CN106166291B - 脾多肽提高klrk1或lck治疗免疫抑制的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脾多肽提高KLRK1或LCK治疗免疫抑制的医药用途，特别是脾多肽在制备KLRK1或LCK蛋白低下引发的疾病的药物中的应用，所述KLRK1或LCK蛋白低下引发的疾病包括：肿瘤、病原微生物感染、感冒、哮喘、支气管炎、类风湿性关节炎，本发明还包括脾多肽和与环磷酰胺联合用药在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

脾多肽提高KLRK1或LCK治疗免疫抑制的医药用途

技术领域

本发明涉及脾多肽提高杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1)或淋巴细胞特异蛋白质酪氨酸激酶(LCK)治疗免疫抑制的医药用途。可望用于各种因KLRK1或LCK表达降低所致疾病的治疗。

背景技术

1、自然杀伤细胞(natural killer，NK)无需抗原预先作用就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，因为具备此功能特点，NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。NK细胞表面分布杀伤活化受体和杀伤抑制受体，通过两种受体的相互作用确保NK细胞既能杀伤病毒感染的细胞和突变肿瘤细胞，又能保护宿主自身正常细胞免遭破坏。NK细胞表面杀伤抑制受体与靶细胞表面组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ类分子)结合，可产生杀伤抑制信号，能阻断杀伤信号的传递。对于宿主自身组织细胞，因MHCⅠ类分子表达正常使杀伤抑制受体介导的抑制作用占主导地位，表现为NK细胞失活；对于病毒感染的细胞和肿瘤细胞，由于MHCⅠ类分子表达减少或缺失而影响杀伤抑制受体与相应配体的结合，从而使杀伤活化受体的作用占主导地位，表现为NK细胞活化并产生杀伤作用。近年来研究表明，人类细胞表面抑制性受体可以分为三个家族：

第一个家族为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Ig-like Receptors KIR)，在结构上为胞外段有二到三个免疫球蛋白样结构域的一型膜蛋白受体，配体为人类白细胞抗原Ⅰ类分子(HLAⅠ类分子)。

第二个家族为免疫球蛋白样转录产物(ILT)，包括ILT-4、ILT-2等。

第三个家族为杀伤细胞凝集素样受体(Killer cell Lectin-likeReceptorsKLR)，所有成员定位于12号染色体的NK复合体(NKC)，包括杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1)、CD94/NKG2、NKR-P1A、KLRF1、CD69、CLEC-2等。

免疫抑制性受体的结构特点为胞内段含有一个或多个免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)，ITIM是由6个氨基酸组成的保守序列(I/L/VXYXXL/V，X代表任一氨基酸)。当免疫抑制性受体与相应配体偶联时，ITIM发生酪氨酸磷酸化，然后与SHP1蛋白酪氨酸 磷酸酶或/和SPIP肌醇磷酸酶的结合，产生细胞活化的负调节效应。

由于免疫抑制性受体在细胞活性调节中发挥重要作用，尤其近年来发现这一类分子在杀伤性T淋巴细胞和树突状细胞(Dendritic cells，DC)表面均有表达，使其具有重要的理论探索意义，是当前免疫学、细胞与分子生物学和肿瘤学等领域的热门课题。

2、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte specific protein tyrosinekinase,Lck)是Src家族成员的蛋白酪氨酸激酶，主要存在于T淋巴细胞内，参与T细胞的发育、分化、活化的信号转导过程。国内外许多研究显示：Lck的异常表达和调节与细胞的癌变密切相关，如人淋巴细胞和非淋巴细胞恶性肿瘤均有Lck异常表达或激活，在转基因小鼠,Lck的表达导致胸腺肿瘤。Lck结构域中催化区含有两个可供调节的酪氨酸残基(tyr394和tyr505),tyr394是一自身磷酸化位点，可通过自身磷酸化作用使Lck激酶活性上调；tyr505的磷酸化则可使Lck激酶活性下调，若以不能被磷酸化的苯丙氨酸置换酪氨酸(Y505F)后，则出现Lck激酶活性的持续升高；Lck可促进STAT5b酪氨酸磷酸化，从而激活STAT5b，促进STAT5b与DNA结合力增加。以上研究表明：LCK在肿瘤和免疫***疾病中发挥重要作用。

