CN106132438A - 与抗CTLA‑4抗体或抗PD‑1抗体组合的IL‑2Rβ选择性激动剂 - Google Patents

与抗CTLA‑4抗体或抗PD‑1抗体组合的IL‑2Rβ选择性激动剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及(除其他之外)一种方法，该方法包括向患有癌症的患者给予以下各项的步骤：(a)IL‑2Rβ活化量的一种长效IL‑2Rβ选择性激动剂；以及(b)CTLA‑4途径抑制量的一种抗CTLA‑4抗体或者PD‑1途径抑制量的一种抗PD‑1抗体。

Description

与抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体组合的IL-2Rβ选择性激动剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年10月29日提交的印度专利申请号3087/DEL/2014、以及于2014年2月21日提交的印度专利申请号499/DEL/2014的优先权权益，这些专利申请的披露内容通过引用以其全文结合在此。
领域
本发明涉及(除其他之外)癌症化学疗法的领域并且涉及通过向患有癌症的个体给予与另一种药理活性剂组合的一种长效IL-2Rαβ选择性激动剂来治疗该患者。
背景
白介素-2受体(IL-2R)是在某些免疫细胞(诸如淋巴细胞)的表面上表达的结合IL-2细胞因子并且对IL-2细胞因子有反应的异三聚体蛋白。该IL-2受体由3个亚基-IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ组成，其中IL-2Rα和IL-2Rβ各自具有对IL-2的结合亲和力，而单独IL-2Rγ不具有明显亲和力。泰兹(Thèze)等人(1994)当今免疫学(Immunol.Today)17(10):481-486。此外，当结合IL-2时对比单独任一链，IL-2Rαβ异二聚体具有更快的缔合速率和更慢的解离速率。利帕罗托(Liparoto)等人，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)12(5):316-321。
CD4+调控性T细胞(其负责抑制免疫应答)优先表达IL-2R的IL-2Rαβ形式。因此，给予为IL-2Rαβ的激动剂的化合物可以预期抑制免疫应答。
CD8+记忆T细胞(其负责增强免疫应答)优先表达IL-2R的IL-2Rβ形式。因此，给予为IL-2Rβ的激动剂的化合物可以预期增强免疫应答(通过例如增加CD8+记忆T细胞的增殖)。
因此，给予IL-2Rβ选择性激动剂将有益于患有某些癌症的患者，因为这样做预期降低调控性T细胞的免疫抑制作用，同时增加CD8+记忆T细胞，由此募集患者自身的免疫***来消除癌细胞。最佳地，这样一种IL-2Rβ选择性激动剂还将在给药之后展现出相对长的暴露，由此进一步提高患者对治疗的应答。
在癌症的治疗中经由给予IL-2Rβ选择性激动剂(其直接免疫活化)募集癌症患者的免疫***可以通过给予免疫抑制途径的拮抗剂(例如，CTLA-4和PD-1的拮抗剂)而进一步增强。
因此，本发明寻求通过例如向患有癌症的患者给予与免疫抑制途径的基于药理学的拮抗剂组合的IL-2Bβ选择性激动剂来解决(除其他之外)对于提供更有效的癌症治疗的持续需要。
本发明解决了本领域中的该需要以及其他需要。
发明内容
在本发明的一个或多个实施例中，提供一种方法，该方法包括向癌症患者给予以下各项的步骤：(a)IL-2Rβ活化量的一种长效IL-2Rβ选择性激动剂；以及(b)CTLA-4途径抑制量的一种抗CTLA-4抗体或PD-1途径抑制量的一种抗PD-1抗体。为清楚起见，关于根据该方法的步骤的顺序，除非另外指明，该方法不限于上述步骤顺序并且步骤(a)可以在执行步骤(b)之前、之后或同时执行。
本发明的另外实施例在以下说明和权利要求书中进行阐述。
附图简要说明
图1、图2和图3分别是与CT26肿瘤模型上与一种抗CTLA-4抗体组合的一种受体选择性长效IL-2激动剂的功效研究相关的平均肿瘤体积、相对肿瘤体积和体重的曲线图，该研究在实例2中进一步描述。
图4、图5和图6分别是与EMT6肿瘤模型上与一种抗CTLA-4抗体组合的一种受体选择性长效IL-2激动剂的功效研究相关的持续30天的平均肿瘤体积、持续106天的平均肿瘤体积和体重的曲线图，该研究在实例3中进一步描述。
图7和图8分别是与EMT6肿瘤模型上相较于与一种抗CTLA-4抗体组合的阿地白介素(Proleukin)，与一种抗CTLA-4抗体组合的一种受体选择性长效IL-2激动剂的功效研究相关的肿瘤体积和体重的曲线图，该研究在实例4中进一步描述。
图9和图10分别是与EMT6肿瘤模型上涉及与一种抗CTLA-4抗体组合的一种受体选择性、长效IL-2激动剂的流式细胞术分析的功效研究相关的持续11天的肿瘤体积和体重的曲线图，该研究在实例5中进一步描述。
图11和图12各自分别包括对应于在实例5中进一步描述的流式细胞术分析的免疫细胞群体的肿瘤和脾的图。
图13和图14分别是与CT26肿瘤模型上与一种抗PD-1抗体组合的一种受体选择性长效IL-2激动剂的功效研究相关的平均肿瘤体积和体重的曲线图，该研究在实例6中进一步描述。
图15示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究的I期之后的平均肿瘤体积和体重的两个曲线图。
图16示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究的I期之后的相对平均肿瘤体积和体重变化的两个曲线图。
图17示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究的II期之后的相对体重变化的一个曲线图。
图18示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究的II期之后的平均肿瘤体积和体重的两个曲线图。
图19示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究的III期之后的平均肿瘤体积的一个曲线图。
图20示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究的III期之后的体重变化和相对体重变化的两个曲线图。
图21示出在实例7中进一步描述的一个三阶段再激发研究过程中的平均肿瘤体积和个体肿瘤体积的两个曲线图。
图22示出与在实例8中进一步描述的RSLAIL-2和抗CTLA-4组合研究有关的从第0天到第11天的平均肿瘤体积和体重的两个曲线图。
图23示出与在实例8中进一步描述的RSLAIL-2和抗CTLA-4组合研究有关的从第0天到第11天的相对平均肿瘤体积和体重的两个曲线图。
图24示出与在实例8中进一步描述的RSLAIL-2和抗PD-1组合研究有关的从第0天到第11天的平均肿瘤体积和体重的两个曲线图。
图25示出与在实例8中进一步描述的RSLAIL-2和抗PD-1组合研究有关的从第0天到第11天的相对平均肿瘤体积和体重的两个曲线图。
详细说明
如在本说明书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。
在描述和要求本发明时，将依据以下所描述的定义使用以下术语。
