纳米粒子,所述靶向物为天冬氨酸或天冬氨酸衍生物。本发明提供的靶向纳米载体能够主动穿透植物细胞壁和细胞膜,适用于对活体植物或组织等进行药物递送,能够降低用药剂量和成本、对搭载药物具有保护作用并提高药物效率、延长药物作用时间,降低毒性和污染性,降低耐药概率。
附图说明
图1为本发明制备Asp-NP的流程图以及以搭载ABA为例所得靶向载药纳米载体作为抗旱剂的应用示意图;
图2为实施例1制备的靶向基团为L-Asp的Asp-PEG-PDPA的核磁共振图;
图3为实施例1中L-Asp-NP的透射电镜图;
图4为搭载ABA后所得Asp-NP@ABA(具体为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA和L-Asp-NP@ABA)和不具有靶向作为对照的NP@ABA的粒径和载药率对比图;
图5为应用例1中采用不同处理喷洒拟南芥叶片36h后,使用激光共聚焦显微镜在20μm的深度时追踪DiO的观察结果图;
图6为应用例1中采用不同处理喷洒拟南芥叶片36h后,使用激光共聚焦显微镜追踪DiO被纳米粒子带入穿透叶片组织的深度统计图;
图7为应用例1中采用不同处理与分离的拟南芥叶肉细胞原生质体混合共培养4h,更换新鲜MS(Murashige and Skoog)培养基培养20h后,使用激光共聚焦显微镜追踪DiO信号被纳米粒子带入原生质体的对比图;
图8为应用例1中采用不同处理喷洒鸭跖草叶片6h后,使用激光共聚焦显微镜在不同深度追踪FITC的观察结果图;
图9为采用不同处理后拟南芥种子发芽率对比图;
图10为Asp-NP-FITC在不同时间点穿透拟南芥根部组织不同深度的对比图;
图11为Asp-NP-FITC在4h和6h后穿透大豆根部组织不同深度的对比图;
图12为Asp-NP-FITC在4h和6h后穿透玉米根部组织不同深度的对比图;
图13为在水培***中采用不同处理拟南芥小苗根吸收靶向纳米载体对叶片衰老黄化诱导的对比图;
图14为应用例3中采用不同处理喷洒拟南芥小苗后在干旱条件下延长小苗生存周期的对比图;
图15为应用例3中采用不同处理喷洒拟南芥小苗后的生存率对比图;
图16为应用例3中采用不同处理喷洒拟南芥小苗后在干旱条件下延长小苗的生存周期相对于MS处理组延长的生存周期统计的百分比散点图;
图17为应用例3中以干旱条件下的生存周期为衡量标准测定的Asp-NP@ABA最低有效浓度结果图(以ABA处理的结果作为参照);
图18为应用例3中采用不同处理喷洒拟南芥叶片24h后细胞质内和质外体内的ABA含量对比图;
图19为应用例4中采用不同处理喷洒大豆小苗后在干旱条件下延长小苗生存周期的对比图;
图20为应用例4中采用不同处理喷洒大豆小苗后在干旱条件下延长小苗生存周期的中位生存值的统计图;
图21为应用例4中采用不同处理喷洒玉米小苗后在干旱条件下延长小苗生存周期的对比图;
图22为应用例5中添加不同比例非靶向的聚合物(即MeO-PEG-PDPA)的载药产物对于拟南芥种子发芽率的影响对比图;
图23为应用例5中添加不同比例非靶向的聚合物(即MeO-PEG-PDPA)的载药产物对于拟南芥在干旱条件下的生存周期延长的影响对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向纳米载体,包括纳米载体以及化学键合在所述纳米载体上的靶向物,其中,所述纳米载体为有机高分子聚合物或无机材料形成的纳米粒子,所述靶向物为天冬氨酸或天冬氨酸衍生物。
本发明提供的靶向纳米载体包括纳米载体,所述纳米载体为有机高分子聚合物或无机材料形成的纳米粒子。在本发明中,所述纳米载体的粒径优选为10~1000nm,更优选为20~200nm。
在本发明中,所述有机高分子聚合物的数均分子量优选为3~50kDa,更优选为5~20kDa。在本发明中,所述有机高分子聚合物优选包括疏水性聚合物以及与所述疏水性聚合物共价连接的亲水性连接物,所述亲水性连接物与所述靶向物化学键合链接。
在本发明中,所述疏水性聚合物优选包括以下(1)、(2)和(3)中涉及的物质中的任一种;
(1)聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、PLGA衍生物、聚乳酸(PLA)、PLA衍生物、聚己内酯(PCL)、PCL衍生物、聚碳酸酯(PMC)、PMC衍生物;
(2)乙交酯、丙交酯、己内酯和碳酸酯中的一种或几种;乙交酯、丙交酯、己内酯和碳酸酯中至少两种形成的共聚物;
(3)聚氨酯(PU)、PU衍生物、聚醚醚酮(PEEK)、PEEK衍生物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PMMA衍生物、聚乙烯醇(PVA)、PVA衍生物、聚乙烯(PE)、PE衍生物、疏水聚氨基酸、疏水聚氨基酸衍生物;所述疏水聚氨基酸优选为聚苯丙氨酸。
在本发明中,所述亲水性连接物优选包括以下(a)和(b)中涉及的物质中的任一种:
(a)聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(POEG)、聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰(PMPC)、聚羧酸甜菜碱(PCB)、葡聚糖、葡聚糖、透明质酸、壳聚糖、β-环糊精、超支化聚缩水甘油醚(HPG)、聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(PHPMA)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸(PAA)、聚马来酸酐(HPMA)、聚季胺盐;
