CN106103717A - 用于调节共济失调蛋白2表达的组合物 - Google Patents
用于调节共济失调蛋白2表达的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本文公开了用于降低共济失调蛋白2mRNA和蛋白质表达的反义化合物和方法。所述方法、化合物和组合物可用于治疗、预防或改善共济失调蛋白2相关疾病、病症或病状。所述共济失调蛋白2相关疾病包括脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
Description
关于政府支持的声明
本发明在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R21NS081182的政府支持下作出。政府享有本发明的某些权利。
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领域
提供了用于在动物中降低共济失调蛋白(Ataxin)2(ATXN2)mRNA和蛋白质表达的组合物和方法。所述方法可用于通过抑制动物中共济失调蛋白2的表达通过抑制共济失调蛋白2的表达来治疗、预防或改善神经变性疾病，所述神经变性疾病包括脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
背景
脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)是一种常染色体显性神经变性疾病，其特征在于小脑、脑干和脊髓中神经元的进行性功能和细胞损失。SCA2的原因是ATXN2基因中CAG扩增导致共济失调蛋白-2蛋白质中聚谷氨酰胺(polyQ)扩增。SCA2患者的特征是进行性小脑共济失调、慢扫视眼动及其他神经特征，例如神经病变(Pulst,S.M.(著),Genetics ofMovement Disorders.Elsevier,Inc.,Amsterdam,2003，第19-34页)。ATXN2基因中CAG的中度扩增还与帕金森症或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关，其无法与这些疾病的先天形式区分开(Kim等，Arch.Neurol.,2007,64:1510-1518；Ross等，Hum.Mol.Genet.,2011,20:3207-3212；Corrado等，Hum.Genet.,2011,130:575-580；Elden等，Nature,2010,466:1069-1075；Van Damme等，Neurology,2011,76:2066-2072)。
伴随polyQ扩增而发生的polyQ疾病蛋白质的致病功能可归因于与核内内涵体的产生或者与可溶性毒性低聚物相关的毒性的获得(Lajoie等，PLoS One,2011,5:e15245)。在SCA2患者脑的特征在于Purkinje细胞的损失的同时，SCA2Purkinje细胞缺乏内涵体，表明polyQ扩增的共济失调蛋白-2可导致与内涵体形成无关的毒性(Huynh等，Ann.Neurol.,1999,45:232-241)。polyQ扩增的共济失调蛋白-2所得功能可包括高尔基体中的异常积累(Huynh等，Hum.Mol.Genet.,2003,12:1485-1496)、正常功能的获得(Duvick等，Neuron,2010,67:929-935)和针对其他polyQ蛋白质的转录因子(TF)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的隔离(Yamanaka等，Methods Mol.Biol.,2010:648,215-229；Koshy等，Hum.Mol.Genet.,1996,5:1311-1318；Burke等，Nat.Med.,1996,2:347-350)。已对共济失调蛋白-2的一些正常功能进行了表征。共济失调蛋白-2存在于应激颗粒和P体中，表明其在应激期间隔离mRNA和蛋白质翻译调节的功能(Nonhoff等，Mol.Biol.Cell,2007,18:1385-1396)。共济失调蛋白-2过表达干扰P体装配，而表达不足(underexpression)干扰应激颗粒装配(Nonhoff等，Mol.Biol.Cell,2007,18:1385-1396)。与polyA-结合蛋白1、RNA剪接因子A2BP1/Fox1和多聚核糖体的相互作用进一步支持共济失调蛋白-2在RNA代谢中的作用(Shibata等，Hum.Mol.Genet.,2000,9:1303-1313；Ciosk等，Development,2004,131:4831-4841；Satterfield等，Hum.Mol.Genet.,2006,15:2523-2532)。共济失调蛋白-2通过与SRC激酶和内吞蛋白CIN85相互作用作为EGF受体内化及信号传导的调节因子(Nonis等，CellSignal.,2008,20:1725-1739)。共济失调蛋白-2还与ALS相关蛋白TDP-43以RNA依赖方式相互作用，并且家族性和散发性ALS与长的正常CAG重复扩增ATXN2的发生有关(Elden等，Nature,2010,466:1069-1075；Van Damme等，Neurology,2011,76:2066-2072)。
目前缺少用于治疗所述神经变性疾病的可接受的选择。因此，本文的一个目的是提供用于治疗所述疾病的方法。
概述
本文提供了用于调节共济失调蛋白2(ATXN2)mRNA和蛋白质表达的方法、化合物和组合物。在某些实施方案中，可用于调节共济失调蛋白2mRNA和蛋白质表达的化合物是反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物是经修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，调节可发生在细胞或组织中。在某些实施方案中，细胞或组织在动物中。在某些实施方案中，动物是人。在某些实施方案中，共济失调蛋白2mRNA水平降低。在某些实施方案中，共济失调蛋白2蛋白质水平降低。该降低可以以时间依赖性的方式或剂量依赖性的方式发生。
还提供了可用于预防、治疗和缓解疾病、病症或病状的方法、化合物和组合物。在某些实施方案中，所述共济失调蛋白2相关疾病、病症或病状是神经变性疾病。在某些实施方案中，所述神经变性疾病、病症或病状包括脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
所述疾病、病症或病状通常可具有一个或更多个风险因素、原因或结果。产生神经变性病症的某些风险因素和原因包括变老、有个人或家族病史或遗传倾向。与产生神经变性病症相关的某些症状和结果包括但不限于：共济失调、语言和吞咽困难、强直、震颤、眼肌麻痹、扫视减慢、周围神经病变、萎缩、肌张力障碍、舞蹈病和痴呆。
在某些实施方案中，治疗方法包括向有此需要的个体施用共济失调蛋白2反义化合物。在某些实施方案中，治疗方法包括向有此需要的个体施用共济失调蛋白2经修饰寡核苷酸。
详述
应理解，上文中的一般描述和下文中的详细描述二者均仅为示例性和解释性的，并不限制所要求保护的本发明。在本文中，单数的使用包括复数，另有指明除外。本文所用的“或”意指“和/或”，另有指明除外。另外，本文所用的“和”意指“和/或”，另有指明除外。此外，术语“包括”及其他形式例如“包含”和“含有”的使用是非限制性的。另外，术语例如“要素”或“组分”涵盖包含一个单位的要素和组分及包含多于一个亚单元的要素和组分二者，另有指明除外。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。在本公开内容中引用的全部文件或文件的一部分均通过引用本文所述文件的部分及其以其整体明示地并入本文，所述文件包括但不限于专利、专利申请、公开的专利申请、文章、书籍、论文和GENBANK登记号及通过数据库例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)可得到的相关序列信息及在本公开内容通篇中引用的其他数据。
定义
除非提供了具体的定义，否则与本文所述分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的步骤和技术相关地采用的命名法是本领域中熟知和通常使用的那些。可以采用标准技术进行化学合成和化学分析。
除非另有指明，否则下述术语具有如下含义：
“2'-O-甲氧基乙基”(及2'-MOE和2'-OCH2CH2-OCH3和MOE)是指呋喃糖环的2'位的O-甲氧基-乙基修饰。经2'-O-甲氧基乙基修饰的糖是经修饰糖。
“2'-MOE核苷”(也称2'-O-甲氧基乙基核苷)指包含2'-MOE修饰糖部分的核苷。
“2'-取代的核苷”指在呋喃糖环的2'-位包含除H或OH之外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2'取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
“5-甲基胞嘧啶”指用连接到5位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是经修饰核碱基。
“约”指在值的±7％以内。例如，若陈述“化合物影响共济失调蛋白2的至少约70％的抑制”，则提示共济失调蛋白2水平在63％至77％的范围内受到抑制。
“同时施用”是指以两种药剂的药理学效应在患者中同时呈现出来的任何方式共同施用这两种药剂。同时施用不要求两种药剂在单一药物组合物中施用、以相同剂型施用或者通过相同施用途径施用。两种药剂的影响本身无需同时呈现。该影响只需要重叠一段时间，而无需共延。
“施用”指向动物提供药剂，包括但不限于由医学专业人员施用和自己施用。
“改善”是指减轻、减缓、停止或逆转病症或疾病严重程度的至少一个指征。指征的严重程度可通过本领域技术人员已知的主观或客观措施来确定。
“动物”指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪；和非人灵长类动物，包括但不限于猴和黑猩猩。