3、脾多肽注射液为吉林丰生制药有限公司生产的并已经上市的一种多肽药物。其多肽为小牛脾脏提取物制成的分子量小于6,000道尔顿的多肽、游离氨基酸、核酸、总糖的无菌水溶液。本品每1mL含多肽4.0mg，含游离氨基酸为5.0mg，含核酸为1.0mg，含总糖不低于100μg。脾多肽注射液对机体免疫机能有双向调节作用，能够纠正机体免疫功能紊乱，具有激活和增强机体非特异性免疫功能的作用，能够促进T淋巴细胞成熟并可使未致敏淋巴细胞激活成为致敏淋巴细胞，从而提高了淋巴细胞免疫功能，触发和增强机体对感染的抵抗力。脾多肽注射液还可以可诱导干扰素的产生，直接阻止病毒蛋白质的合成与复制，并能增强细胞表面抗原表达，促进NK细胞的细胞毒活性，调节淋巴细胞和巨噬细胞功能，可明显改善机体细胞免疫功能。脾多肽注射液能刺激骨髓细胞增殖，产生大量白细胞，使造血功能得到提髙。此外，脾多肽注射液还可以非毒性地抑制细胞糖酵解，使以高度糖酵解为特征的肿瘤细胞缺乏能量来源，造成肿瘤细胞代谢过程发生障碍，阻止G0、G1期肿瘤细胞不能向增殖、***期发展，从而达到抗癌的效果。

脾多肽注射液临床上可用于原发性和继发性细胞免疫缺陷病(如湿疹、血小板减少、多次感染综合症等)、呼吸道及肺部感染、可在治疗放化疗引起的白细胞减少症、白血病、再生性障碍贫血、淋巴瘤及其他恶性肿瘤、改善肿瘤患者恶变质、改善术后或重症患者身体虚弱时辅助使用。

本发明采用免疫抑制和荷瘤模型研究其具体的改善免疫力以及与化疗药物联合用药的作用机制的过程中，意外地发现脾多肽可通过提高杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1)或淋巴细胞特异蛋白质酪氨酸激酶(LCK)的表达，达到治疗免疫抑制和抗肿瘤的作用，从而可望用于各种因KLRK1或LCK表达降低所致疾病的治疗。

发明内容

本发明提供了脾多肽可期待用于治疗和预防各种因KLRK1或LCK表达降低所致疾病的医药用途。

本发明发现，脾多肽可以有效地改善环磷酰胺所致的因KLRK1、LCK蛋白的表达量下降所导致的免疫抑制。因此脾多肽可以用于治疗因KLRK1、LCK蛋白的表达量下降所导致的免疫性疾病和肿瘤相关疾病。

为此，本发明提供脾多肽的新的药物用途。

本发明所述脾多肽的新的药物用途包括：

脾多肽在制备KLRK1或LCK蛋白低下引发的疾病的药物中的应用。

所述应用，包括因KLRK1或LCK低下所致疾病的治疗。因KLRK1或LCK低下异常所致疾病包括：肿瘤、病原微生物感染、感冒、哮喘、支气管炎、类风湿性关节炎等。

本发明还包括，脾多肽和与环磷酰胺联合用药在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还包括，脾多肽和与环磷酰胺联合用药在制备提高肿瘤病人免疫力的药物中的应用。

本发明所述脾多肽和与环磷酰胺联合用药，其特征在于，两者配比为：

脾多肽50-100重量份,环磷酰胺20-80重量份。

优选的包括，

脾多肽50重量份,环磷酰胺20重量份。

脾多肽50重量份,环磷酰胺40重量份。

脾多肽50重量份,环磷酰胺80重量份。

脾多肽100重量份,环磷酰胺20重量份。

脾多肽100重量份,环磷酰胺40重量份。

脾多肽100重量份,环磷酰胺80重量份。

为此，本发明进一步提供脾多肽和环磷酰胺的复方药物组合物，所述组合物中两者配比为：脾多肽50-100重量份,环磷酰胺20-80重量份。

本发明的复方药物组合物，必要时可以加入药物可接受的载体。

以上配比中，在生产时可以以公斤为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以克或毫克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的生药材重量配比的比例不变。