(b)聚乙烯亚胺(PEI)、PEI衍生物、PEI药学上可接受的盐、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)、PDMAEMA衍生物、PDMAEMA药学上可接受的盐、聚赖氨酸(PLL)、PLL衍生物、PLL药学上可接受的盐、亲水聚氨基酸、亲水聚氨基酸衍生物、亲水聚氨基酸药学上可接受的盐;所述亲水聚氨基酸优选为聚谷氨酸(PGu)或聚天冬氨酸(PAsp)。
在本发明中,当所述纳米载体为有机高分子聚合物形成的纳米粒子时,所述纳米载体的形貌具体可以为胶束或囊泡,本发明对此没有特殊限定。
在本发明中,所述无机材料优选包括硅、硅氧化物、铁、铁氧化物、钙、钙氧化物或碳纳米材料。在本发明中,具体的,所述无机材料表面含有活性基团,本发明优选直接通过所述活性基团与靶向物化学键合连接,或者通过亲水性连接物将所述活性基团与靶向物化学键合连接,即可以先将靶向物与亲水性连接物化学键合,然后在此基础上再通过所述亲水性连接物与无机材料表面的活性基团化学键合,也可以先将无机材料表面的活性基团与亲水性连接物化学键合,然后在此基础上再通过所述亲水性连接物与靶向物化学键合。在本发明中,所述亲水性连接物的可选种类优选与上述亲水性连接物的可选种类一致,在此不再赘述。本发明对所述活性基团的具体种类没有特殊限定,能够实现与亲水性连接物或靶向物进行化学键合即可,具体的,所述活性基团可以为羟基。本发明对所述无机材料的来源没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。
本发明提供的靶向纳米载体包括靶向物,所述靶向物化学键合在所述纳米载体上,所述靶向物为天冬氨酸或天冬氨酸衍生物。在本发明中,所述靶向物与纳米载体化学键合的具体方式可以为酯基,也可以为酰胺基,本发明对此没有特殊限定。在本发明中,所述靶向纳米载体中天冬氨酸提供的靶向基团优选包括式I~IV任一所示结构的基团,分别记为D-Asp、L-Asp-A、L-Asp-N、L-Asp:
本发明提供了上述技术方案所述靶向纳米载体的制备方法,包括以下步骤:
在溶剂存在条件下,在纳米载体上经化学键合修饰靶向物,得到靶向纳米载体。
本发明优选根据纳米载体以及靶向物的具体种类选择合适的方法将二者化学键合制备靶向纳米载体,下面进行详细说明。
第一种情况,当所述纳米载体为无机材料形成的纳米粒子时,本发明优选在溶剂存在条件下,将所述纳米载体与靶向物通过化学反应将二者化学键合,得到靶向纳米载体;所述溶剂以及化学反应的条件根据无机材料以及靶向物的种类确定,本发明对此没有特殊限定。
第二种情况,当所述纳米载体为有机高分子聚合物形成的纳米粒子时,根据所述有机高分子聚合物以及靶向物的性质,本发明可以参照上述第一种情况制备靶向纳米载体,即首先制备纳米载体,然后在溶剂存在条件下,将所述纳米载体与靶向物通过化学反应将二者化学键合,得到靶向纳米载体;所述溶剂以及化学反应的条件根据有机高分子聚合物以及靶向物的种类确定,本发明对此没有特殊限定。
第三种情况,当所述纳米载体为有机高分子聚合物形成的纳米粒子时,根据所述有机高分子聚合物以及靶向物的性质,本发明还可以将靶向物化学键合于制备有机高分子聚合物的单体上,然后在此修饰有靶向物的单体基础上实现靶向纳米载体的制备;所述修饰有靶向物的单体的结构以及在此基础上进一步制备靶向纳米载体的条件根据有机高分子聚合物以及靶向物的种类确定,本发明对此没有特殊限定。
在本发明的实施例中,以L-Asp为靶向基团、PDPA为疏水性聚合物、PEG为亲水性连接物制备靶向纳米载体(Asp-PEG-PDPA)为例进行说明。在本发明中,以L-Asp为靶向基团的Asp-PEG-PDPA的制备方法优选包括以下步骤:
将化合物S1、化合物S6、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并***、4-二甲氨基吡啶与第一有机溶剂混合,进行酰胺化反应,得到化合物S7;
将所述化合物S7、化合物S4、偶氮二异丁腈与第二有机溶剂混合,进行可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合反应,得到化合物S8;
将所述化合物S8、三氟乙酸与第三有机溶剂混合,进行脱叔丁氧羰基(Boc)反应,得到化合物S9(即以L-Asp为靶向基团的Asp-PEG-PDPA);
所述化合物S1、化合物S6、化合物S7、化合物S4、化合物S8以及化合物S9的结构式如下所示:
本发明将化合物S1、化合物S6、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并***、4-二甲氨基吡啶与第一有机溶剂混合,进行酰胺化反应,得到化合物S7。在本发明中,所述化合物S1、化合物S6、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并***与4-二甲氨基吡啶的摩尔比优选为1:(0.2~3):(1~3):(1~3):(0.01~1),更优选为1:1:1.2:1.2:0.1;所述第一有机溶剂优选为二氯甲烷,本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊限定,保证反应顺利进行即可。本发明优选将化合物S1、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并***和4-二甲氨基吡啶溶解于第一有机溶剂中,得到混合物料;将化合物S6溶解于第一有机溶剂中,得到化合物S6溶液;将所述化合物S6溶液一次性加到所述混合物料中进行酰胺化反应。在本发明中,所述酰胺化反应优选在室温条件下进行,所述酰胺化反应的时间优选为4~48h,更优选为24h;所述酰胺化反应优选在氮气保护条件下进行。所述酰胺化反应后,本发明优选将所得产物体系进行旋蒸以除去溶剂,将所得粗产物溶解于乙酸乙酯中,经过滤除去不溶物,将滤液浓缩得到化合物S7。