“抗体”指以一些方式与抗原特异性反应为特征的分子，其中抗体和抗原分别根据另一者来定义。抗体可指整个抗体分子或其任何片段或区，例如重链、轻链、Fab区和Fc区。
“反义活性”指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性是靶核酸或由该靶核酸编码的蛋白质的量或表达的降低。
“反义化合物”指能够通过氢键结合经历与靶核酸杂交的低聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，例如，反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA和基于占用(occupancy)的化合物。
“反义抑制”指与在不存在反义化合物的条件下的靶核酸水平相比，在与靶核酸互补的反义化合物的存在下，靶核酸水平降低。
“反义机制”是涉及化合物与靶核酸杂交的所有那些机制，其中杂交的结果或作用是随着涉及例如转录或剪接的细胞机器的共同停止的靶降解或靶占用。
“反义寡核苷酸”指具有允许与靶核酸的相应区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“共济失调蛋白2”指哺乳动物基因共济失调蛋白2(ATXN2)，包括人基因共济失调蛋白2(ATXN2)。人共济失调蛋白2已作图至人染色体12q24.1。
“共济失调蛋白2相关疾病”指与任何共济失调蛋白2核酸或其表达产物相关的任何疾病。所述疾病可包括神经变性疾病。所述神经变性疾病可包括脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
“共济失调蛋白2mRNA”指编码共济失调蛋白2的DNA序列的任何信使RNA表达产物。
“共济失调蛋白2核酸”指编码共济失调蛋白2的任何核酸。例如，在某些实施方案中，共济失调蛋白2核酸包括编码共济失调蛋白2的DNA序列、由编码共济失调蛋白2的DNA(包括含内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列以及编码共济失调蛋白2的mRNA序列。“共济失调蛋白2mRNA”指编码共济失调蛋白2蛋白质的mRNA。
“共济失调蛋白2蛋白质”指共济失调蛋白2核酸的多肽表达产物。
“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核碱基与靶核酸中的相应核碱基精确碱基配对(即，杂交)并且通过相应核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键结合介导的能力。
“双环糖”指通过两个原子的桥接修饰的呋喃糖环。双环糖是经修饰糖。
“双环核苷”(也称BNA)指具有含连接糖环的两个碳原子的桥的糖部分从而形成双环体系的核苷。在某些实施方案中，桥连接糖环的4'-碳与2'-碳。
“帽结构”或“末端帽部分”指在反义化合物的任一末端并入的化学修饰。
“cEt”或“受约束的乙基”指具有含连接4'-碳与2'-碳的桥的糖部分的双环核苷，其中所述桥具有式：4'-CH(CH3)-O-2-’。
“受约束的乙基核苷”(也称为cEt核苷)指包含含有4'-CH(CH3)-O-2'桥的双环糖部分的核苷。
“化学上不同的区”是指以某种方式与同一反义化合物的另一区化学上不同的反义化合物区。例如，具有2'-O-甲氧基乙基核苷的区在化学上不同于不具有2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷的区。
“嵌合反义化合物”指具有至少两个化学上不同的区，每个位置具有多个亚单元的反义化合物。
“共同施用”指向个体施用两种或更多种药剂。所述两种或更多种药剂可以在单一药物组合物中，或者可以在分开的药物组合物中。所述两种或更多种药剂中的每一种都可以通过相同或不同的施用途径来施用。共同施用涵盖并行或依次施用。
“互补性”指第一核酸的核碱基与第二核酸之间配对的能力。
“包括”，“包含”和“含有”将理解为提示包括所述步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。
“邻近核碱基”指彼此紧邻的核碱基。
“设计”或“设计成”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的寡聚化合物的过程。
“稀释剂”指组合物中的缺乏药理学活性但在药理学上是必要的或期望的成分。例如，在注射的药物中，所述稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。
“剂量”指在单一施用或在特定时间段提供的药剂的特定量。在某些实施方案中，剂量可以以一个、两个或更多的丸剂(boluse)、片剂或注射剂中施用。例如，在期望皮下施用的某些实施方案中，期望的剂量要求不易于通过单次注射容纳的体积，因此，采用两次或更多次注射来实现期望的剂量。在某些实施方案中，通过经长时间或连续地输注来施用药剂。剂量可以表示为每小时、每天、每周或每个月的药剂的量。
在调节活性或者治疗或预防病症的上下文中的“有效量”指向有此调节、治疗或预防需要的受试者施用对调节该作用或治疗或预防或改善该病症有效的单一剂量或作为一系列的一部分的量的药剂。不同个体的有效量不同，其取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群组、组合物的配方、个体医疗状况的评估以及其他相关因素。
“效力”指产生期望效应的能力。
“表达”包括基因的编码信息转变成在细胞中存在并起作用的结构的所有功能。这样的结构包括但不限于转录和翻译的产物。
“完全互补”或“100％互补”指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中具有互补的核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物，靶核酸是第二核酸。
“缺口聚物”指其中具有多个支持RNA酶H切割的核苷的内区定位在具有一个或多个核苷的外区之间的嵌合反义化合物，其中包含所述内区的核苷是在化学上不同于包含外区的一个或多个核苷。内区可以称为“缺口”，外区可称为“翼”。
“缺口变窄”指嵌合反义化合物具有定位在具有1至6个核苷的5’与3’翼之间及紧邻具有1至6个核苷的5’与3’翼的9个或更少邻接的2'-脱氧核糖核苷酸缺口区段。
“缺口加宽”指嵌合反义化合物具有定位在具有1至6个核苷的5’与3’翼之间及紧邻具有1至6个核苷的5’与3’翼的12个或更多邻接的2'-脱氧核糖核苷酸缺口区段。
“杂交”指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和靶核酸。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸和核酸靶标。
“鉴定患有共济失调蛋白2相关疾病的动物”指鉴定诊断出共济失调蛋白2相关疾病或易患共济失调蛋白2相关疾病的动物。易患共济失调蛋白2相关疾病的个体包括具有患共济失调蛋白2相关疾病的一个或多个风险因素的那些，所述风险因素包括变老、有一个或多个共济失调蛋白2相关疾病的个人或家族病史或者遗传倾向。该鉴定可以通过包括评价个体的医疗史和标准的临床测试或评估(例如遗传测试)的任何方法来完成。
“紧邻”指紧邻要素之间没有中间要素。
“个体”指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制共济失调蛋白2”指降低共济失调蛋白2mRNA和/或蛋白质的水平或表达。在某些实施方案中，与在不存在共济失调蛋白2反义化合物(例如，反义寡核苷酸)的条件下共济失调蛋白2mRNA的表达和/或蛋白质水平相比，共济失调蛋白2mRNA和/或蛋白质水平在靶向共济失调蛋白2的反义化合物(包括靶向共济失调蛋白2的反义寡核苷酸)的存在下受到抑制。
“抑制表达或活性”是指减少或阻断表达或活性，并不一定表示表达或活性的完全消除。
“核苷酸间键合”是指核苷之间的化学键。
“相连的核苷”指通过核苷酸间键合连接在一起的相邻核苷。
“锁核酸”或“LNA”或“LNA核苷”指在核苷糖单元的4'位与2’位之间具有连接两个碳原子的桥从而形成双环糖的核酸单体。这样的双环糖的实例包括但不限于：A)α-L-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA；(B)β-D-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')LNA；(C)亚乙氧基(4'-(CH2)2-O-2')LNA；(D)氨氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')LNA和(E)氧氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')LNA，如下文所述。
本文所用的LNA化合物包括但不限于在糖的4’与2’位之间具有至少一个桥的化合物，其中每个桥独立地含有独立地选自以下的1个或2至4个连接基团：-[C(R1)(R2)]n-、-C(R1)＝C(R2)-、-C(R1)＝N-、-C(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(R1)2-、-S(＝O)x-和-N(R1)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；R1和R2各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、杂环基团、经取代的杂环基团、杂芳基、经取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、经取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酰基(S(＝O)-J1)；J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、杂环基团、经取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、经取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