“水溶性的、非肽聚合物”指的是一种聚合物，该聚合物在室温下在水中是至少35％(按重量计)可溶的，优选地大于70％(按重量计)、并且更优选地大于95％(按重量计)可溶的。典型地，一种“水溶性”聚合物的一种未过滤的水性制剂传输相同溶液在过滤后传输的光的量的至少75％(更优选至少95％)。然而，最优选的是该水溶性聚合物是至少95％(按重量计)可溶于水的或完全可溶于水的。关于为“非肽的”，一种聚合物当具有少于35％(按重量计)的氨基酸残基时是非肽的。
术语“单体”、“单体亚单元”和“单体单元”在此可互换使用并且指的是一种聚合物的基本结构单元之一。在均聚物的情况下，一个单一的重复结构单元形成该聚合物。在共聚物的情况下，两个或更多个结构单元重复出现--以一个模式或随机地--以形成该聚合物。与本发明相结合使用的优选的聚合物是均聚物。该水溶性的、非肽的聚合物包括一个或多个串联附接的单聚体以形成一个单聚体链。
如在此使用的“PEG“和“聚乙二醇”意指包括任何水溶性的聚(环氧乙烷)。除非另外指明，“PEG聚合物”或聚乙二醇是这样一种物质，其中基本上所有的(优选所有的)单体亚单元是环氧乙烷亚单元，但是，该聚合物可以包含不同的封端部分或官能团，例如用于共轭。用于在本发明中使用的PEG聚合物将包括两种以下结构之一：“(CH2CH2O)n-”或“-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-”，取决于末端的一个或多个氧是否被置换(例如在合成转化期间)。如上所述，对于这些PEG聚合物，该变量(n)的范围是从约3到4000，并且整个PEG的末端基团和架构可以变化。
关于一种聚合物的几何学或整体结构而言的“分支的”指的是具有从一个分支点伸出的两个或更多个聚合物“臂”的聚合物。
一个“生理学上可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键是与水在生理学条件下进行反应(即，被水解)的一个相对不稳定的键。键在水中水解的趋势可能不仅取决于在一个给定的分子之内连接两个原子的连接键的一般类型，而且取决于附接至这些原子上的取代基。适当的水解不稳定的或弱的连接键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽、寡核苷酸、硫酯以及碳酸酯。
“酶可降解的连接键”意指经受一种或多种酶降解的一个连接键。
一个“稳定的”连接键或键指的是在水中基本稳定的一个化学键，也就是说在生理条件下经一段延长的时间没有经受任何明显程度的水解。水解稳定的连接键的实例包括但不限于以下：碳碳键(例如在脂肪链中)、醚、酰胺、聚氨酯、胺等。大体上，一个稳定的连接键是在生理条件下展示小于约1％-2％的每日水解率的一个连接键。代表性的化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科书中发现。
“实质上”或“基本上”表示几乎全部的或完全的，例如一些给定的数量的95％或更大、更优选97％或更大、仍更优选98％或更大、甚至更优选99％或更大、还又更优选99.9％或更大，最优选99.99％或更大。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”指的是可以包含在本发明的组合物中的一种组分，对于患者该组分不会引起显著的不良毒理学效应。
术语“患者”指的是患有或易发可通过给予如在此所述的本发明的一种化合物来预防或治疗的病症的活生物体，并且包括人和动物两者。
如上文所指示，本发明涉及(除其他之外)一种方法，该方法包括向患有癌症的患者给予以下各项的步骤：(a)IL-2Rβ活化量的一种长效IL-2Rβ选择性激动剂；以及(b)CTLA-4途径抑制量的一种抗CTLA-4抗体或PD-1途径抑制量的一种抗PD-1抗体。关于给予步骤(a)和(b)，这些给予步骤可以按任一顺序(以及同时地)执行并且本发明不在此方面进行限制。在本发明的一个或多个实施例中，给予步骤(a)将在给予步骤(b)之前进行。在本发明的一个或多个实施例中，给予步骤(b)将在给予步骤(a)之前进行。在一个或多个实施例中，两个给予步骤(a)和(b)将同时进行。此外，在一个或多个实施例中，步骤(a)和/或(b)将重复给予。此外，在一个或多个实施例中，步骤(a)和(b)将仅进行一次。
在此描述的治疗方法可以持续长达监督患者的护理的临床医生认为该治疗方法有效的时间。指示该治疗方法有效的非限制性参数包括以下各项：肿瘤收缩(就重量和/或体积而言)；个体肿瘤集落数目的减少；肿瘤消除；以及无进展存活。
与根据所要求方法的治疗过程相关的示例性时间长度包括：约一周；两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年、以及约五年。
关于给予该长效IL-2Rβ选择性激动剂的频率，本领域普通技术人员将能够确定一个适当的频率。例如，临床医生可以决定相对不频繁地(例如，每两周一次)给予该长效IL-2Rβ选择性激动剂并且逐渐缩短如由患者耐受的给药之间的周期。关于给予该抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的频率，可以按类似的方式来确定这些药剂的频率。此外，因为一些长效IL-2Rβ选择性激动剂、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体处于高级临床测试中或可商购获得，所以还可能的是参考文献来获得一个适当的给药频率(记住鉴于治疗方案的组合作用，一些调整可能是必要的)。
在此描述的方法涉及给予长效IL-2Rβ选择性激动剂。在此方面，本发明不限于任何特定长效IL-2Rβ选择性激动剂，只要该激动剂展现出的对IL-2Rβ的体外结合亲和力比在相同体外模型中对IL-2Rαβ的结合亲和力大至少5倍(更优选地大至少10倍)，并且具有比IL-2大至少十倍的有效体内半衰期(基于IL-2的体内消失的半衰期)。作为举例，有可能测量针对IL-2的结合亲和力作为一种标准。在此方面，在本披露的实例1中提及的RSLAIL-2展现出相对于IL-2，对IL-2Rαβ的亲和力的约60倍降低；但是相对于IL-2，对IL-2Rβ的亲和力的仅约5倍降低。
在WO 2012/065086中描述了长效IL-2Rβ选择性激动剂的非限制性实例。一种示例性长效IL-2Rβ选择性激动剂是在本申请中的实例1中提及的RSLAIL-2。在此方面，RSLAIL-2是一种包含由以下化学式所涵盖的化合物的组合物：
其中IL-2是IL-2的一个残基，以及其药学上可接受的盐。在一个或多个实施例中，该组合物包含不超过10％(基于摩尔量)、优选地不超过5％(基于摩尔量)的由以下化学式所涵盖的化合物
其中IL-2是IL-2的一个残基，(n)是选自下组的一个整数，该组由以下各项组成：1、2、3、7和>7；以及其药学上可接受的盐。
在此描述的方法涉及给予一种抗CTLA-4抗体或一种抗PD-1抗体。关于抗CTLA-4抗体，这些是已知的并且包括曲美木单抗和伊匹单抗。关于抗PD-1抗体，这些是已知的并且包括尼沃鲁单抗(nivolumab)和兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)、AMP-224、MDPL3280A、MEDI4736、以及MSB0010718C。
用于确定一种给定的化合物是否可以充当一种抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体的测定可以由本领域的普通技术人员通过常规实验来确定。