得到化合物S7后,本发明将所述化合物S7、化合物S4、偶氮二异丁腈与第二有机溶剂混合,进行RAFT聚合反应,得到化合物S8。在本发明中,所述化合物S4、化合物S7与偶氮二异丁腈的摩尔比优选为25:(0.5~1.2):(0.01~0.5),更优选为25:1:0.1;所述第二有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺,本发明对所述第二有机溶剂的用量没有特殊限定,保证反应顺利进行即可。本发明优选将化合物S4与偶氮二异丁腈溶解于第二有机溶剂中,在氮气保护下,向所得混合液中加入化合物S7,进行RAFT聚合反应。在本发明中,所述RAFT聚合反应的温度优选为40~100℃,更优选为70℃;时间优选为4~48h,更优选为24h;所述RAFT聚合反应优选在氮气保护条件下进行。所述RAFT聚合反应后,本发明优选将所得产物体系冷却至室温,然后置于透析袋中进行透析,得到化合物S8。在本发明中,所述透析采用的透析液优选依次为无水乙醇与高纯水,采用无水乙醇与高纯水透析的时间独立地优选为6~72h,更优选为24h;所述透析后,本发明优选将透析袋中物料取出,冷冻干燥后,得到化合物S8,为粉红色非晶状固体。
得到化合物S8后,本发明将所述化合物S8、三氟乙酸与第三有机溶剂混合,进行脱叔丁氧羰基反应,得到化合物S9。在本发明中,所述化合物S8与三氟乙酸的用量比优选为1mmol:(10~1000)mL,更优选为1mmol:100mL;所述第三有机溶剂优选为二氯甲烷,本发明对所述第三有机溶剂的用量没有特殊限定,保证反应顺利进行即可。在本发明中,所述脱叔丁氧羰基反应优选在室温条件下进行,所述脱叔丁氧羰基反应的时间优选为0.5~48h,更优选为24h;所述脱叔丁氧羰基反应优选在氮气保护条件下进行。所述脱叔丁氧羰基反应后,本发明优选将所得产物体系进行旋蒸除去溶剂和三氟乙酸,将所得粗产物溶解于乙酸乙酯中,然后置于透析袋中进行透析,得到化合物S9。在本发明中,所述透析采用的透析液优选依次为无水乙醇与高纯水,采用无水乙醇与高纯水透析的时间独立地优选为6~72h,更优选为24h;所述透析后,本发明优选将透析袋中物料取出,冷冻干燥后,得到化合物S9,为粉红色非晶状固体。
在本发明中,当以D-Asp、L-Asp-A或L-Asp-N为靶向基团制备相应的靶向纳米载体(PDPA为疏水性聚合物,PEG为亲水性连接物)时,采用本领域常规化学合成方法即可,具体的,其制备方法可以与上述以L-Asp为靶向基团制备靶向纳米载体的方法基本相同,在此不再赘述。
本发明提供了上述技术方案所述靶向纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的靶向纳米载体作为活体植物植株、活体植物植株的组织、活体植物植株的器官、活体植物植株的细胞、体外培养的外植体(explant)、体外培养的愈伤组织、体外培养的植物组织或体外培养的植物细胞的主动靶向纳米载体的应用。在本发明中,所述活体植物植株优选包括单子叶植物或真双子叶植物。在本发明中,所述单子叶植物优选包括天门冬目植物、禾本目植物、鸭跖草目植物或棕榈目植物;所述天门冬目植物优选包括兰科植物;所述禾本目植物优选包括禾本科植物;所述禾本科植物优选包括玉米、水稻、小麦、高粱、竹子或荞麦;所述鸭跖草目植物优选包括鸭跖草科植物;所述鸭跖草科植物优选包括鸭跖草。在本发明中,所述真双子叶植物包括菊目植物、葫芦目植物、豆目植物、茄目植物或十字花目植物;所述菊目植物优选包括菊科植物;所述葫芦目植物优选包括葫芦科植物;所述豆目植物优选包括豆科植物,所述豆科植物优选包括大豆或豌豆;所述茄目植物优选包括茄科植物,所述茄科植物优选包括番茄、辣椒或马铃薯;所述十字花目植物优选包括十字花科植物,所述十字花科植物优选包括拟南芥或油菜。在本发明中,所述活体植物植株的器官优选包括叶片、种子或根;所述体外培养的植物细胞优选包括体外培养的原生质体,所述体外培养的原生质体具体可以为叶片、胚轴或根尖制备得到。在本发明中,所述靶向纳米载体能够实现植物细胞壁及细胞膜的主动靶向和穿越,形成“特洛伊木马”式的细胞穿透和靶向。将本发明所述靶向纳米载体用于对植物递送药物,能够降低用药剂量和成本、对搭载药物具有保护作用并提高药物效率、延长药物作用时间,降低毒性和污染性,降低耐药概率。
在本发明中,所述靶向纳米载体可以单独使用,也可以与非靶向修饰的纳米载体混合使用,当所述靶向纳米载体与非靶向修饰的纳米载体混合使用时,所述靶向纳米载体的质量优选为靶向纳米载体与非靶向修饰的纳米载体总质量的1%以上,具体可以为20~80%;本发明所述非靶向修饰的纳米载体具体是指没有任何修饰的纳米载体或者采用除本发明所述靶向物以外的物质修饰的纳米载体。