LNA定义涵盖的4’-2’桥接基团的实例包括但不限于下式之一：-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-。此外，LNA的定义涵盖的其他桥接基团为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R1)-2'和4'-CH2-N(R1)-O-2'-桥，其中R1和R2各自独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
根据本发明包括在LNA定义之内的还有其中核糖基糖环的2’-羟基与糖环的4’碳原子相连从而形成亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)桥以形成双环糖部分的LNA。该桥还可以是连接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，对此使用术语亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)LNA。此外，在该位具有亚乙基桥接基团的双环糖部分的情况下，使用术语亚乙氧基(4’-CH2CH2-O-2’)LNA。本文所用的α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)，其为亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA的异构体，也涵盖在LNA定义之内。
“错配”或“非互补核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能够与第二或靶核酸的相应核碱基配对的情况。
“经修饰核苷酸间键合”是指对天然核苷酸间键合(即，磷酸二酯核苷酸间键合)的替换和任何变化。
“经修饰核碱基”指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任何核碱基。“未经修饰核碱基”指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“经修饰核苷”指独立地具有经修饰糖部分和/或经修饰核碱基的核苷。
“经修饰核苷酸”指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰核苷酸间键合和/或经修饰核碱基的核苷酸。
“经修饰寡核苷酸”指包括至少一个经修饰核苷酸间键合、经修饰糖和/或经修饰核碱基的寡核苷酸。
“经修饰糖”指对天然糖部分的替换和/或任何变化。
“单体”指低聚物的单个单元。单体包括但不限于核苷和核苷酸，无论是天然的还是修饰的。
“基序”指反义化合物中未经修饰核苷和经修饰核苷的模式。
“天然糖部分”指见于DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中的糖部分。
“天然存在的核苷酸间键合”指3’至5’磷酸二酯键。
“非互补核碱基”指彼此不形成氢键也不以其他方式支持杂交的核碱基对。
“核酸”是指由单体核苷酸构成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微小RNA(miRNA)。
“核碱基”指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”是指核碱基能够与另一个核碱基进行碱基配对。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补的核碱基是指反义化合物的能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果在反义化合物的某一位置处的核碱基能够与靶核酸的某一位置上的核碱基氢键结合，那么认为寡核苷酸与靶核酸之间氢键结合的位置在该碱基对处互补。
“核碱基序列”指独立于任何糖、键合和/或核碱基修饰的邻接核碱基的顺序。
“核苷”指与糖相连的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于替换糖或者糖和碱基而不一定替换低聚化合物一个或多个位置处的键合的那些结构，例如具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物例如非呋喃糖糖单元的核苷模拟物。核苷酸模拟物包括用于替换核苷和在低聚化合物的一个或多个位置处的键合的那些结构，所述低聚化合物例如肽核酸或吗啉基(通过-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键合连接的吗啉基)。糖替代品与稍宽泛的术语核苷模拟物重叠，但仅旨在替换糖单元(呋喃环)。本文提供的四氢吡喃基环是糖替代品的示例，其中呋喃糖基被替换为四氢吡喃环体系。“模拟物”是指基团被替换为糖、核碱基和/或核苷酸间键合。一般而言，模拟物用于代替糖或糖-核苷酸间键合组合，并且保留核碱基以与所选靶标杂交。
“核苷酸”指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。
“脱靶效应”是指与除预期靶核酸以外的基因的RNA或蛋白质表达的调节相关的不希望有的或有害的生物作用。
“低聚化合物”或“低聚物”指相连的单体亚单元的聚合物，所述单体亚单元能够与核酸分子的至少一个区杂交。
“寡核苷酸”指相连的核苷的聚合物，每一个核苷都可以彼此独立地为经修饰的或者未经修饰的。
“肠胃外施用”指通过注射(例如，推注)或输注施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“肽”指通过酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。本文所用的肽是指多肽和蛋白质，而不限于此。
“药剂”指当施用于个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2的反义寡核苷酸是药剂。
“药物组合物”指适于施用于受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可包含反义寡核苷酸和无菌水溶液。
“药学上可接受的衍生物”包括本文所述化合物的药学上可接受的盐、缀合物、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保留了母体寡核苷酸的期望生物活性而不为其赋予不期望的毒理学效应的盐。
“硫代磷酸酯键合”指核苷之间的键合，其中通过用硫原子替换非桥接氧原子之一来修饰磷酸二酯键。硫代磷酸酯键合是经修饰核苷酸间键合。
“部分”指核酸的限定数目的邻接(即，相连的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的邻接核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的邻接核碱基。
“防止”或“预防”是指延缓或预先制止疾病、病症或病状的发作或发生数分钟至数天、数周至数月的时间段或无限期。
“前药”指制备为通过内源性酶或其他化学品和/或条件的作用在机体或细胞中转化成活性形式(即，药物)的非活性形式的治疗剂。
“预防有效量”是指药物制剂为动物提供预防性或防范性益处的量。
“区”定义为具有至少一个可识别的结构、功能或特征的靶核酸的部分。
“核糖核苷酸”指在核苷酸的糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可以用多种取代基中的任一种进行修饰。
“盐”指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保留了母体寡核苷酸的期望生物活性而不赋予不期望的毒理学效应的盐。
“区段”定义为靶核酸中的区的较小部分或子部分。
本文所教导的反义寡核苷酸的“缩短”或“截短”形式缺失一个、两个或多个核苷。
“副作用”指可归因于期望效应之外的治疗的生理响应。在某些实施方案中，副作用包括但不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经***异常和肌病。
“单链寡核苷酸”指不与互补链杂交的寡核苷酸。
本文所用的“位点”定义为靶核酸内唯一的核碱基位置。
“减慢进展”指减少疾病的发展。
“可特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸与靶核酸之间具有足够程度的互补性以诱导期望的效应，而在期望的特异性结合条件(即，在体内测定和治疗性治疗的情况下在生理条件下)下对非靶核酸表现出很少的效应或无效应。
“严格杂交条件”或“严格条件”是指低聚化合物将与其靶序列杂交而与最低数目的其他序列杂交的条件。
“受试者”指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“靶标”是指期望对其进行调节的蛋白质。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶向”或“靶”指设计和选择将与靶核酸特异性杂交并诱导期望的效应的反义化合物的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”和“靶RNA转录物”以及“核酸靶标”均指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶区”指一个或多个反义化合物靶向的靶核酸部分。
“靶区段”指反义化合物靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最靠5’核苷酸(5’-most nucleotide)。“3’靶位点”是指靶区段的最靠3’核苷酸(3’-mostnucleotide)。