以上配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊情况，如重症或轻症，肥胖或瘦小的，可以相应调整组成的量的配比，增加或减少不超过100％，药效不变。

本发明的复方组合物，在制备成药物制剂时，必要时可加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制备。本发明的药物制剂形式，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，颗粒剂每袋等。这些剂型包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的复方组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

在研究脾多肽与环磷酰胺联合用药对荷瘤模型的作用的过程中，我们发现：

1、脾多肽与环磷酰胺联合用药对荷瘤小鼠生存率的作用

如图1所示，CY20mg/kg各剂量组对小鼠的死亡率基本无明显影响，仅CY20mg/kg剂量组小鼠在第16天出现17％死亡率。CY40mg/kg以及与SP联合作用组在第11天时出现死亡现象，其中CY40mg/kg单独用药组死亡率变化最明显，所有动物基本于21天全部死亡；当CY40mg/kg分别与SP联合用药后，小鼠的生存率有所延长，第12天至第21天期间，联合用药组的生存率较CY40mg/kg单独用药组明显升高。CY80mg/kg以及与SP联合用药后，由于CY显著的毒性作用导致所有组别小鼠的生存率均低于21天，然而CY80+SP100剂量组的生存时间21天显著长于CY80mg/kg单独用药的14天。该实验结果说明CY80mg/kg与CY40mg/kg单独作用组毒性强烈，小鼠死亡现象明显，当与SP联合用药后，生存时间和生存率均有所改善，其中以SP100mg/kg剂量联合用药改善作用最为显著。

2、脾多肽(SP)与环磷酰胺(CY)联合用药对荷瘤小鼠体重的作用

表1联合用药对荷瘤小鼠体重的作用(n＝10-12)

*,与空白组比较,P<0.05；#,与模型组比较,P<0.05；

如表1所示，当给予CY治疗后，小鼠的体重均显著下降。CY剂量为20mg/kg剂量时，单独用药组小鼠体重较空白组小鼠显著降低，与SP联合用药后，小鼠的体重与空白组和模型组均无显著差异。如图2所示，CY20与SP联合用药后，小鼠的体重于给药后第6天开始出现回升趋势，最终与正常小鼠体重无明显差异。说明CY20mg/kg与SP联合用药对CY20mg/kg治疗过程中产生的小鼠体重降低现象有改善作用，且SP50mg/kg剂量组与SP100mg/kg剂量组作用效果接近。

如表1所示，当给予CY40mg/kg治疗后，小鼠的体重均显著下降且较CY20mg/kg剂量组降低明显。CY40mg/kg剂量分别与SP联合用药后，对小鼠的体重有一定改善，其中SP100mg/kg剂量组小鼠体重与模型组小鼠体重无显著性差异。如图2所示，CY40mg/kg剂量组以及CY40mg/kg与SP50mg/kg联合用药组小鼠的体重变化趋势基本一致，然而CY40mg/kg与SP100mg/kg联合用药组小鼠的体重在治疗9天后有一定的恢复趋势。说明CY40mg/kg剂量对小鼠体重产生明显的影响，SP100mg/kg的加入对小鼠的体重有一定的改善作用。

如表1所示，与CY40mg/kg剂量组类似，当给予CY80mg/kg治疗后，小鼠的体重均显著下降。联合用药后，对小鼠的体重有一定改善，但是改善效果不明显。如图2所示，CY80mg/kg剂量组以及CY80mg/kg与SP联合用药组小鼠的体重变化趋势基本一致，说明SP的加入基本上对CY80mg/kg造成的毒性作用无明显改善作用。

综上所述，CY长期用药对小鼠毒性作用显著，小鼠体重变化明显，当与SP联合用药后对小鼠的体重有一定改善，其中SP100mg/kg联合用药对小鼠体重有一定的改善作用。