本发明提供了一种靶向载药纳米载体,包括靶向纳米载体以及包载在所述靶向纳米载体中的药物,所述靶向纳米载体为上述技术方案所述靶向纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的靶向纳米载体。在本发明中,所述靶向载药纳米载体的载药率优选为1~99%,更优选为30~80%,在本发明中,所述药物优选包括小分子药物或生物大分子;所述生物大分子优选包括核酸、蛋白质、氨基酸、多肽、糖类物质或脂类物质,所述核酸具体可以为DNA或RNA;所述小分子药物优选包括植物激素、保水剂、促生长药物、抗虫害药物、抗冻药物、抗热药物、抗紫外线药物、荧光素、转基因药物或同位素标记的化合物,所述植物激素优选包括生长素(auxin)、赤霉素、细胞***素、乙烯、茉莉酸、油菜甾醇、独脚金内酯、脱落酸(ABA)或ABA类似物(如Pyrabactin、Quinabactin、Opabacti、AM1、AMF1α、AMF1β、AMF2α、AMF2β、AMF4或AMC1β)。在本发明的实施例中,具体以ABA为例进行说明;ABA是一种植物内源激素,当植物受到干旱、盐等胁迫时,ABA能够关闭叶片气孔,减少水分蒸腾,激活下游抗逆信号,从而达到植物抗旱的效果,但由于造价昂贵并且在体外及其不稳定,难以用于农业生产;通过采用本发明提供的靶向纳米载体包载ABA,能够有效增强植物抗旱效果,大大减少ABA用量。
在本发明中,所述药物与靶向纳米载体的结合方式优选包括亲疏水作用力、氢键、静电作用力或化学键结合。
本发明提供了上述技术方案所述靶向载药纳米载体的制备方法,包括以下步骤:
将靶向纳米载体、药物与溶剂混合,进行包载处理,得到靶向载药纳米载体。
本发明优选靶向纳米载体与药物分别溶解于有机溶剂中,将所得靶向纳米载体溶液与药物溶液混合,得到混合溶液;将所述混合溶液滴加至水中进行包载处理,得到靶向载药纳米颗粒。本发明对制备所述靶向纳米载体溶液与药物溶液采用的有机溶剂种类没有特殊限定,根据靶向纳米载体与药物种类选择即可;在本发明的实施例中,以Asp(包括D-Asp、L-Asp-A、L-Asp-N或L-Asp)为靶向基团、PDPA为疏水性聚合物、PEG为亲水性连接物制备的靶向纳米载体(Asp-PEG-PDPA)为例,所用有机溶剂优选为四氢呋喃;以ABA为所搭载药物为例,所用有机溶剂优选为乙醇。在本发明中,所述靶向纳米载体溶液与药物溶液的浓度独立地优选为1~10mg/mL,更优选为5mg/mL。在本发明中,所述靶向纳米载体溶液与药物溶液的体积比优选以得到所需载药量的靶向载药纳米载体为基准,本发明对此不作特殊限定。在本发明中,所述混合溶液与水的体积比优选为(0.2~0.5):1,更优选为(0.3~0.4):1;本发明优选将所述混合溶液逐滴加入至水中,每滴的体积优选为10μL。
在本发明中,所述包载处理过程中,靶向纳米载体与药物进行自组装(例如可以在亲疏水或电荷吸附等作用力下进行自组装),得到靶向载药纳米载体。本发明优选根据靶向纳米载体与药物的特性选择合适的包载处理条件,具体的,所述包载处理可以在搅拌、超声、电刺激或加热条件下进行,以提高效率,在本发明的实施例中,以Asp-PEG-PDPA为靶向纳米载体、ABA为所搭载药物为例,所述包载处理优选在室温、搅拌条件下进行,所述包载处理的时间优选为2~4h,更优选为3h。
所述包载处理后,本发明优选将所得产物体系于Millipore Amicon Ultra-45K离心过滤装置中离心过滤,取出上清液,靶向载药纳米载体即分散于所述上清液中,置于4℃保存;所述离心过滤的转速优选为3600rpm,时间优选为16min。
本发明对所述靶向载药纳米载体的使用方法没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明中,所述靶向载药纳米载体优选以靶向载药纳米载体分散液的保护形式使用。在本发明中,所述靶向载药纳米载体分散液优选是将靶向载药纳米载体分散于溶剂中得到;所述溶剂优选为水和/或有机溶剂,所述有机溶剂优选包括乙醇、二甲基亚砜或四氢呋喃;所述靶向载药纳米载体分散液的浓度优选为0.1~10mg/mL。在本发明中,所述靶向载药纳米载体分散液的使用方式优选包括喷洒、浸泡、涂抹或注射;以应用例为例,具体是采用靶向载药纳米载体分散液浸泡种子,浸泡时间优选为1~168h;或者将所述靶向载药纳米载体分散液喷洒于植物叶片上,所述靶向载药纳米载体分散液的用量优选为10~10000μL/cm2,更优选为10~500μL/cm2。
在本发明的实施例中,以Asp为靶向基团、PDPA为疏水性聚合物、PEG为亲水性连接物制备靶向纳米载体(Asp-PEG-PDPA),在此基础上以ABA为所搭载药物,其与Asp-PEG-PDPA经自组装形成靶向载药纳米载体(Asp-NP@ABA),然后喷洒于植物叶片可以提高其抗旱能力,制备Asp-NP的流程图以及以搭载ABA为例所得靶向载药纳米载体作为抗旱剂的应用示意图具体如图1所示。在本发明中,当所述靶向基团Asp分别为D-Asp、L-Asp-A、L-Asp-N或L-Asp时,对应的各靶向纳米载体自组装形成胶束Asp-NP分别记为D-Asp-NP、A-Asp-NP、N-Asp-NP和L-Asp-NP,各靶向纳米载体搭载ABA经自组装形成靶向载药纳米载体Asp-NP@ABA分别记为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA和L-Asp-NP@ABA。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
对比例1
制备MeO-PEG-PDPA(化合物S5)的反应式如下所示:
MeO-PEG-CPADN(化合物S3)的合成:
在氮气保护和室温条件下,将化合物S1(4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸,27.9mg,0.1mmol,1.0equiv.)、二环己基碳二亚胺(DCC,24.8mg,0.12mmol,1.2equiv.)、1-羟基苯并***(HOBt,16.2mg,0.12mmol,1.2equiv.)和4-二甲氨基吡啶(DMAP,1.2mg,0.01mmol,0.1equiv.)溶解在二氯甲烷(DCM,1mL)中,搅拌5min,得到混合物料;将化合物S2(Amino-PEG5000-OMe,500mg,0.1mmol,1.0equiv.)溶解在DCM(5mL)中,然后一次性加到所述混合物料中,在室温条件下搅拌反应24h;将所得产物体系通过旋蒸除去溶剂DCM,将所得粗产物溶解于EtOAc(5mL)中,经过滤除去不溶物,将滤液浓缩得到化合物S3,无需进一步纯化将其投入下一步反应中。
MeO-PEG-PDPA(化合物S5)的合成:
将化合物S4(533.3mg,2.5mmol,25equiv.)和偶氮二异丁腈(AIBN,1.6mg,0.01mmol,0.1equiv.)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF,5mL)中,在氮气保护下,向所得混合液中加入上一步产物化合物S3,然后在70℃条件下搅拌反应24h;反应结束后,将所得产物体系冷却至室温,然后置于透析袋中进行纯化,具体是先以无水乙醇作为透析液,透析24h,再把透析液换成高纯水,透析24h,然后将透析袋中物料取出,冷冻干燥后,得到化合物S5,即MeO-PEG-PDPA(具体为MeO-5kPEG-4kPDPA),为粉红色非晶状固体。
实施例1
制备以L-Asp为靶向基团的Asp-PEG-PDPA(化合物S9)的反应式如下所示:
在氮气保护和室温条件下,将化合物S1(27.9mg,0.1mmol,1.0equiv.)、DCC(24.8mg,0.12mmol,1.2equiv.)、1-羟基苯并***(HOBt,16.2mg,0.12mmol,1.2equiv.)和4-二甲氨基吡啶(DMAP,1.2mg,0.01mmol,0.1equiv.)溶解在二氯甲烷(DCM,1mL)中,搅拌5min,得到混合物料;将化合物S6(Amino-PEG5000-Boc-Asp-OtBu,500mg,0.1mmol,1.0equiv.)溶解在DCM(5mL)中,然后一次性加到所述混合物料中,在室温条件下搅拌反应24h;将所得产物体系通过旋蒸除去溶剂DCM,将所得粗产物溶解于乙酸乙酯(EtOAc,5mL)中,经过滤除去不溶物,将滤液浓缩得到化合物S7,无需进一步纯化将其投入下一步反应中;
将化合物S4(2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯,533.3mg,2.5mmol,25equiv.)和AIBN(1.6mg,0.01mmol,0.1equiv.)溶解在DMF(5mL)中,在氮气保护下,向所得混合液中加入化合物S7,然后在70℃条件下搅拌反应24h;反应结束后,将所得产物体系冷却至室温,然后置于透析袋中进行纯化,具体是先以无水乙醇作为透析液,透析24h,再把透析液换成高纯水,透析24h,然后将透析袋中物料取出,冷冻干燥后,得到化合物S8,为粉红色非晶状固体;
在氮气保护下,将化合物S8溶解在5mL DCM和5mL三氟乙酸(TFA)的混合溶液中,将所得混合物料在室温条件下搅拌反应24h;将所得产物体系通过旋蒸除去溶剂DCM和TFA,将所得粗产物溶解于EtOAc(5mL)中,然后置于透析袋中进行纯化,具体是先以无水乙醇作为透析液,透析24h(期间更换5次透析液),再把透析液换成高纯水,透析24h(期间更换5次透析液),然后将透析袋中物料取出,冷冻干燥后,得到化合物S9,为粉红色非晶状固体。
参照上述方法,分别制备以D-Asp、L-Asp-A和L-Asp-N为靶向基团的Asp-PEG-PDPA。
将实施例1制备的化合物S9进行核磁表征,结果如图2所示,由图2可确定实施例1制备的产物为Asp-PEG-PDPA。
将实施例1制备的Asp-PEG-PDPA粉末(靶向基团为D-Asp、L-Asp-A、L-Asp-N或L-Asp)制备成胶束Asp-NP(具体为D-Asp-NP、A-Asp-NP、N-Asp-NP和L-Asp-NP)后进行透射电镜表征,具体是将Asp-PEG-PDPA粉末(1mg,0.625mmol)溶解在四氢呋喃(0.2mL)中,得到Asp-PEG-PDPA溶液;在装有转子的反应瓶内加入超纯水(1mL),将所述Asp-PEG-PDPA溶液以每10μL为一滴逐滴加入到反应瓶中,滴加结束后,室温条件下搅拌3h,全程在通风橱内操作;之后将所得体系于Millipore Amicon Ultra-45K离心过滤装置中离心过滤(3600rpm,16min),取出上清液(具体为离心过滤装置的内管中的液体),Asp-NP即分散于所述上清液中,置于4℃保存。
图3为实施例1中L-Asp-NP的透射电镜图(比例尺为50nm),由图3可知,Asp-NP纳米粒子大小均一,粒径在100nm左右。
实施例2
将实施例1制备的Asp-PEG-PDPA粉末(1mg,0.625mmol;靶向基团为D-Asp、L-Asp-A、L-Asp-N或L-Asp)溶解在四氢呋喃(0.2mL)中,得到Asp-PEG-PDPA溶液;将脱落酸(ABA,5mg,18.9mmol)溶解在乙醇(1mL)中,得到ABA溶液;将0.2mL所述Asp-PEG-PDPA溶液(含1mg的Asp-PEG-PDPA)与一定体积ABA溶液混合,使ABA质量为Asp-PEG-PDPA和ABA总质量的40%,得到混合溶液;