“治疗有效量”指药剂为个体提供治疗益处的量。
“治疗”是指施用组合物以实现该疾病或病症的改变或改善。
“未经修饰核碱基”指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“未经修饰核苷酸”指由天然核碱基、糖部分和核苷酸间键合构成的核苷酸。在某些实施方案中，未经修饰核苷酸是RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷)。
“翼区段”指修饰以赋予寡核苷酸特性的多个核苷，所述寡核苷酸特性例如增强的抑制活性、对靶核酸增加的结合亲和力或对体内核酸酶降解的耐受。
某些实施方案
某些实施方案提供了用于抑制共济失调蛋白2mRNA和蛋白质表达的方法、化合物和组合物。某些实施方案提供了用于降低共济失调蛋白2mRNA和蛋白质水平的方法、化合物和组合物。
某些实施方案提供了靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物。在某些实施方案中，共济失调蛋白2核酸是GENBANK登记号NM_002973.3(作为SEQ ID NO：1并入本文)、从核苷酸2465000至2616000截短的GENBANK登记号NT_009775.17的补体(作为SEQ ID NO：2并入本文)和GENBANK登录号BX410018.2(作为SEQ ID NO：3并入本文)中给出的序列。
某些实施方案提供了用于在有此需要的个体中治疗、预防或改善与共济失调蛋白2相关的疾病、病症或病状的方法。还涵盖用于制备用于治疗、预防或改善与共济失调蛋白2相关的疾病、病症或病状的药物的方法。共济失调蛋白2相关疾病、病症或病状包括神经变性疾病。在某些实施方案中，共济失调蛋白2相关疾病包括脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
某些实施方案提供了包含经修饰寡核苷酸的化合物，该经修饰寡核苷酸由12至30个相连的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:11-165的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个，至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，经修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％，至少86％、至少87％、至少88％，至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在某些实施方案中，化合物是单链经修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，经修饰寡核苷酸的至少一个核苷酸间键合是经修饰核苷酸间键合。
在某些实施方案中，至少一个经修饰核苷酸间键合是硫代磷酸酯核苷酸间键合。
在某些实施方案中，每个经修饰核苷酸间键合是硫代磷酸酯核苷酸间键合。
在某些实施方案中，至少一个核苷酸间键合是磷酸二酯核苷酸间键合。
在某些实施方案中，至少一个核苷酸间键合是硫代磷酸酯键合，至少一个核苷酸间键合是磷酸二酯键合。
在某些实施方案中，至少一个核苷包含经修饰核碱基。
在某些实施方案中，经修饰核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，经修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含经修饰糖。
在某些实施方案中，至少一种经修饰糖是双环糖。
在某些实施方案中，双环糖包含糖4'-CH2-N(R)-O-2'桥的2'与4'位之间的化学连接，其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖包含4'-CH2-N(R)-O-2'桥，其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基。
在某些实施方案中，至少一个经修饰糖含有2'-O-甲氧基乙基。
在某些实施方案中，经修饰糖含有2'-O-(CH2)2-OCH3基团。
在某些实施方案中，经修饰寡核苷酸包含：
由10个相连的脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个相连的核苷组成的5’翼区段；和
由5个相连的核苷组成的3’翼区段；
其中缺口区段位于5’翼区段与3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰糖。
在某些实施方案中，经修饰寡核苷酸由20个相连的核苷组成。
某些实施方案提供了本文所述的任何化合物或其盐和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
某些实施方案提供了包括向动物施用本文所述的任何化合物或组合物的方法。
在某些实施方案中，动物是人。
在某些实施方案中，施用化合物预防、治疗、改善或减缓共济失调蛋白2相关疾病、病症或病状的进展。
在某些实施方案中，共济失调蛋白2疾病、病症或病状脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
某些实施方案提供了本文所述的任何化合物或组合物用于制备用于治疗神经变性病症的药物的用途。
反义化合物
低聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和siRNA。低聚化合物可以与靶核酸“反义”，意为能够通过氢键结合与靶核酸杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有核碱基序列，该核碱基序列在以5’至3’方向书写时包含其所靶向靶核酸的靶区段的反向互补序列。在某些这样的实施方案中，反义寡核苷酸具有这样的核碱基序列，其在以5’至3’方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为12至30个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为12至25个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为12至22个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为14至20个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为15至25个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为18至22个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为19至21个亚单元。在某些实施方案中，所述反义化合物的长度为8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至30、18至50、19至30、19至50或20至30个相连的亚单元。
在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为12个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为13个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为14个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为15个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为16个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为17个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为18个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为19个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为20个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为21个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为22个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为23个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为24个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为25个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为26个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为27个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为28个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为29个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为30个亚单元。在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物的长度为31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个相连的亚单元，或者由上述值中任何两个所限定的范围。在某些实施方案中，所述反义化合物是反义寡核苷酸，并且相连的亚单元是核苷。