根据在此描述的方法，该长效IL-2Rβ选择性激动剂以IL-2Rβ活化量给予至患者。本领域的普通技术人员可以确定多少给定长效IL-2Rβ选择性激动剂足以提供IL-2Rβ处的临床相关的激动活性。例如，本领域的普通技术人员可以参考文献和/或给予一系列增加量的该长效IL-2Rβ选择性激动剂并且确定哪个或哪些量提供IL-2Rβ的临床激动活性。
然而，在一个或多个实例中，该IL-2Rβ活化量是由以下范围中的一个或多个所涵盖的一个量：从约0.01mg/kg至1mg/kg；从约0.01mg/kg至约0.1mg/kg；从约1mg/kg至约1000mg/kg；从约2mg/kg至约900mg/kg；从约3mg/kg至约800mg/kg；从约4mg/kg至约700mg/kg；从约5mg/kg至约600mg/kg；从约6mg/kg至约550mg/kg；从约7mg/kg至约500mg/kg；从约8mg/kg至约450mg/kg；从约9mg/kg至约400mg/kg；从约5mg/kg至约200mg/kg；从约2mg/kg至约150mg/kg；从约5mg/kg至约100mg/kg；从约10mg/kg至约100mg/kg；以及从约10mg/kg至约60mg/kg。
根据在此描述的方法，给予CTLA-4途径抑制量的一种抗CTLA-4抗体或者给予PD-1途径抑制量的一种抗PD-1抗体。本领域的普通技术人员可以确定多少给定抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体分别足以提供CTLA-4途径或PD-1途径的临床相关抑制。例如，本领域的普通技术人员可以参考文献和/或给予一系列增加量的该抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体并且确定哪个或哪些量提供CTLA-4途径或PD-1途径的临床相关抑制。
然而，在一个或多个实例中，这些CTLA-4和PD-1途径抑制量是由以下范围中的一个或多个所涵盖的一个量：从约1mg/kg至约1000mg/kg；从约2mg/kg至约900mg/kg；从约3mg/kg至约800mg/kg；从约4mg/kg至约700mg/kg；从约5mg/kg至约600mg/kg；从约6mg/kg至约550mg/kg；从约7mg/kg至约500mg/kg；从约8mg/kg至约450mg/kg；从约9mg/kg至约400mg/kg；从约5mg/kg至约200mg/kg；从约2mg/kg至约150mg/kg；从约5mg/kg至约100mg/kg；从约10mg/kg至约100mg/kg；以及从约10mg/kg至约60mg/kg。
为了确认，如分别在此关于该抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体的CTLA-4和PD-1途径抑制量所使用的，该抑制的量和程度可以广泛变化并且这些中的任一个与该长效IL-2Rβ选择性激动剂的组合仍可以是有效的。例如，仅分别最低限度地抑制该CTLA-4或PD-1途径的抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体的量仍然可以是如在此使用的抑制量，只要所要求发明的方法产生一种临床上有意义的应答。因此，一种长效IL-2Rβ选择性激动剂的仅展现IL-2Rβ处的最小激动活性持续一段足够延长的时间段的一个量仍然可以是一种长效IL-2Rβ选择性激动剂，只要所要求发明的方法产生一种临床上有意义的应答。在一些实例中，由于(例如)协同应答，可能仅在存在该长效IL-2Rβ选择性激动剂的情况下需要该CTLA-4或PD-1途径的最小抑制。在仍然其他实例中，由于(例如)协同应答，可能在存在CTLA-4和PD-1途径抑制的情况下需要IL-2Rβ的最小激动活性。
待给予的实际剂量将取决于受试者的年龄、重量以及一般状况，连同有待治疗的病症的严重程度，健康专家的判断、以及有待给予的共轭物而改变。
本发明提供一种方法，该方法对于(除其他之外)治疗患有一种病症的患者是有用的，该病症对用该化合物治疗有应答。例如，患者可以对单独以及组合的单个药剂有应答，但是对组合的应答更强。作为进一步举例，患者可能对单个药剂中的一种无应答，但是对组合有应答。作为仍然进一步举例，患者可能对单独的单个药剂中的任一种无应答，但是对组合有应答。
该方法包括经由注射给予治疗有效量的多种活性剂。还考虑了其他给药方式，诸如经肺、经鼻、经颊、经直肠、经舌下、以及经皮给药。如在此所使用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、腹腔内、心脏内、鞘内、以及肌内注射，连同输注注射。该方法的每种药理学组分可以分开给予。可替代地，如果希望同时给予两种药理学组分--并且这两种药理学组分是一起且在一种给定配制品中相容的--那么该同时给予可以经由给予单一剂型/配制品(例如，静脉内给予包含两种药理活性剂的一种静脉内配制品)来实现。本领域的普通技术人员可以通过常规测试确定两种给定药理学组分是否一起且在一种给定配制品中相容。
当前描述的方法可以用来治疗患有可以通过该方法补救或预防的任何病症的患者。示例性的病症是癌症，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、***、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、以及白血病。
在此引用的所有文章、书籍、专利、专利公开及其他的公开物通过引用以其全部内容结合。倘若本说明书的传授内容和通过引用结合的本领域之间不一致，以本说明书中的传授内容和定义的含义为准(特别是关于在此处所附的权利要求书中使用的术语)。例如，其中本申请和通过引用结合的公开物不同地定义了相同术语，该术语的定义将保留在该定义所位于的文件的传授内容之内。
实验
应当理解的是虽然本发明已结合某些优选的和具体的实施例进行了描述，但前述的描述以及以下的实例旨在说明而非限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对本发明所属领域的技术人员来说将是显而易见的。
在实例2-实例7中提及的抗CTLA-4抗体对应于从UC10-4F10-11杂交瘤细胞系(ATCC)纯化的抗小鼠CLTA-4抗体。将细胞在PFHM-II培养基(英杰公司(Invitrogen))中维持在1×105与1×106个细胞/mL的密度之间。在纯化之前，将该培养基离心以便除去这些细胞。用NaOH将该培养基的pH调节至8，并且通过用水稀释将其传导率降低至7mS/cm。将该pH/传导率调节的培养基负载到一个Q-FF柱上，并且使用NaCl梯度来洗脱该抗小鼠CLTA-4抗体。
抗CTLA-4对其抗原的亲和力是通过表面等离子体共振(Biacore)来测定的并且被测定为20pM。
抗PD-1购自BioXcell。它是作为具有以下特征的一种溶液获得的：浓度：4.76mg/mL；内毒素：<0.63EU/mg；配制：PBS pH 7；纯度：>95％；同种型：大鼠IgG2a；以及消光系数：1.33。抗PD-1对其抗原的亲和力是通过表面等离子体共振(Biacore)来测量的并且据发现为1nM。将所购买的抗体通过SDS-PAGE和SEC-HPLC针对纯度进行检查并且被确定为纯度足以用于功效研究而无需进一步处理(workup)。