3、联合用药对荷瘤小鼠脏器系数的作用

表2联合用药对荷瘤小鼠脏器系数的作用(n＝10-12)

*,与空白组比较,P<0.05；#,与模型组比较,P<0.05；

表2所示，经过详细分析，发现实验各组之间肝脏和肾脏指数基本无显著性的差异，说明环磷酰胺和脾多肽单独或者联合用药均未产生明显的肝脏和肾脏毒性。同时研究发现模型组小鼠接种肿瘤后，脾指数较空白组有一定程度的增加。经过分析发现，空白组小鼠的脾脏指数较文献报道的指数大，这可能是由于治疗 过程中连续尾静脉注射生理盐水进而诱发强烈的炎症反应而产生的^[22,23]。环磷酰胺的加入对胸腺指数影响显著，不同剂量脾多肽与环磷酰胺联合用药后对胸腺指数有一定程度上的改善。因此我们将详细讨论不同剂量药物治疗对小鼠脾脏和胸腺指数的作用。

表2中CY20mg/kg剂量组与CY20mg/kg和SP50mg/kg联合用药组脾指数接近，说明该剂量CY作用下SP50mg/kg的加入对脾指数的作用基本无影响。然而SP100mg/kg的加入则显著的降低了脾指数，缓解了脾脏肿胀现象。同时我们发现该剂量单独作用组和联合作用组的胸腺指数与空白组和模型组均无显著性差异。说明该剂量的环磷酰胺对小鼠的胸腺指数基本无影响，可能未产生明显的免疫抑制作用。

如表2，CY40mg/kg剂量组的脾脏指数与空白组和模型组脾脏指数较接近，然而当该剂量环磷酰胺与脾多肽联合用药后，脾脏指数显著减低。说明脾多肽的加入可能一定程度上缓解了炎症作用，进而减弱了脾脏的肿胀现象。该剂量各作用组均显著的降低了小鼠的胸腺指数，说明该剂量的环磷酰胺表现出一定的免疫抑制作用。然而脾多肽的加入并未对胸腺指数产生显著性的影响。

表2显示，CY80mg/kg剂量组单独用药以及与脾多肽联合用药组小鼠的脾脏指数均处于较高水平，脾多肽的加入未能缓解脾脏的肿胀现象。与此同时该剂量各组可能由于产生显著的免疫抑制现象，胸腺指数均显著降低。

4、联合用药对荷瘤小鼠白细胞数的作用

白细胞数变化趋势显示，模型组小鼠由于外源性肿瘤细胞的入侵，进而诱发白细胞数增加现象；CY单独长期用药产生一定的免疫抑制现象，随着CY剂量的增加，免疫抑制现象也随之增加(图3)。但是当CY 80mg/kg单独或者与SP联合长期用药，血液中的白细胞数显著增加，可能是由于高剂量环磷酰胺诱发了白血病。同时CY20mg/kg与CY40mg/kg单独用药白细胞数显著降低，但是随着脾多肽的加入，白细胞数均有一定程度上的升高，说明脾多肽可能对环磷酰胺产生的免疫抑制作用有一定的缓解作用。

5、联合用药对荷瘤小鼠肿瘤体积和重量的作用

表3联合用药对荷瘤小鼠肿瘤重量的作用(n＝10-12)

#P<0.05,与空白组比较.

随着CY剂量的增加，其抑制肿瘤生长的作用也随之增强，如表3所示，CY80mg/kg组以及该剂量与SP联合用药组肿瘤抑制率高达90％以上，基本上完全抑制了肿瘤的生长并杀死肿瘤细胞。同时CY20mg/kg、CY40mg/kg组以及与SP联合用药组也表现出良好的抑制肿瘤作用(抑制率大于50％)。我们详细分析了治疗过程中肿瘤体积的变化，从图4中可以发现，开始治疗第5天后，CY20mg/kg以及相关联合用药组，肿瘤体积变化趋势缓慢，然而CY40mg/kg与CY80mg/kg剂量以及相关联合用药组，肿瘤体积呈明显下降趋势。同时根据上述数据，我们可以发现随着CY剂量的增加，肿瘤抑制效果随之加强，但是SP与CY联合用药并未改善CY的肿瘤抑制作用。