在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义寡核苷酸可以是缩短的或截短的。例如，可以从5’端(5’截短)或者从3’端(3’截短)缺失单个亚单元。靶向共济失调蛋白2核酸的缩短的或截短的反义化合物可具有从反义化合物的5’端缺失的两个亚单元，或者可具有从反义化合物的3’端缺失的两个亚单元。或者，缺失的核苷可以分散在整个反义化合物中，例如在从5’端缺失一个核苷或者从3’端缺失一个核苷的反义化合物中。
当加长的反义化合物中存在单个添加的亚单元时，该添加的亚单元可以位于反义化合物的5’或3’端。当存在两个或多个添加的亚单元时，所添加的亚单元可以彼此相邻，例如，在具有添加到反义化合物的5’端(5’添加)的两个亚单元，或者添加到反义化合物的3’端(3’添加)的两个亚单元的反义化合物中。或者，所添加的亚单元可以分散在整个反义化合物中，例如在具有添加到5’端的一个亚单元或者添加到3’端的一个亚单元的反义化合物中。
有可能提高或降低反义化合物(例如反义寡核苷酸)的长度，和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，在***注射模型中对长度为13至25个核碱基的一系列反义寡核苷酸诱导靶RNA切割的能力进行了测试。在反义寡核苷酸两端附近有8或11个错配碱基的长度为25个核碱基的反义寡核苷酸能够引导靶mRNA的特异性切割，虽然比不含错配的反义寡核苷酸程度低。类似地，用13个核碱基反义寡核苷酸(包含具有1或3个错配的那些)来实现靶特异性切割。
Gautschi等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,2001年3月)证实了与bcl-2mRNA具有100％互补性并且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外和体内降低bcl-2和bcl-xL二者表达的能力。此外，该寡核苷酸在体内表现出强抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)在兔网状细胞测定中分别对一系列串联14个核碱基的反义寡核苷酸和由两个或三个串联反义寡核苷酸序列构成的28和42个核碱基的反义寡核苷酸阻止人DHFR翻译的能力进行了测试。3个具有14个核碱基的反义寡核苷酸均能够单独抑制翻译，虽然以比28或42个核碱基的反义寡核酸更适中的水平。
反义化合物基序
在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物具有以赋予反义化合物如下特性的模式或基序布置的经化学修饰亚单元，所述特性例如增强的抑制活性、对靶核酸增加的结合亲和力或对体内核酸酶降解的耐受。
嵌合反义化合物通常有至少一个区经修饰以赋予对核酸酶降解增加的抗性、增加的细胞摄取、对靶核酸增加的结合亲和力和/或增加的抑制活性。嵌合反义化合物的第二区可任选地作为切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切酶RNA酶H的底物。
认为具有缺口聚物基序的反义化合物是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，支持RNA酶H切割的具有多个核苷酸的内区位于具有多个在化学上与内区的核苷不同的核苷酸的外区之间。在具有缺口聚物基序的反义寡核苷酸的情况下，缺口区段一般作为内切酶切割的底物，而翼区段包含经修饰核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的区通过包含每个不同的区的糖部分的类型来区分。在一些实施方案中，用于区分缺口聚物的区的糖部分的类型可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-经修饰核苷(这样的2'经修饰核苷可包括2'-MOE和2'-O-CH3等)以及经双环糖修饰的核苷(这样的经双环糖修饰的核苷可包括具有4'-(CH2)n-O-2'桥(其中n＝1或n＝2)和4'-CH2-O-CH2-2'的那些)。在某些实施方案中，翼可包含若干经修饰糖部分，包括例如2'-MOE。在某些实施方案中，翼可包含若干经修饰和未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼可包含2'-MOE核苷和2'-脱氧核苷的各种组合。
每个不同的区可包含统一的糖部分、变体或交替糖部分。翼-缺口-翼基序经常描述为“X-Y-Z”，其中“X”代表5’翼的长度，“Y”代表缺口的长度，“Z”代表3’翼的长度。“X”和“Z”可包含统一、变体或交替糖部分。在某些实施方案中，“X”和“Y”可包含一个或多个2'-脱氧核苷。“Y”可包含2'-脱氧核苷。本文所用描述为“X-Y-Z”的缺口聚物的构造使得缺口位置紧邻每个5’翼和3’翼。因此，5’翼与缺口之间或者缺口与3’翼之间不存在间插核苷酸。本文所述的任何反义化合物均可具有缺口聚物基序。在某些实施方案中，“X”和“Z”是相同的；在其他一些实施方案中，它们是不同的。
在某些实施方案中，本文所提供的缺口聚物包括例如具有5-10-5基序的20聚物。
在某些实施方案中，本文所提供的缺口聚物包括例如具有5-9-5基序的19聚物。
在某些实施方案中，本文所提供的缺口聚物包括例如具有5-8-5基序的18聚物。
在某些实施方案中，本文所提供的缺口聚物包括例如具有4-8-6基序的18聚物。
在某些实施方案中，本文所提供的缺口聚物包括例如具有6-8-4基序的18聚物。
在某些实施方案中，本文所提供的缺口聚物包括例如具有5-7-6基序的18聚物。
靶核酸、靶区和核苷酸序列
编码共济失调蛋白2的核苷酸序列包括但不限于以下：GENBANK登记号NM_002973.3(作为SEQ ID NO：1并入本文)、从核苷酸2465000至2616000截短的GENBANK登记号NT_009775.17的补体(作为SEQ ID NO：2并入本文)和GENBANK登记号BX410018.2(作为SEQID NO：3并入本文)。
应理解，在本文所含实施例中的每个SEQ ID NO中给出的序列独立于对糖部分、核苷酸间键合或核碱基的任何修饰。这样，由SEQ ID NO限定的反义化合物可独立地包含对糖部分、核苷酸间键合或核碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis号)描述的反义化合物表示核碱基序列和基序的组合。
在某些实施方案中，靶区是靶核酸在结构上限定的区。例如，靶区可涵盖3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子连接区、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其他限定的核酸区。对共济失调蛋白2而言在结构上限定的区可通过登记号从序列数据库(例如NCBI)获得，并且该信息通过引用并入本文。在某些实施方案中，靶区可涵盖从靶区内的一个靶区段的5’靶位点到同一靶区内的另一靶区段的3‘靶位点。
靶向包括确定反义化合物与之杂交使得产生期望的效应的至少一个靶区段。在某些实施方案中，所述期望的效应是mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所述期望的效应是由靶核酸编码的蛋白质的水平降低或与靶核酸相关的表型变化。
靶区可包含一个或多个靶区段。靶区内的多个靶区段可以重叠。或者，它们可以不重叠。在某些实施方案中，靶区内的靶片段由不超过约300个核苷酸分开。在某些实施方案，靶区内的靶区段由靶核酸上的数个核苷酸分开约、不超过、不超过约250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸，或者由前述值中的任何两个限定的范围。在某些实施方案中，靶区内的靶区段由不超过、或不超过靶核酸上的约5个核苷酸分开。在某些实施方案中，靶区段是邻接的。涵盖由具有起始核酸(即，本文所列举的任何5‘靶位点或3’靶位点)的范围限定的靶区。
合适的靶区段可见于5’UTR、编码区、3’UTR、内含子、外显子或外显子/内含子连接区中。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也是合适的靶区段。合适的靶区段可特别排除某些结构上限定的区，例如起始密码子或终止密码子。
合适靶区段的确定可包括将靶核酸的序列与整个基因组中的其他序列进行比较。例如，可以采用BLAST算法来鉴定不同核酸中相似的区。该比较可防止选择可以以非特异性方式与除选定靶核酸之外的序列(即，非靶序列或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
在活性靶区中反义化合物可具有不同活性(例如，由靶核酸水平降低百分比定义)。在某些实施方案中，共济失调蛋白2mRNA水平的降低指示共济失调蛋白2表达的抑制。共济失调蛋白2蛋白水平的降低也指示靶mRNA表达的抑制。表型变化指示共济失调蛋白2表达的抑制。神经功能的改进表明共济失调蛋白2表达的抑制。改进的运动功能和记忆指示共济失调蛋白2表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，本文所公开的反义化合物与共济失调蛋白2核酸之间发生杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间氢键结合(例如，Watson-Crick，Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合)。