实例1
用mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS进行的rIL-2的聚乙二醇化
用mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS进行的rIL-2的聚乙二醇化先前在WO2012/065085的实例2中进行了报道。其中，合成被报道为产生4聚体、3聚体、2聚体和1聚体的混合物。然而，对该反应的进一步分析揭示，还产生更高的附接程度(例如，5聚体、6聚体和7聚体)。本合成表示用于使用mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS聚乙二醇化IL-2的一种按比例扩大的方法。
将1.44mg/ml的纯化的rIL-2(106.4mL)装入一个第一容器中，接着添加53.6mL的配制缓冲液(10mM乙酸钠(pH 4.5)，5％海藻糖)。测量pH为4.62，测量温度为21.2℃。将PEG试剂C2-PEG2-FMOC-NHS-20K(如在WO 2006/138572中所描述可供使用的)(13.1g)装入一个第二容器中，接着添加73.3mL的2mM HCl。将所得溶液手动涡旋25分钟。将硼酸钠(0.5M，pH9.8)添加至该第一容器以便使PH升高至约9.1，并且接着将含有该PEG试剂的第二容器经1至2分钟添加至该第一容器。接着通过将8.1mL的2mM HCl装入该第二容器并且添加至该第一容器来执行一个冲洗步骤。在共轭反应中，最终rIL-2浓度是0.6mg/mL，硼酸钠浓度是120mM，PH是9.1+/-0.2，温度是20℃-22℃，并且PEG试剂与rIL-2的摩尔比在针对该试剂的活性调整之后(取代水平)是35:1。使该共轭反应进行30分钟并且接着使用75mL的2N乙酸(其中PH下降至4.01)用一种酸化反应终止。将该反应的产物用水稀释并且使用一个0.2微米过滤器过滤所稀释的聚乙二醇化的rIL-2溶液并且将所过滤的产物放置于无菌容器中。
其后，通过将稀释的聚乙二醇化的rIL-2溶液负载到填充有SP琼脂糖凝胶FF树脂(通用电气医疗集团(GE Healthcare))的一个色谱柱上来纯化该溶液。在一个洗涤步骤之后，使用一种氯化钠梯度来洗脱该聚乙二醇化的rIL-2。消除含有1聚体、2聚体或3聚体的级分，同时合并含有4聚体、5聚体、6聚体、7聚体和任何更高程度的聚乙二醇化的级分，由此产生主要具有4聚体、5聚体和6聚体的一种组合物(其中8聚体和更高程度的聚乙二醇化据发现在与色谱法相关的一个洗涤步骤期间被去除)。该组合物是与实例2-实例6结合使用的组合物并且在其中被称为“RSLAIL-2”。
使用在该实例中描述的方法，4聚体、5聚体和6聚体的产率据发现增加(其中1聚体、2聚体和3聚体伴随减少)。
实例2
评估与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2在雌性BALB/c小鼠中的CT26肿瘤模型上的功效
该研究的目标是评估与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2在雌性BALB/c小鼠中的CT26鼠结肠癌肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
存在5个组，其中每组12只动物。包括在第0天、第4天、第9天和第14天治疗的一个媒介物对照组，两个单一药剂组(在第0天、第4天、第9天、第14天和第18天抗CTLA-4抗体治疗或者在第0天和第9天RSLAIL-2治疗)和两个组合免疫治疗组(抗CTLA-4抗体加RSLAIL-2)，其中对于一个组抗CTLA-4抗体(在第0天、第4天、第9天、第14天和第18天给予)治疗与RSLAIL-2(在第0天、第4天和第9天给予)同时开始，并且对于另一个组在RSLAIL-2治疗开始(在第4天、第13天和第22天给予)之前4天开始。在以2×106个细胞/部位以0.1mL注射体积接种CT26细胞之后7天进行该研究的治疗开始。将肿瘤细胞皮下注射在腹部区域中。将这些动物基于由软件生成的随机化相应地分配。在治疗日(第0天)的平均肿瘤体积在从111±9mm3至115±10mm3(平均值±SEM)的范围内。
肿瘤体积(mm3)和体重(克)一周监测2至3次并且分别呈现在图1和图2中，连同关于治疗方案的细节。相应的相对肿瘤值(在该研究开始时针对个体肿瘤体积计算并且呈现为生长百分比的标准化值)总结于图1中(第0天至第30天)。持续106天监测无肿瘤动物的肿瘤再生长并且自治疗开始取得体重。
在第11天(媒介物对照动物存在的最后一天)通过单向方差分析(One-way ANOVA)与杜凯氏后检验(Tukey's post-test)(用于Windows的GraphPad Prism 6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行的媒介物对照动物与治疗的动物之间的肿瘤体积的比较显示所有治疗组与该媒介物对照组显著不同。
在第11天(对照动物存在的最后一天)通过使用以下公式评定平均肿瘤生长抑制(％TGI)：
％TGI＝(1-(相对肿瘤体积(％)治疗组÷相对肿瘤体积(％)对照组)×100
对于抗CTLA-4抗体(第2组)治疗的肿瘤存在53％平均抑制，并且对于RSLAIL-2组(第3组)存在58％平均抑制。组合免疫治疗共同给予(在第0天同时开始的RSLAIL-2和抗CTLA-4抗体)产生74％抑制。使用在第0天开始的抗CTLA-4抗体和在4天开始的RSLAIL-2治疗的组合免疫治疗(第5组)产生这些治疗之中的最大抑制(88％)。
第4组中12只动物中的一只(1/12)到第14天是无肿瘤的。到第28天总计4只动物是无肿瘤的。在第5组中，到第14天两只(2/12)动物是无肿瘤的并且到第25天总计8只动物是无肿瘤的。参见表1。来自第4组和第5组的所有这些动物保持无肿瘤直到研究终止。(从治疗开始106天)。
表1
肿瘤体积(平均值±SEM，mm3)
1该组(包括该动物)在第18天共同从该研究中去除。
在治疗日平均体重在从17.4±0.3g至18.2±0.3g(平均值±SEM)的范围内。未观察到来自任何治疗组的在治疗阶段期间低于基线的显著平均体重损失(图3)。
实例3
评估与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2在雌性BALB/c小鼠中的EMT6肿瘤模型上的功效
该研究的目标是评估与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2在雌性BALB/c小鼠中的EMT6鼠乳腺癌肿瘤模型上的抗肿瘤活性。
存在5个组，其中每组各自12只动物。包括在第0天、第4天、第9天和第14天治疗的一个媒介物对照组，两个单一药剂组(在第0天、第4天、第9天、第14天和第18天抗CTLA-4抗体治疗或者在第0天和第9天RSLAIL-2治疗)和两个组合免疫治疗组(抗CTLA-4抗体加RSLAIL-2)，其中对于一个组抗CTLA-4抗体(在第0天、第4天、第9天、第14天和第18天给予)治疗与RSLAIL-2(在第0天、第4天和第9天给予)同时开始，并且对于另一个组在RSLAIL-2治疗开始(在第4天、第13天和第22天给予)之前4天开始。在以2×106个细胞/部位以0.1mL注射体积接种EMT6细胞之后7天进行该研究的治疗开始。将肿瘤细胞皮下注射在腹部区域中。将这些动物基于由软件生成的随机化相应地分配。在治疗日(第0天)的平均肿瘤体积在从144±8mm3至147±10mm3(平均值±SEM)的范围内。