6、联合用药对荷瘤小鼠血液中T细胞亚群比例的影响

表4联合用药对荷瘤小鼠血液中T细胞亚群比例的影响

*与空白组比较,P<0.05；#与模型组比较,P<0.05；

表4显示随着环磷酰胺剂量的增加血液中的CD3⁺细胞剂量依赖性增加。白细胞中20-40％为淋巴细胞，而CD3⁺可用于表征外周血中成熟T淋巴细胞的数量。因此说明可能由于高剂量的环磷酰胺长期用药一定程度上诱发了白血病，因此其中的CD3+细胞也随之增加。

CD4⁺为辅助性T细胞，参与细胞免疫和迟发型超敏反应性炎症的形成，在病原体感染中起重要作用；并能刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫密切相关。环磷酰胺单独用药组显著性的降低了血液中CD4⁺水平，仅CY20mg/kg与SP100mg/kg联合用药作用组一定显著的提高了血液中的CD4⁺水平。

CD8⁺是一种细胞毒性T细胞，其主要通过分泌穿孔素、细胞因子TNF等直接杀死靶细胞。表4中的数据分析后可知，CY80mg/kg及该剂量联合作用组，小 鼠血液中的CD8⁺水平显著减低，脾多肽的加入并未显著改善该作用，因此说明该剂量的环磷酰胺可能产生显著的免疫抑制作用，从而减弱了血液中的细胞免疫水平。

CD4⁺/CD8⁺比率的变化与机体免疫力水平密切相关。经过大量数据的整理分析，发现环磷酰胺的加入显著的降低了血液中的CD4⁺/CD8⁺比率，说明环磷酰胺长期用药将显著的降低机体的免疫力水平。当SP100mg/kg分别与CY三个不同剂量联合用药后，对CD4⁺/CD8⁺比率有一定程度的提高作用。说明脾多肽的加入对机体的免疫力水平有一定的改善作用。

7、联合用药对荷瘤小鼠肿瘤转录组的影响

利用illumina 2000分析，(RNAseq)分析测试方法，测试了各组动物的肿瘤组织中的总mRNA，对其进行了测序和含量分析。实验过程如下：

样品分组情况：

模型组；

CY40：环磷酰胺40mg/kg单独用药组；

CY80：环磷酰胺80mg/kg单独用药组；

CY40+SP100：环磷酰胺40mg/kg与脾多肽100mg/kg联合用药组；

CY80+SP100：环磷酰胺80mg/kg与脾多肽100mg/kg联合用药组；

实验方法：

将RNAseq原始数据进行筛选分析，分别对各组两两之间的数据进行分析比较，筛选出其中差异性较大的进行重点分析。然后将差异性较大的基因进行GO注释，根据作用功能进行分类，筛选出其中与癌症生长抑制、炎症反应、免疫调节等相关的基因。最后根据文献挖掘分析，筛选出关键蛋白。

实验结果分析：

表5各蛋白在不同组别中的表达量情况

上表中的数据均为RNAseq数据分析中各组之间产生显著变化(上升或者下 降)，且与肿瘤、炎症、免疫调节等关键词相关的蛋白。从表中数据可以看出，CY80单独治疗后，KLRK1、LCK蛋白的表达量均明显下降，说明产生免疫抑制作用，诱导上述与免疫相关的蛋白表达量的下降。与此同时，我们对CY80+SP100联合用药组的蛋白变化趋势与单独给药组CY80进行比较分析，说明当环磷酰胺(CY)与脾多肽注射液联合用药，在产生抗肿瘤效果的同时，脾多肽注射液改善机体免疫力，从而促进抗肿瘤效果，降低化疗药物毒性作用。

由以上结果意外地发现，脾多肽可以有效地改善环磷酰胺所致的因KLRK1、LCK蛋白的表达量下降所导致的免疫抑制。从而，发现了脾多肽在治疗因KLRK1、LCK蛋白的表达量下降所导致的免疫性疾病和肿瘤相关疾病的治疗。

附图说明

图1脾多肽(SP)与环磷酰胺(CY)对荷瘤小鼠生存率的作用(n＝10-12).