杂交可以在不同的条件下发生。严格条件是序列依赖性的并且由待杂交核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否与靶核酸特异性杂交的方法是本领域熟知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物与共济失调蛋白2核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物有足够数量的核碱基可与靶核酸的相应核碱基氢键结合使得发生期望的效应(例如，靶核酸(例如共济失调蛋白2核酸)的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。
反义化合物与共济失调蛋白2核酸之间的非互补核碱基可以被容忍，前提是反义化合物仍然能够与靶核酸特异性杂交。此外，反义化合物可以越过共济失调蛋白2核酸的一个或更多个区段杂交使得干扰区段或相邻区段不参与杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其特定部分与共济失调蛋白2核酸、靶区、靶区段或其特定部分有或者至少有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可以采用常规方法来确定。
例如，其中反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区互补并因此特异性杂交的反义化合物将示出90％的互补性。在该实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补的核碱基成簇或穿插而无需彼此邻近或与互补核碱基邻近。这样，长度为18个核碱基具有通过与靶核酸完全互补的两个区侧面相接的4(四)个非互补核碱基的反义化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因而落在本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可以常规地使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序来确定(Altschul等，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649656)。同源性百分比、序列同一性或互补性可以通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix用版本8,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis)使用默认设置来测定，其采用了Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其特定部分与靶核酸或其特定部分完全互补(即，100％互补)。例如，反义化合物可以与共济失调蛋白2核酸或靶区或靶区段或其靶序列完全互补。本文所用的“完全互补”指反义化合物的每个核碱基都能够与靶核酸的相应核碱基精确碱基配对。例如，20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的靶序列完全互补，只要靶核酸有相应的20个核碱基部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可用于指第一和/或第二核酸的特定部分。例如，30个核碱基的反义化合物的20个核碱基的部分可以与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。如果靶序列具有这样的相应的20个核碱基的部分，其中每一个核碱基与反义化合物的20个核碱基的部分互补，则该30个核碱基的寡核苷酸的20个核碱基的部分与靶序列完全互补。同时，整个30个核碱基的反义化合物可以与靶序列完全互补或不完全互补，这取决于反义化合物剩余的10个核碱基是否也与靶序列互补。
非互补核碱基的位置可以在反义化合物的5’端或3’端。或者，非互补的一个或多个核碱基可以在反义化合物的内部位置。当存在两个或多个非互补核碱基时，它们可以邻接(例如，相连)或不邻接。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物反义寡核苷酸的翼区段。
在某些实施方案中，长度为或多达11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸包含不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补核碱基，所述靶核酸例如共济失调蛋白2核酸或其特定部分。
在某些实施方案中，长度为或多达11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸包含不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个非互补核碱基，所述靶核酸例如共济失调蛋白2核酸或其特定部分。
本文提供的反义化合物还包含与靶核酸的一部分互补的那些。本文所用的“部分”指靶核酸的区或区段内限定数目的邻接(即，相连的)的核碱基。“部分”还可指反义化合物的限定数目的邻接核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少8个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少9个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少10个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少11个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少12个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少13个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少14个核碱基部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少15个核碱基部分互补。还涵盖与靶区段的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个或者由这些值中的任何两个限定的范围的核碱基部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物也可以与特定核苷酸序列，SEQ ID NO，或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有限定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物与本文所公开的序列具有相同的核碱基配对能力，则该反义化合物与本文所公开的序列具有同一性。例如，认为在公开的DNA序列中含有替代胸腺嘧啶的尿嘧啶的RNA与该DNA序列具有同一性，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶二者均与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述反义化合物的缩短形式或截短形式以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一性碱基的化合物。所述非同一性碱基可以彼此相邻或分散于整个反义化合物。反义化合物的同一性百分比根据相对于与其进行比较的序列具有相同的碱基配对的碱基数来计算。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其一部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与靶核酸的相等长度的部分进行比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基部分与靶核酸的相等长度部分进行比较。
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与靶核酸的相等长度的部分进行比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基部分与靶核酸的相等长度部分进行比较。
修饰
核苷是碱基-糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。核苷酸是进一步包括共价连接到核苷的糖部分上的磷酸基团的核苷。对于那些包括呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸基团可以连接到糖的2'、3’或5’羟基部分。寡核苷酸通过相邻核苷彼此的共价键合形成，从而形成线性聚合寡核苷酸。在寡核苷酸结构中，磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷酸间键合。
对反义化合物的修饰涵盖对核苷酸间键合、糖部分或核碱基的替换或变化。相对于天然形式通常优选经修饰反义化合物，这是由于诸如以下的期望特性，增强的细胞摄取、对核酸靶标增强的亲和力、在核酸酶的存在下提高的稳定性或提高的抑制活性。
经化学修饰的核苷也可用于提高缩短的或截短的反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，具有这样的经化学核苷的较短反义化合物通常可获得与此相当的结果。
经修饰核苷酸间键合
RNA和DNA的天然核苷酸间键合是3’至5’磷酸二酯键。相对于具有天然核苷酸间键合的反义化合物，通常选择具有一个或多个经修饰(即，非天然存在)核苷酸间键的反义化合物，这是由于诸如以下的期望特性：增强的细胞摄取、对核酸靶标增强的亲和力和在核酸酶的存在下提高的稳定性。
具有经修饰核苷酸间键合的寡核苷酸包含保留磷原子的核苷酸间键合以及不含磷原子的核苷酸间键合。代表性的含磷核苷酸间键合包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷键的非含磷键的方法是熟知的。