在装有转子的反应瓶内加入超纯水(1mL),将所述混合溶液以每10μL为一滴逐滴加入到反应瓶中,滴加结束后,室温条件下搅拌3h,全程在通风橱内操作;反应结束后,将所得产物体系于Millipore Amicon Ultra-45K离心过滤装置中离心过滤(3600rpm,16min),取出上清液(具体为离心过滤装置的内管中的液体),载药产物(记为Asp-NP@ABA,具体为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA和L-Asp-NP@ABA)即分散于所述上清液中,置于4℃保存。
对比例2
按照实施例2的方法制备载药产物,不同之处仅在于将Asp-PEG-PDPA粉末替换为MeO-PEG-PDPA,最终所得载药产物记为NP@ABA。
采用动态光散射仪(DLS)检测NP(具体为对比例1制备的MeO-PEG-PDPA)、NP@ABA、Asp-NP(具体为D-Asp-NP、A-Asp-NP、N-Asp-NP和L-Asp-NP)和Asp-NP@ABA(具体为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA和L-Asp-NP@ABA)的粒径分布以及多分散系数,结果如图4所示。由图4可知,新制备L-Asp-NP@ABA的粒径为135.5±4.2nm,PDI为0.164±0.038(放置12个月后,L-Asp-NP@ABA的粒径为139.4±5.9nm,PDI为0.15±0.03);新制备NP@ABA的粒径为139.53±1.21nm,PDI为0.156±0.012(放置9个月后,NP@ABA的粒径为136.6±13.1nm,PDI为0.32±0.08)。新制备的A-Asp-NP@ABA的粒径为177.6±1.5nm,PDI为0.17±0.01;新制备的D-Asp-NP@ABA的粒径为173.9±3.8nm,PDI为0.12±0.02;新制备的N-Asp-NP@ABA的粒径为169.7±3.1nm,PDI为0.18±0.03。
对Asp-NP@ABA和NP@ABA的载药率进行测定,结果如图4所示。由图4可知,L-Asp-NP@ABA的载药率为72.07±1.92%,A-Asp-NP@ABA的载药率为65.3±1.4%,D-Asp-NP@ABA的载药率为64.2±2.8%,N-Asp-NP@ABA的载药率为69.1±1.0%;NP@ABA的载药率为60.09±2.79%。
以下应用例中,若无特殊说明,所述的Asp靶向基团均为L-Asp;当采用其它构型的Asp靶向基团时均进行标注说明。
应用例1Asp-NP能够高效穿透植物组织细胞壁和细胞膜
按照实施例2的方法制备Asp-NP@DiO,不同之处仅在于将ABA替换成3,3′-双十八烷基氧碳花菁高氯酸盐(DiO;CAS:34215-57-1)。
按照上述方法制备NP@DiO,不同之处仅在于将Asp-PEG-PDPA替换为MEO-PEG-PDPA。
将Asp-NP@DiO分散于超纯水中,得到浓度为31.8μM的Asp-NP@DiO分散液;将所述Asp-NP@DiO分散液喷洒在14天大的拟南芥叶片上,每株约为60μL;在36h后,使用激光共聚焦显微镜,基于其3D层扫功能追踪DiO荧光信号在拟南芥叶片表面到垂直往下的叶肉组织中的穿透深度,并设置MS、DiO以及NP@DiO对照组,具体结果见图5(标尺为50μm)和图6。图5展示了在20μm时的共聚焦显微镜的观察结果。根据图5中对DiO信号观察可以看出,在20μm这一深度时,只有Asp-NP能够穿透并将DiO带入这个组织深度。同时,通过叠加图可以看出,Asp-NP@DiO组有很强的叶绿体(红色颗粒)和DiO信号的共定位,说明Asp-NP@DiO很有可能已经穿过了细胞壁和细胞膜到达了胞内。图6中每一个点代表一次重复试验,总共采用了4株拟南芥。由图6可知,Asp-NP@DiO在喷洒后的叶片中组织穿透深度最大,这说明Asp-NP在喷洒后短时间内具有较强的组织穿透能力。
将所述Asp-NP@DiO分散液与分离的拟南芥叶肉细胞原生质体共培养4h;更换新鲜W5培养基培养20h,之后使用激光共聚焦显微镜,追踪DiO荧光信号在原生质体质膜往内到胞内的亚细胞定位,并设置W5缓冲液、DiO以及NP@DiO对照组,具体结果见图7(标尺为50μm)。
采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate;FITC)标记Asp-NP得到Asp-NP-FITC,将所述Asp-NP-FITC分散于超纯水中,得到浓度为12.5μM的Asp-NP-FITC分散液;将所述Asp-NP-FITC分散液喷洒在鸭跖草叶片上,每片叶约为10μL;在6h后,使用激光共聚焦显微镜,基于其3D层扫功能追踪FITC荧光信号在鸭跖草叶片表面到垂直往下的叶肉组织中的穿透深度,同时设置MS组作为对照,具体结果见图8(标尺为50μm)。图8展示了在不同深度时的共聚焦显微镜的观察结果。根据图8中对FITC信号观察可以看出,Asp-NP能够穿透并将FITC带入接近50μm这个组织深度。因为鸭跖草的叶片上表皮不具有气孔,此实验确认了靶向纳米载体是穿过细胞壁而不是通过气孔进行目标分子的递送。
综合图5、图6、图7和图8的结果,进一步证明了本发明制备的Asp-NP能够高效穿透不同植物的组织、细胞壁和细胞膜,把目标分子递送进入活体植物组织和细胞内。
应用例2Asp-NP@ABA能够高效通过种皮和根部进入植物并进行递送
将野生型(WT)拟南芥种子置于24孔板中,每孔20颗;以1/2MS(pH=6.7)液体培养基稀释Asp-NP@ABA(具体为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA或L-Asp-NP@ABA),分别得到具有不同靶向基团的Asp-NP@ABA分散液(以ABA浓度计,浓度为0.1μM),在每孔中加入每种Asp-NP@ABA分散液(400μL)进行孵育,每个浓度设置6个孔重复,置于培养箱中萌发(16h光照/8h黑暗),每12h统计发芽率,连续统计7天。同时设置MS、ABA、NP、Asp-NP(具体为D-Asp-NP、A-Asp-NP、N-Asp-NP或L-Asp-NP)以及NP@ABA作为对照。