图2联合用药对荷瘤小鼠体重的作用(n＝10-12)*,与空白组比较,P<0.05；#,与模型组比较,P<0.05；

图3联合用药对荷瘤小鼠白细胞数的作用(n＝10-12).*P<0.05,与空白组比较；#P<0.05,与模新组比较(数据采集自给药后第19天)

图4联合用药对荷瘤小鼠肿瘤体积的作用(n＝10-12).(A)肿瘤体积；(B)肿瘤形态#P<0.05,与空白组比较,1:空白组,2:模型组,3:CY20组,4:CY40组,5:CY80组,6:CY20+SP50组,7:CY20+SP100组,8:CY40+SP50组,9:CY40+SP100组,10:CY80+SP50组,11:CY80+SP100组

具体实施方式

以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。

实施例1脾多肽改善环磷酰胺所致荷瘤小鼠免疫抑制作用

1.1实验动物模型

昆明种雄性小鼠220只，随机分为11组。每组20只小鼠，其中10只根据上述实验流程，于第19天处死，摘眼球取血备用，同时摘取胸腺、脾、肝脏、肾等组织器官，称量并计算脏器指数；其余10只从第19天开始停止给予CY，继续饲养测试其生存率变化曲线。上述小鼠分为：空白组，模型组，CY20，CY40，CY80，CY20+SP50，CY20+SP100，CY40+SP50，CY40+SP100，CY80+SP50，CY80+SP100。除空白组外各组于第0天于右侧腋下接种0.2mL密度为1×10⁷的S180细胞， 于第7天开始，每天腹腔注射0.1mL/10g药品。其中空白组注射生理盐水，CY各组分别给予20、40、80mg/kg环磷酰胺，CY+SP组在给予相应剂量的环磷酰胺同时给予50、100mg/kg脾多肽注射液。

1.2肿瘤体积、抑瘤率测试方法

实验过程中，每天观测小鼠肿瘤体积的大小，利用游标卡尺测试肿瘤的长和宽，计算出肿瘤的体积，并绘制日肿瘤体积变化曲线。实验结束后，摘取小鼠肿瘤，进行称重，并计算抑瘤率(In)。

肿瘤体积＝0.5×长×宽²

In＝(模型组肿瘤重量-给药组肿瘤重量)÷模型组肿瘤重量

1.3动物生存曲线测试方法

治疗过程中每天记录小鼠的存活情况，绘制小鼠的生存率变化曲线^[20]。

存活率＝(本组动物初始数量-本组动物现存数量)/本组动物初始数量。

1.4实验结果

实验结果见表1-表5和图1-图3，具体结论如下：

1)根据实验结果，发现环磷酰胺CY40mg/kg和CY80mg/kg剂量组在治疗过程中剂量依赖性的产生一定程度上的免疫抑制作用，显著的降低小鼠的胸腺指数，以及血液中的CD4⁺、CD8⁺、D4⁺/CD8⁺水平。

2)SP与CY联合用药基本不能改善CY对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。然而能一定程度上改善小鼠的免疫力水平，提高小鼠的生存时间和生存率。

3)通过转录组学分析，发现了脾多肽可以有效地改善环磷酰胺所致的因KLRK1、LCK蛋白的表达量下降所导致的免疫抑制 (见表5) 。

Claims (5)

1.脾多肽和环磷酰胺的复方药物组合物，其特征在于，所述组合物中两者配比为：脾多肽50-100重量份,环磷酰胺20-80重量份。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中两者配比为：脾多肽50重量份,环磷酰胺20重量份，或脾多肽50重量份,环磷酰胺40重量份，或脾多肽50重量份,环磷酰胺80重量份。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中两者配比为：脾多肽100重量份,环磷酰胺20重量份，或脾多肽100重量份,环磷酰胺40重量份，或脾多肽100重量份,环磷酰胺80重量份。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物必要时可以加入药物可接受的载体。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴丸剂。

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