在某些实施方案中，靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物包含一个或多个经修饰核苷酸间键合。在某些实施方案中，经修饰核苷酸间键合穿插在整个反义化合物中。在某些实施方案中，经修饰核苷酸间键合是硫代磷酸酯键合。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷酸间键合都是硫代磷酸酯核苷酸间键合。
经修饰糖部分
反义化合物可任选地包含其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。这样的糖经修饰的核苷可以为反义化合物赋予增强的核酸酶稳定性、提高的结合亲和力或一些其他有益的生物特性。在某些实施方案中，核苷包含经化学修饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖环的实例包括但不限于添加取代基(包括5’和2'取代基、桥接非成对环原子以形成双环核酸(BNA)、用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基)替换核糖基环氧原子及其组合。经化学修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(其他公开的5',2'-双取代核苷参见8/21/08公开的PCT国际申请WO 2008/101157)或以2'位的进一步取代用S替换核糖基环氧原子(参见2005年6月16日公开的美国专利申请US2005-0130923)或BNA的5'-取代(参见11/22/07日公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中用例如5'-甲基或5'-乙烯基取代LNA)。
具有经修饰糖部分的核苷的实例包括但不限于含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3的取代基的核苷。在2'位的取代基也可选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中，Rl、Rm和Rn各自独立地为H或者经取代或未经取代的C1-C10烷基。
本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的经修饰核苷。双环核苷的实例包括但不限于在4'与2'核糖基环原子之间含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包含含有4'到2'桥的一个或多个双环核苷。这样的4'到2'桥接双环核苷的实例包括但不限于下式之一：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其类似物，参见2008年7月15日发布的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其类似物，参见2009年1月8日公开的国际申请WO/2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其类似物，参见2008年12月11日公开的公开国际申请WO/2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公开的公开美国专利申请US2004-0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基(参见2008年9月23日公布的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'(及其类似物，参见2008年12月8日公开的公开国际申请WO 2008/154401)。
与双环核苷相关的其他报道还可见于如下公开文献中(参见例如：Singh等，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等，Curr.Opinion Invest.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等，Chem.Biol.,2001,8,1-7；和Orum等，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利No：6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,399,845；7,547,684和7,696,345；美国专利公开No.US2008-0039618；US2009-0012281；美国专利序列No.60/989,574；61/026,995；61/026,998；61/056,564；61/086,231；61/097,787和61/099,844；公开的PCT国际申请WO 1994/014226；WO 2004/106356；WO 2005/021570；WO 2007/134181；WO 2008/150729；WO 2008/154401和WO 2009/006478。前述双环核苷均可制备为具有一个或多个立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见PCT国际申请PCT/DK98/00393，以WO 99/14226公开于1999年3月25日)。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖部分的4'与2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中这样的桥独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的相连的基团：[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝O)-、-C(＝NRa)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
Ra和Rb各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、杂环基团、经取代的杂环基团、杂芳基、经取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、经取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或硫氧基(S(＝O)-J1)；并且
J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、杂环基团、经取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、经取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥是4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中，每个R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步通过异构构型来限定。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥的核苷可以为α-L构型或β-D构型。先前，已将α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA并入示出反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA和(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA、(G)亚甲基-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA以及(J)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA，如下所示。
其中Bx是碱基部分，R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，提供了具有式I的双环核苷：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-是-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc是C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性含磷基团、磷部分或与支持介质的共价连接。
在某些实施方案中，提供了具有式II的双环核苷：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性含磷基团、磷部分或与支持介质的共价连接；
Za是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C2-C6烯基、经取代的C2-C6炔基、酰基、经取代的酰基、经取代的酰胺、硫醇或经取代的硫代。
在一个实施方案中，经取代的基团各自独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧代、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd，其中Jc、Jd和Je各自独立地为H、C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基，并且X是O或NJc。
在某些实施方案中，提供了具有式III的双环核苷：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性含磷基团、磷部分或与支持介质的共价连接；