肿瘤体积(mm3)和体重(克)一周监测2至3次，并且肿瘤体积数据呈现在图4中(第0天至第30天)，连同关于治疗方案的细节。从治疗开始持续106天监测无肿瘤动物的肿瘤生长，这呈现于图5中。
在第18天(媒介物对照动物存在的最后一天)通过单向方差分析与杜凯氏后检验(用于Windows的GraphPad Prism 6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行的媒介物对照动物与治疗的动物之间的肿瘤体积的比较显示这些媒介物对照(第1组)对比第2组(抗CTLA-4抗体治疗)与第5组(在第0天开始的抗CTLA-4抗体+在第4天开始的RSLAIL-2)之间的显著差异。在第1组(媒介物对照)对比第3组(单独RSLAIL-2)与第4组(RSLAIL-2+抗CTLA-4抗体，两种治疗均在第0天开始)之间未注意到统计差异。
在第18天(对照动物存在的最后一天)通过使用以下公式评定平均肿瘤生长抑制(％TGI)：
％TGI＝(1-(相对肿瘤体积(％)治疗组÷相对肿瘤体积(％)对照组)×100
对于抗CTLA-4抗体(第2组)治疗的肿瘤存在55％平均抑制，并且对于RSLAIL-2组(第3组)存在22％平均抑制。组合免疫治疗共同给予(在第0天同时开始的RSLAIL-2和抗CTLA-4抗体)产生27％抑制。使用在第0天开始的抗CTLA-4抗体和在4天开始的RSLAIL-2治疗的组合免疫治疗(第5组)产生这些治疗之中的最大抑制(92％)。该媒介物对照组中的一只动物上的肿瘤据观察到第11天完全自消退。尽管如此，当该组共同从该研究去除时，到第18天平均肿瘤体积是1789mm3±196(平均值±SE，N＝12)。第4组中12只动物中的一只到第18天也是无肿瘤的。当该整个组从该研究中去除时(第18天)，该组的剩余部分的平均肿瘤体积是1361±214mm3。
第5组中12只动物的五只(5/12)到第14天是无肿瘤的。到第18天总计10只动物是无肿瘤的。所有10只动物保持无肿瘤直到研究终止(从治疗开始106天)。参见表2。
表2
肿瘤体积(平均值±SE，mm3)
1该组(包括该动物)在第18天共同从该研究中去除。
在治疗日平均体重在从17.8±0.3g至18.4±0.4g(平均值±SEM)的范围内(图6)。未观察到来自任何治疗组的显著体重损失。
实例4
评估与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2相较于阿地白介素与抗CTLA-4抗体治疗在雌性 BALB/c小鼠中的EMT6肿瘤模型上的功效
该研究的目标是评估与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2在雌性BALB/c小鼠中的EMT6鼠乳腺癌肿瘤模型上的抗肿瘤活性并且将其与阿地白介素的抗肿瘤活性进行比较。
存在7个组，其中每组10只动物。包括在第0天、第4天、第8天和第13天给予的抗体对照(第1组)以及三个单一药剂组。存在在第0天、第4天、第8天、第13天和第18天给予的抗CTLA-4抗体(第2组)。阿地白介素(第3组)从第0天至第4天给予，接着从第7天至第11天给予，并且一种RSLAIL-2(第4组)在第0天和第9天给予。还包括三个组合免疫治疗组。使用抗CTLA-4抗体与阿地白介素的一个组合免疫治疗组(第5组)以及使用抗CTLA-4抗体与RSLAIL-2的根据不同治疗方案的2个组合治疗组(第6组和第7组)。对于第6组，抗CTLA-4抗体方案在第4天开始并且在第9天和第13天再次给予，而RSLAIL-2在第0天开始并且在第9天再次给予。对于第7组，抗CTLA-4抗体治疗在第0天开始并且在第4天、第8天和第13天再次给予，而RSLAIL-2在第4天开始并且在第13天和第22天再次给予。治疗开始(第0天)被指定为在小鼠上以2×106个细胞/部位以0.1mL注射体积接种EMT6细胞之后7天。将肿瘤细胞皮下注射在腹部区域中。将这些动物在第0天基于由软件生成的随机化相应地分配。在治疗日的平均肿瘤体积在从159±7mm3至170±8mm3(平均值±SE)的范围内。
肿瘤体积(mm3)和体重(克)一周监测2至3次并且分别呈现在图7和图8中(第0天至第28天)。(从治疗开始)持续99天监测无肿瘤动物的再生长和健康状况。
在第18天(媒介物对照动物存在的最后一天)通过单向方差分析与杜凯氏后检验(用于Windows的GraphPad Prism 6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行的对照动物与治疗的动物之间的肿瘤体积的比较显示仅第5组(抗CTLA-4抗体+阿地白介素)和第7组(抗CTLA-4抗体+RSLAIL-2)与对照的肿瘤体积显著不同。然而，尽管与对照显著不同，但是这两个治疗组的平均肿瘤体积彼此并不显著不同。
在第18天(对照动物存在的最后一天)通过使用以下公式评定平均肿瘤生长抑制(％TGI)：
％TGI＝(1-(相对肿瘤体积(％)治疗组÷相对肿瘤体积(％)对照组)×100
对于单独抗CTLA-4抗体治疗(第2组)存在27％平均抑制。通过阿地白介素(第3组)肿瘤生长的抑制是24％，并且通过RSLAIL-2(第4组)肿瘤生长的抑制是5％，使用抗CTLA-4抗体和阿地白介素的组合免疫治疗(第5组)产生26％抑制，RSLAIL-2与抗CTLA-4抗体治疗(第6组)得到2％抑制，而第7组(抗CTLA-4抗体与RSLAIL-2)产生94％抑制。
若干动物据观察到第18天是无肿瘤的。存在来自第5组的三个(3/10)，来自第6组的1个(1/10)以及第7组中的5个(5/10)。到研究终止(第99天)，来自第5组、第6组和第7组的无肿瘤动物的总数分别是4/10、1/10和7/10。参见表3。
表3
肿瘤体积(平均值±SE，mm3)
实例5
在雌性BALB/c小鼠中的EMT6肿瘤模型上测试与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2的功效 研究(在第0天、第3天和第11天收集样品用于流式细胞术分析)
先前的组合RSLAIL-2和抗CTLA-4抗体功效研究表明在该EMT6小鼠乳腺模型中的协同作用。该研究的目标是评估/评定与抗CTLA-4抗体组合的RSLAIL-2在雌性BALB/c小鼠中的EMT6鼠乳腺癌肿瘤模型上的抗肿瘤活性。此外，为了鉴别负责组合功效的免疫群体，在治疗开始之后的第0天、第3天和第11天收集和加工组织(肿瘤和脾)。通过流式细胞术分析评估浸润这些组织的免疫细胞的鉴别和定量。将这些结果在治疗组之间进行比较。
体内阶段
在此研究中存在6个治疗组，其中每组3-10只动物。包括在第0天、第4天和第8天以100ug/小鼠给予的抗体对照IgG2a(第1组)；在第4天和第8天以100ug/小鼠给予的抗CTLA-4抗体治疗(第2组)；在第4天至第8天以0.5mg/kg给予的阿地白介素治疗(第3组)；以及在第4天以0.8mg/kg单次给药给予的RSLAIL-2治疗(第5组)。还包括待用抗CTLA-4抗体(100ug/小鼠，在第0天、第4天和第8天给予)与阿地白介素(0.5mg/kg，在第4天至第8天给予)的组合(第4组)或与RSLAIL-2(0.8mg/kg，在第4天给予)的组合(第6组)治疗的三个组。