图9为采用不同处理后拟南芥种子发芽率对比图,由图9可知,具有不同靶向基团的Asp-NP@ABA相较于ABA均能够更有效的进入种子组织内部,而被Asp-NP递送进种子组织内部的ABA能够更显著延缓种子萌发。
将Asp-NP-FITC分散于1/2MS培养基中,使所述Asp-NP-FITC的浓度为12.5μM,得到含有Asp-NP-FITC的培养基;然后分别将7天大的拟南芥小苗根部、4天大的大豆小苗根部以及4天大的玉米小苗根部浸泡于所述含有Asp-NP-FITC的培养基中,在不同时间点观察Asp-NP-FITC穿透各植物根部组织的深度。同时设置MS组作为对照。
图10为Asp-NP-FITC在不同时间点穿透拟南芥根部组织不同深度的对比图(标尺为100μm)。图11为Asp-NP-FITC在4h和6h后穿透大豆根部组织不同深度的对比图(标尺为100μm)。图12为Asp-NP-FITC在4h和6h后穿透玉米根部组织不同深度的对比图(标尺为100μm)。由图10、图11和图12分别能看出,Asp-NP-FITC通过浸泡的方式能够高效地进入不同物种植物的根部组织。
将10天大的拟南芥小苗置于水培***中,仅根部浸泡于1/2MS(pH=6.7)液体培养基稀释的Asp-NP@ABA分散液(所用Asp-NP@ABA具体为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA或L-Asp-NP@ABA;以ABA浓度计,浓度为2.5μM)。每株小苗的浸泡体积为1.8mL,每次实验设置10株重复,置于培养箱中萌发(16h光照/8h黑暗),每12h统计叶片衰老黄化的数量,连续统计2天。同时设置MS、ABA、NP、Asp-NP(具体为D-Asp-NP、A-Asp-NP、N-Asp-NP或L-Asp-NP)以及NP@ABA作为对照。
图13为水培***中采用不同处理后拟南芥的根部吸收后ABA引起的叶片衰老黄化的数量统计图。由图13可知,相较于其他处理,具有不同靶向基团的Asp-NP@ABA能够更高效地把ABA经由根部递送进入植物组织内部,ABA被递送进细胞后,能够引起叶片衰老,显示出黄化,因此较多的黄化叶片数量显示出相应的Asp-NP递送ABA的效率更高。
应用例3Asp-NP@ABA赋予模式植物抗旱能力
将Asp-NP@ABA分散于超纯水中,得到Asp-NP@ABA分散液,所述Asp-NP@ABA分散液中ABA的浓度为10μM;将所述Asp-NP@ABA分散液以每棵苗约60μL的量喷洒于拟南芥叶片(3周龄)上,喷洒后不再浇水,置于培养箱中生长(8h光照/16h黑暗,光照时温度为22℃,黑暗时温度为19.8℃),每天记录植物生长状况。
图14为采用不同处理喷洒拟南芥小苗后在干旱条件下延长小苗生存周期的对比图,由图14可知,Asp-NP@ABA处理组在干旱18日后相较于其他组相比仍然有良好的生命力。说明各个植株被Asp-NP@ABA处理后能够延长生存周期。图15为采用不同处理喷洒拟南芥小苗后的生存率对比图,具体是采用不同处理喷洒拟南芥小苗后开始至第12天复水一次,即前11天均保持干旱,在第13天检测生存率,进一步验证Asp-NP@ABA对于植株抗旱的准确性。由图15可知,Asp-NP@ABA处理组的拟南芥植株生存率为100%,而其他处理组生存率为0%。图16为采用不同处理喷洒拟南芥小苗后在干旱条件下延长小苗的生存周期相对于MS处理组延长的生存周期的百分比散点图(设置4次平行试验,本试验所采用的Asp-NP@ABA具体为D-Asp-NP@ABA、A-Asp-NP@ABA、N-Asp-NP@ABA或L-Asp-NP@ABA,所采用的Asp-NP具体为D-Asp-NP、A-Asp-NP、N-Asp-NP或L-Asp-NP),由图16可知,植物植株被具有不同靶向基团的Asp-NP@ABA处理后,生存周期被延长了平均57%。图17为以干旱条件下的生存周期为衡量标准测定的Asp-NP@ABA最低有效浓度结果图(以ABA处理的结果作为参照),由图17可知,相同干旱条件下,Asp-NP@ABA可以将脱落酸浓度降低至ABA的10万倍到百万倍。
进一步研究发现,拟南芥叶片表面喷洒Asp-NP@ABA后,使用高效液相色谱质谱联用技术在原生质体和叶片的细胞外基质(即细胞壁和细胞间隙)中明显检测到ABA的富集。图18为拟南芥叶片喷洒NP@ABA以及Asp-NP@ABA 24h后细胞质内和质外体内的ABA含量对比图,由图18可知,NP@ABA以及Asp-NP@ABA均能够有效的将ABA运输到细胞壁中,使ABA在细胞外区域富集;而在同样的叶片中提取的原生质体中ABA的富集情况所有不同,喷洒Asp-NP@ABA时原生质体中ABA富集较多,这说明当同样量的ABA被纳米载体载入细胞壁后,Asp的靶向修饰才能高效的跨越细胞膜进入细胞质内。
应用例4Asp-NP@ABA赋予真双子叶植物和单子叶植物抗旱能力
将Asp-NP@ABA分散于超纯水中,得到Asp-NP@ABA分散液,所述Asp-NP@ABA分散液中ABA的浓度为10μM;将所述浓度为10μM的Asp-NP@ABA分散液以每棵苗约600~800μL的量喷洒于大豆叶片(5周龄)上,喷洒后不再浇水,置于培养箱中生长(8h光照/16h黑暗,光照时温度为22℃,黑暗时温度为19.8℃),每天记录植物生长状况。