在将这些动物在腹部区域中皮下接种2×106个细胞/部位的EMT6鼠乳腺癌细胞(0.1mL)之后7天开始治疗。将这些小鼠根据肿瘤体积分配至治疗组中。
在第0天(首次接受试验的对照)、第3天(第1组和第6组)杀死这些动物并且收集组织(肿瘤和脾)，第3天第6组动物在此时已经用仅抗CTLA-4抗体给药，添加RSLAIL-2在第4天开始添加，还在治疗开始之后的第11天取得样品(所有组)。针对每个收集日选择三只动物。所选择的这些动物具有完整肿瘤(未坏死)和最接近该天的该组平均肿瘤体积的体积。
在治疗第0天，对于首次接受试验的组，平均肿瘤体积是164±10mm3。在第3天，对于第1组和第6组，平均肿瘤体积分别是282±7mm3和333±26mm3(平均值±SEM)。在第11天，对于第1组，平均肿瘤体积是843±138mm3；对于第2组，平均肿瘤体积是1059±135mm3；对于第3组，平均肿瘤体积是814±70mm3；对于第4组，平均肿瘤体积是832±262mm3；对于第5组，平均肿瘤体积是620±103mm3；并且对于第6组，平均肿瘤体积是255±11mm3(平均值±SEM)。参见图9。
至少一周一次对动物进行称重。在治疗日(第0天)，对于第1组、第2组、第3组、第4组、第5组和第6组，平均体重分别是18.9±0.3克、18.6±0.3克、19.2±0.2克、18.7±0.2克、17.8±0.3克、18.9±0.3克。在第3天，对于第1组和第6组，平均体重分别是19.1±0.7克和19±0.3克。对于第1组、第2组、第3组、第4组、第5组和第6组，第11天的平均体重分别是19.8±0.2克、19.4±0.2克、19.9±0.2克、20±0.5克、19.6±0.4克和19.5±0.4克(平均值±SEM)。参见图10。
离体阶段
将收集的组织样品使用解剖刀手动切碎，接着在37℃下孵育的13分钟酶消化。消化缓冲液的组分是于PBS/BSA中的2.5mg/ml II型胶原酶(GIBCO BRL)、2.5mg/ml IV型胶原酶(GIBCO BRL)、以及0.5mg/mlDNA酶(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))。在孵育之后，将该消化通过添加含有10％FBS(热灭活的；GIBCO BRL)的维莫斯氏(Waymouth's)MB(GIBCOBRL)淬灭并且通过一个70-uM尼龙过滤器(Falcon)过滤，从而产生一种单细胞悬浮液。将这些细胞在HBSS中洗涤并且离心，接着再悬浮于新鲜HBSS中。从每个样品取得一个等分试样用于计数，接着用eFlour-450存活力染料染色。然后将这些样品接种于一个96孔深孔板中，染色并且收集用于流式细胞术分析。
将这些肿瘤和脾细胞样品首先用一种可固定的存活力指示剂处理，并且接着针对活免疫细胞、CD3、CD4、CD8、CD25、CD44、CD122、Foxp3(内部染色)、DX5、以及NKp46表面抗原进行染色。
活免疫细胞的总量针对这些样品(每个治疗组3个)中的每个进行计数并且用于门控/收集针对CD4+、TREG+细胞、CD8+、记忆效应CD8+细胞、总NK细胞、成熟NK细胞(其被标准化至1立方毫米的肿瘤组织)的总事件以及针对这些治疗组中的每个的脾的总细胞计数。原始计数源自流式细胞仪读数的总结的原始数据并且使用FlowJo进行分析。
流式细胞术
将三只首次接受试验的动物在第0天杀死。在第3天将来自第1组(已接受同种型对照)和来自第6组(已接受仅抗CTLA-4抗体治疗)的三只动物杀死，并且在治疗开始之后的第11天将来自所有第1组-第6组的三只动物杀死。
数据的图形表示可以在图11和图12中找到，图11和图12分别针对肿瘤和脾中的第11天。
当用单独抗CTLA-4抗体治疗时，CD4+或调控性T细胞群体(从第3天-第11天)中不存在差异。用抗CTLA-4抗体预先治疗、接着用阿地白介素或RSLAIL-2治疗增加CD4+群体；然而，在调控性T细胞群体(抗CTLA-4抗体对比抗CTLA-4抗体+RSLAIL-2或阿地白介素)中不存在差异。RSLAIL-2+抗CTLA-4抗体对比单独RSLAIL-2中在CD4+细胞方面不存在差异；然而，当与RSLAIL-2相比较时，RSLAIL-2+抗CTLA-4抗体减少调控性T细胞群体。在该RSLAIL-2+抗CTLA-4抗体组中存在没有计算在内的较大CD4+细胞群体；这些结果表明这些细胞中的大多数不是Treg。
用抗CTLA-4抗体预先治疗、接着RSLAIL-2治疗显著增加CD8+群体(P＝0.0078)和记忆效应CD8细胞(P＝0.0058)。(双尾t检验抗CTLA-4抗体+RSLAIL-2对比抗CTLA-4)。此外，当与单独RSLAIL-2相比较时，RSLAIL-2+抗CTLA-4抗体显著增加CD8+和记忆效应CD8细胞。
单独抗CTLA-4抗体对总NK细胞群体不具有趋势作用；然而，成熟NK细胞被显著减少(从第3天至第11天，P＝0.0278)。用抗CTLA-4抗体预先治疗、接着RSLAIL-2治疗增加总NK群体和成熟NK细胞群体。当与RSLAIL-2组相比较时，在RSLAIL-2+抗CTLA-4抗体组中在成熟NK细胞方面没有差异。
实例6
使用RSLAIL-2和抗PD-1抗体的组合免疫治疗对雌性BALB/c小鼠中的CT26鼠结肠癌肿 瘤生长的功效
该研究的目标是评估使用RSLAIL-2和抗PD-1抗体的组合免疫治疗在雌性BALB/c小鼠中的CT26鼠结肠癌肿瘤模型上的抗肿瘤活性。
存在4个组，其中每组10只动物。包括一个媒介物对照组(第1组)、一个抗PD-1抗体治疗组、一个RSLAIL-2治疗组(第3组)以及首先在天用抗PD-1抗体(200ug)治疗并在4天后用RSLAIL-2(0.8mg/kg)治疗的一个组合治疗组。将0.1mL注射体积的2×106个细胞/部位的CT26细胞在小鼠上皮下植入腹部区域中。在肿瘤细胞接种(第0天)之后七天开始治疗。将这些动物在第0天基于由软件生成的随机化相应地分配。在治疗日(第0天)的平均肿瘤体积在从123±5mm3至127±6mm3(平均值±SE)的范围内。
肿瘤体积(mm3)和体重(克)一周监测2至3次并且分别呈现在图13和图14中。监测该研究持续16天。
在第12天(媒介物对照动物存在的最后一天)通过单向方差分析与杜凯氏后检验(用于Windows的GraphPad Prism 6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行的对照动物与治疗的动物之间的肿瘤体积的比较显示所有治疗组的肿瘤体积与未治疗对照的肿瘤体积显著不同。
使用以下公式计算肿瘤生长抑制百分比(％TGI)：
％TGI＝(1-(相对肿瘤体积(％)治疗组÷相对肿瘤体积(％)对照组)×100
存在分别在抗PD-1抗体(第2组)和RSLAIL-2(第3组)情况下观察到的55％和58％平均肿瘤生长抑制。组合给予两种治疗的组(第4组)的肿瘤生长抑制据观察为83％。在研究终止时第4组中的五只(5/10)动物具有体积小于其在第0天的初始体积的肿瘤。
将平均肿瘤体积成四倍时间(TVQT)(肿瘤生长至其初始体积的4倍所花的时间(天))使用非线性二阶多项式分析(用于Windows的GraphPad Prism 6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行内插以便评定肿瘤生长延迟(TGD)。平均肿瘤体积成四倍时间对于对照肿瘤是5.2天，对于第3组(抗PD-1抗体)是7.6天，对于第3组(RSLAIL-2)是8.2天并且对于组合免疫治疗组(第4组)是15.6天。对于第2组、第3组和第4组，平均肿瘤生长延迟分别是2.4天、3.0天和10.4天。参见表4。
表4
肿瘤体积(平均值±SE，mm3)
在第0天平均体重在从17.5±0.2g至18.1±0.2g(平均值±SEM)的范围内(图13)。未观察到显著体重损失(图14)，除了第2组中的一只动物，该动物在第12天从该研究中去除。尸体剖检揭示肺空洞中的转移性病灶。
与使用任一单一药剂治疗的那些动物相比，在给予抗PD-1与RSLAIL-2的组合的动物中观察到更大的肿瘤生长抑制(TGI)和肿瘤生长延迟(TGD)。
实例7
再激发研究：在使用RSLAIL-2和抗CTLA-4的有效组合免疫治疗之后用EMT6鼠乳腺癌肿 瘤再激发无肿瘤动物
该实例的目标是评估在用使用RSLAIL-2和一种可商购的啮齿动物抗CTLA-4检查点阻断抗体的组合免疫疗法治疗植入有EMT6乳腺癌肿瘤的小鼠时的功效的程度和持续时间。如先前在实例2-实例6中所展示，该组合产生显著无肿瘤动物，并且通过用EMT6肿瘤细胞或CT26肿瘤细胞再激发无肿瘤动物，对该组合引发肿瘤特异性应答的能力进行评估。
该再激发研究以三个阶段进行。
该研究的初始部分(“I期”)使用携带EMT6(鼠乳腺癌)肿瘤的80只雌性BALB/c小鼠。随机选择十只(10/80)动物并且分配至抗体对照组(在第0天、第4天、第9天、第13天100μg，腹膜内)。将这些动物的剩余部分(70/80)用抗CTLA-4(腹膜内)(在第0天、第4天、第9天、第13天和第18天100μg)和RSLAIL-2(静脉内)(在第4天、第13天和第22天0.8mg/kg)的组合进行治疗。
治疗开始(第0天)被指定为将EMT6细胞以2×106个细胞/部位、以0.1mL注射体积皮下注射接种于腹部区域之后7天。对于该媒介物对照和治疗组，治疗开始时的平均肿瘤体积分别是206±15和222±8(平均值±SE)。
监测I期直到第48天。肿瘤体积(mm3)和体重(克)一周测量2至3次并且呈现在图15中。相应的相对肿瘤体积(在该研究开始时(第0天)针对个体肿瘤体积计算并且呈现为生长百分比的标准化值)和体重的相对变化总结于图16中。
来自该研究的I期的这些结果显示73％(P<0.0001)的肿瘤生长抑制(TGI)，这是使用在第14天(所有对照动物存在的最后一天)对照动物(698％)与治疗的动物(189％)之间的平均相对肿瘤体积计算的并且然后使用未配对t检验与Welches校正因子(用于Windows的GraphPad Prism 6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行比较的。
I期中未展现出对该组合免疫治疗的完全应答的这些动物(N＝39)的平均肿瘤生长延迟(TGD)是12.7天(P<0.0001)。通过利用二阶多项式非线性回归分析(GraphPadPrism)使用达到400％生长的内插的个体肿瘤时间来计算肿瘤体积成四倍时间(TVQT)。无肿瘤动物(完全应答者)不包括在针对TGD的评定中。
在I期中，在第一次和第二次RSLAIL-2给药之后大约5天，观察到所治疗的动物皮毛粗糙(轻微)。在第三次给药之后未观察到皮毛粗糙。未观察到显著体重损失(图16)。
来自该研究的I期的这些结果的总结提供于表5中。
表5
I期结果总结(平均值±SE)
1仅针对具有部分应答的动物内插，不包括具有完全应答的动物(即无肿瘤)。
2在第18天(对照动物存在的最后一天)通过使用以下公式评定平均肿瘤生长抑制(％TGI)：％TGI＝(1-(相对肿瘤体积(％)治疗组÷相对肿瘤体积(％)对照组)×100
该研究的下一部分(“II期”)在第49天开始。总计40只动物(10只年龄适宜的首次接受试验的动物和对该RSLAIL-2+抗CTLA-4组合免疫治疗完全应答的30只动物)用于3个组并且如在表6中所描述进行分配。
表6
II期研究设计
1组 N
用EMT6细胞激发的年龄适宜的首次接受试验的动物 10
用CT26再激发的无EMT6肿瘤动物 10
用EMT6再激发的无EMT6肿瘤动物 20
1无肿瘤动物是指来自阶段I的对该RSLAIL-2+抗CTLA-4治疗完全应答的携带EMT6肿瘤的动物
在第49天，将这些动物植入EMT6或CT26肿瘤细胞(0.1mL培养基中2×106个)，皮下注射在腹部区域中。
来自该研究的II期的这些结果显示这些动物上的肿瘤摄取和生长在接种之后5天(第54天)是明显的。第1组(年龄适宜的首次接受试验的动物)和第2组(用CT26再激发的无EMT6肿瘤动物)中的所有动物携带肿瘤，其中平均体积分别为167±22和177±11(平均值±SE)。在接种之后5天，在第3组(用EMT6再激发的无EMT6肿瘤动物)中观察到仅85％的肿瘤摄取率。肿瘤体积据观察相对小于其他组中的肿瘤体积。平均肿瘤体积是62±8mm3。在再激发之后17天该组中20只动物中的14只(70％)是无肿瘤的(完全排斥EMT6肿瘤植入物)并且保持无肿瘤直到II期结束(第109天)。
第2组中的动物(在I期中的组合免疫治疗之后无EMT6肿瘤动物且用CT26肿瘤再激发)在再激发之后14天具有1257±201(平均值±SE)的平均肿瘤体积和13.6±0.8的生长到1000mm3体积的平均时间。肿瘤生长似乎不受I期治疗影响，这暗示免疫应答的肿瘤类型特异性。参见在表7中提供的来自该研究的II期的这些结果的总结。
来自第1组的一只动物在第14天被发现死亡。尸体剖检揭示似乎是肺中的转移性病灶(未通过组织学验证)和胸腔中的血性液体。除此之外，未注意到其他临床观察结果或显著体重损失。参见图17。
这些年龄适宜的首次接受试验的动物(1541±144mm3)与用EMT6再激发的这些无EMT6肿瘤动物(192±107)之间的平均肿瘤体积在植入之后21天进行比较以便评定TGI(87.5％)。
由于缺乏基线肿瘤体积起始点，所以不能评定TVQT。代替这一点，对针对这些携带肿瘤的动物中的每只的肿瘤生长到1000mm3体积的时间进行内插(使用GraphPad Prism的二阶多项式非线性回归分析)以便有助于评定且接近肿瘤生长延迟。对于第1组和第2组，生长到1000mm3肿瘤体积所用的时间(天)分别是16.9±1和13.6±0.8(平均值±SE)天。将第3组中仅不完全排斥EMT6再激发的这些动物(6/20)针对达到1000mm3生长的时间进行评定，该时间是30.3±5.5。针对这些动物的平均肿瘤生长至1000mm3延迟被计算为13.4天。
表7
II期结果总结(平均值±SE)
该研究的最终部分(“III期”)被指定为在第109天到第168天内。将来自II期的完全排斥该EMT6再激发的动物(N＝14)(在第109天)用2×106个EMT6肿瘤细胞再次接种/再激发(第2组)并且监测持续59天。年龄适宜的动物(N＝5)也在相同时间针对对照进行接种(第1组)。
从该研究的最终部分，观察到肿瘤摄取和生长在接种之后3天是明显的，其中对于第1组和第2组，平均肿瘤体积分别是101±14和69±6。给予该第二再激发的动物在肿瘤细胞植入之后21天是完全无肿瘤的(完全排斥)，而所有5只它们的年龄适宜的对应物具有1550±401mm3的平均肿瘤体积。第2组中的动物保持无肿瘤直到该研究结束(第168天)并且未观察到显著体重损失。