图19为采用不同处理喷洒大豆后在干旱条件下延长大豆生存周期的对比图,由图19可知,Asp-NP@ABA处理组在干旱8日后相较于其他组相比仍然有良好的生命力。说明各个大豆植株被Asp-NP@ABA处理后能够增强抗旱能力。图20为采用不同处理喷洒大豆后在干旱条件下延长大豆的生存周期的中位值统计图。由图19和图20可知,大豆植株被Asp-NP@ABA处理后,生存周期中位值被延长了平均50%。
同时,将Asp-NP@ABA分散于超纯水中,得到Asp-NP@ABA分散液,所述Asp-NP@ABA分散液中ABA的浓度为50μM;将所述浓度为50μM的Asp-NP@ABA分散液以每棵苗约7-8mL的量喷洒于玉米叶片(10周龄)上,喷洒后不再浇水,置于室外生长,每天记录植物生长状况。
图21为采用不同处理喷洒玉米后在干旱条件下延长玉米生存周期的对比图,由图21可知,Asp-NP@ABA处理组在干旱34日后相较于ABA组相比仍然有良好的生命力。说明各个玉米植株被Asp-NP@ABA处理后能够增强抗旱能力。
应用例5
将实施例1制备的Asp-PEG-PDPA粉末与非靶向的聚合物(即MeO-PEG-PDPA)混合,得到混合粉末,所述混合粉末中Asp-PEG-PDPA粉末的质量含量分别为20%、40%、60%、80%或100%;将所述混合粉末(1mg)溶解在四氢呋喃(0.2mL)中,得到混合溶液;将脱落酸(ABA,5mg,18.9mmol)溶解在乙醇(1mL)中,得到ABA溶液;将0.2mL所述混合溶液与一定体积ABA溶液混合,使ABA质量为所述混合粉末与ABA(即Asp-PEG-PDPA+MeO-PEG-PDPA+ABA)总质量的40%,得到含ABA混合溶液;在装有转子的反应瓶内加入超纯水(1mL),将所述含ABA混合溶液以每10μL为一滴逐滴加入到反应瓶中,滴加结束后,室温条件下搅拌3h,全程在通风橱内操作;反应结束后,将所得产物体系于Millipore Amicon Ultra-45K离心过滤装置中离心过滤(3600rpm,16min),取出上清液(具体为离心过滤装置的内管中的液体),载药产物即分散于所述上清液中,置于4℃保存。
按照应用例2和应用例3的方法分别对所述载药产物进行性能测试,结果如图22和图23所示。由图22和图23可知,在同一ABA浓度条件下,添加不同比例非靶向的聚合物(即MeO-PEG-PDPA)的载药产物对于种子萌发的抑制效果以及对拟南芥在干旱条件下的生存周期的延长效果没有统计学差异。
由以上应用例可知,本发明提供的纳米递送载体至少具有以下有益效果:
1)操作便捷,载药后可以直接分散于溶剂中喷洒在多种不同的植物表面,也可以采用浸泡、涂抹或注射方式;2)应用范围广,对被装载的药物种类具有高度兼容性,具有较高的载药率,并且可以用于不同的植物、品种和组织器官;3)递送效率极高,在应用例3条件下可以将脱落酸浓度降低10万倍到百万倍;4)作用时间久,在应用例3中干旱条件下的植物生存周期延长57%,生存率为100%,而其他处理组生存率为0%;5)性质稳定,12个月后粒径仍稳定不变;6)成本可控,技术路线简单,可大规模生产。
因此,本发明提供的靶向纳米载体具有广泛应用的潜力,尤其是其特性使得在极地、极端恶劣环境下具有极佳的优势,如科考拓荒、外星探索。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种靶向纳米载体,包括纳米载体以及化学键合在所述纳米载体上的靶向物,其中,所述纳米载体为有机高分子聚合物形成的胶束,所述靶向物为天冬氨酸;
所述有机高分子聚合物包括疏水性聚合物以及与所述疏水性聚合物共价连接的亲水性连接物,所述亲水性连接物与所述靶向物经化学键合连接;
所述疏水性聚合物为PDPA,所述亲水性连接物为聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰、聚羧酸甜菜碱、葡聚糖、葡聚糖、透明质酸、壳聚糖、β-环糊精、超支化聚缩水甘油醚、聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚马来酸酐或聚季胺盐。
2.根据权利要求1所述的靶向纳米载体,其特征在于,所述天冬氨酸提供的靶向基团包括式I~IV任一所示结构的基团:
3.根据权利要求1所述的靶向纳米载体,其特征在于,所述纳米载体的粒径为10~1000nm。
4.根据权利要求1或3所述的靶向纳米载体,其特征在于,所述有机高分子聚合物的数均分子量为3~50kDa。
5.权利要求1~4任一项所述靶向纳米载体的制备方法,包括以下步骤:
在溶剂存在条件下,在纳米载体上经化学键合修饰靶向物,得到靶向纳米载体。
6.权利要求1~4任一项所述靶向纳米载体或权利要求5所述制备方法制备得到的靶向纳米载体作为活体植物植株、活体植物植株的组织、活体植物植株的器官、活体植物植株的细胞、体外培养的外植体、体外培养的愈伤组织、体外培养的植物组织或体外培养的植物细胞的主动靶向纳米载体的应用。
7.一种靶向载药纳米载体,包括靶向纳米载体以及包载在所述靶向纳米载体中的药物,所述靶向纳米载体为权利要求1~4任一项所述靶向纳米载体或权利要求5所述制备方法制备得到的靶向纳米载体。
8.根据权利要求7所述的靶向载药纳米载体,其特征在于,所述药物包括小分子药物或生物大分子,所述靶向载药纳米载体的载药率为1~99%。
9.权利要求7或8所述靶向载药纳米载体的制备方法,包括以下步骤:
将靶向纳米载体、药物与溶剂混合,进行包载处理,得到靶向载药纳米载体。
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