该研究证实使用RSLAIL-2和抗CTLA 4的组合免疫治疗在EMT6鼠乳腺癌肿瘤(I期)中的功效以及应答的持久性和特异性，以及该疗法在对治疗良好应答的动物中的长期作用(II期和III期)。关于从开始到结束的该研究的总结以及每个阶段的个体肿瘤生长，参见图21。
实例8
体内耗尽研究：评定在使用RSLAIL-2和抗CTLA-4或抗PD-1的有效组合免疫治疗之后细 胞毒性免疫细胞群体对针对EMT6鼠乳腺癌肿瘤的抗肿瘤免疫力的贡献
该实例的目标是在将RSLAIL-2与通过CTLA-4或PD-1的抗体阻断进行的免疫检查点抑制组合时评定自然杀伤(NK)细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞对抗肿瘤功效的相对贡献。
该研究利用携带EMT6(鼠乳腺癌)肿瘤的58只雌性BALB/c小鼠。随机选择十只(10/58)动物并且分配至媒介物对照组(第0天、第4天、第8天，腹膜内)。将8只(8/58)动物分配至接受抗CTLA-4(腹膜内)(在第0天、第4天和第8天100μg)与RSLAIL-2(静脉内)(在第4天0.8mg/kg)的组合的治疗组。将8只(8/58)动物分配至CD8耗尽组，除了RSLAIL-2和抗CTLA-4的治疗之外，将CD8T细胞通过连续注射大鼠抗小鼠CD8a(第-2天、第0天、第7天100μg，腹膜内)耗尽。将8只(8/58)另外动物分配至NK耗尽组，除了RSLAIL-2和抗CTLA-4的治疗之外，将NK细胞通过连续注射兔抗牛Asialo-GM1(第-2天、第0天、第7天50μl，腹膜内)耗尽。
将8只(8/58)动物分配至接受抗PD-1(腹膜内)(在第0天、第4天和第8天100μg)与RSLAIL-2(静脉内)(在第4天0.8mg/kg)的组合的治疗组。将8只(8/58)动物分配至CD8耗尽组，除了RSLAIL-2和抗PD-1的治疗之外，将CD8T细胞通过连续注射大鼠抗小鼠CD8a(第-2天、第0天、第7天100μg，腹膜内)耗尽。将8只(8/58)另外动物分配至NK耗尽组，除了RSLAIL-2和抗PD-1的治疗之外，将NK细胞通过连续注射兔抗牛Asialo-GM1(第-2天、第0天、第7天50μl，腹膜内)耗尽。
治疗开始(第0天)被指定为将EMT6细胞以2×106个细胞/部位、以0.1mL注射体积皮下注射接种于腹部区域之后7天，并且该研究的持续时间是11天。肿瘤体积(mm3)和体重(克)一周测量2至3次。表8呈现在第11天针对每个组的初始和平均相对肿瘤体积。对于使用RSLAIL-2和抗CTLA-4的组合，在图22中呈现肿瘤体积和体重，而在图23中呈现从第0天的相对肿瘤体积和体重变化百分比。对于使用RSLAIL-2和抗PD-1的组合，在图24中呈现肿瘤体积和体重，而在图25中呈现从第0天的相对肿瘤体积和体重变化百分比。
该研究的这些结果显示在RSLAIL-2和抗CTLA-4治疗组中76.9％(p<0.05)的肿瘤生长抑制(TGI)，这是使用在第11天对照动物(553％)与治疗的动物(128％)之间的平均相对肿瘤体积利用单向方差分析和杜凯氏多重比较后检验(用于Windows的GraphPad Prism6.03版，GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)计算的。
在RSLAIL-2和抗CTLA-4的治疗与连续注射中和CD8a抗体组合、从而导致细胞毒性CD8T细胞的体内耗尽时，该结果是治疗功效的废除，其中在第11天平均相对肿瘤体积是520％，并且肿瘤生长抑制是5.98％，这与该媒介物对照相比未达到统计显著性。
在RSLAIL-2和抗CTLA-4的治疗与连续注射中和抗Asialo-GM1抗体组合、从而导致NK细胞的体内耗尽时，该结果是治疗功效的废除，其中在第11天平均相对肿瘤体积是483％，并且肿瘤生长抑制是12.7％，这与该媒介物对照相比未达到统计显著性。
当将RSLAIL-2与抗PD-1组合时，在第100天平均相对肿瘤体积是285％，从而产生48.5％(p<0.05)的肿瘤生长抑制(TGI)。
在RSLAIL-2和PD-1的治疗与连续注射中和CD8a抗体组合时，该结果是治疗功效的废除，其中在第11天平均相对肿瘤体积是539％，并且肿瘤生长抑制是2.53％，这与该媒介物对照相比未达到统计显著性。
在RSLAIL-2和抗PD-1的治疗与连续注射中和抗Asialo-GM1抗体组合时，该结果是治疗功效的废除，其中在第11天平均相对肿瘤体积是364％，并且肿瘤生长抑制是34.2％，这与该媒介物对照相比未达到统计显著性。
尽管在与抗CTLA-4或抗PD-1组合时或在该治疗与CD8或抗Asialo-GM1抗体消除的添加组合时未观察到来自RSLAIL-2的显著体重损失，但与抗Asialo-GM1组合导致在还接受RSLAIL-2和抗CTLA-4的组中在该研究的第8天发现两只动物死亡，并且在还接受RSLAIL-2和抗PD-1的组中在该研究的第8天发现三只动物死亡。
表8
I期结果总结(平均值±SE)
1在第18天(对照动物存在的最后一天)通过使用以下公式评定平均肿瘤生长抑制(％TGI)：％TGI＝(1-(相对肿瘤体积(％)治疗组÷相对肿瘤体积(％)对照组)×100
2单向方差分析与多重比较，杜凯氏后检验。
3NS，未达到统计显著性。
该研究证实使用RSLAIL-2和抗CTLA-4或RSLAIL-2和抗PD-1的组合免疫治疗在EMT6鼠乳腺癌肿瘤中的功效。此外，在NK细胞和CD8T细胞的体内耗尽之后抗肿瘤功效的损失表明两种细胞类型在该功效中的作用。

Claims (9)

1.一种方法，该方法包括向患有癌症的患者给予以下各项的步骤：(a)IL-2Rβ活化量的一种长效IL-2Rβ选择性激动剂；以及(b)CTLA-4途径抑制量的一种抗CTLA-4抗体或者PD-1途径抑制量的一种抗PD-1抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其中该患者是人。
3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中该癌症是一种实体癌。
4.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中该实体癌选自下组，该组由以下各项组成：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、恶性黑色素瘤、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、肾癌、胆管癌、脑癌、***、上颌窦癌、膀胱癌、食管癌、何杰金氏病、以及肾上腺皮质癌。
5.如权利要求3所述的方法，其中该癌症是结肠癌。
6.如权利要求3所述的方法，其中该癌症是乳腺癌。
7.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中步骤(a)在进行步骤(b)之前进行。
8.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中(a)在进行步骤(b)之后进行。
9.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
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