Zb是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C2-C6烯基、经取代的C2-C6炔基或经取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，提供了具有式IV的双环核苷：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性含磷基团、磷部分或与支持介质的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基；
qa、qb、qc和qd各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、经取代的C1-C6烷氧基、酰基、经取代的酰基、C1-C6氨基烷基或经取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，提供了具有式V的双环核苷：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性含磷基团、磷部分或与支持介质的共价连接；
qa、qb，、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、经取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)-NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或者qe和qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或经取代的C1-C12烷基。
已对亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备及其寡聚和核酸识别特性进行了描述(Koshkin等，Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。WO 98/39352和WO 99/14226中还描述了BNA及其制备。
亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA和2'-硫代-BNA的类似物也已制备(Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。含寡聚脱氧核糖核苷酸双链体的作为核酸聚合酶底物的锁核苷类似物的制备也已有描述(Wengel等，WO 99/14226)。此外，在本领域中还描述了2'-氨基-BNA的合成，2'-氨基-BNA是一种新的构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物(Singh等，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。此外，已制备2'-氨基-和2'-甲基氨基-BNA，而且此前已报道具有互补RNA和DNA链的其双链体的热稳定性。
在某些实施方案中，提供了具有式VI的双环核苷：
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性含磷基团、磷部分或与支持介质的共价连接；
qi、qj、qk和ql各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、经取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或经取代的C1-C12烷基。
已对具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的一种碳环双环核苷进行了描述(Freier等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。还对碳环双环核苷的合成和制备及其寡聚和生物化学研究进行了描述(Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26),8362-8379)。
本文所用的“4’-2’双环核苷”或“4’到2’双环核苷”是指包含呋喃糖环的双环核苷，所述呋喃糖环包含连接呋喃糖环的两个碳原子的桥，该桥连接糖环的2’碳原子和4’碳原子。
本文所使用“单环核苷”是指包含并非双环糖部分的经修饰糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可以在任何位置进行修饰或取代。
本文所用的“2’-经修饰糖”指在2’位修饰的呋喃糖。在某些实施方案中，这样的修饰包括选自以下的取代基：卤化物，包括但不限于经取代的和未经取代的烷氧基、经取代的和未经取代的硫代烷基、经取代的和未经取代的氨基烷基、经取代的和未经取代的烷基、经取代的和未经取代的烯丙基以及经取代的和未经取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2'-取代基还可选自：C1-C12烷基、经取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于提高药代动力学特性的基团或用于提高反义化合物药效学特性的基团及具有相似特性的其他取代基。在某些实施方案中，经修饰核苷包含2’-MOE侧链(Baker等，J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。这样的2'-MOE取代已描述为与未经修饰的核苷及与其他经修饰核苷(例如2’-O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基)相比具有提高的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸还示出作为基因表达的反义抑制剂，对于体内使用具有有前景的特征(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等，Chimia,1996,50,168-176；Altmann等，Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；和Altmann等，Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本文所用的“经修饰四氢吡喃核苷”或“经修饰THP核苷”指具有用六元四氢吡喃“糖”取代正常核苷中的呋喃戊糖基残基(糖替代物)的核苷。经修饰THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)、氟代HNA(F-HNA)或具有式VII的那些化合物：
其中式VII所述至少一个四氢吡喃核苷类似物各自独立地为：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为连接四氢吡喃核苷类似物与反义化合物的核苷间连接基团，或者Ta和Tb中的一个为连接四氢吡喃核苷类似物与反义化合物的核苷间连接基团，并且Ta和Tb中的另一个是H、羟基保护基、相连的缀合物基团或者5’或3’末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基；并且R1和R2分别选自氢、羟基、卤素、经取代的或未经取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X是O、S或NJ1，并且J1、J2和J3各自独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供了式VII的经修饰THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7分别为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少有一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少有一个是甲基。在某些实施方案中，提供了式VII的THP核苷，其中R1和R2中的一个是氟。在某些实施方案中，R1是氟，R2是H；R1是甲氧基，R2是H，及R1是H，R2是甲氧基乙氧基。
本文所用的“2’-修饰”或“2’-取代”是指包含糖的核苷，所述糖在2’位含除H或OH以外的取代基。2’-经修饰核苷包括但不限于双环核苷，其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2’碳和另一个碳；及具有非桥接2’取代基的核苷，例如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地为H或者经取代的或未经取代的C1-C10烷基。2’-经修饰糖苷还可包含其他修饰，例如在糖的其他位置和/或在核碱基上。
本文所用的“2’-F”是指包含糖的核苷，所述糖在2’位包含氟基团。
本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”分别是指包含糖的核苷，所述糖在糖环的2’位包含-OCH3基团。
本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2'-O-甲氧乙基”分别是指包含糖的核苷，所述糖在糖环的2’位包含-OCH2CH2OCH3基团。
本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个相连的核苷的化合物。在某些实施方案中，所述多个核苷中的一个或多个被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
许多其他的二环和三环糖替代物环体系也是本领域熟知的，其可用于修饰核苷以并入反义化合物中(参见例如综述文章：Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)。
可以对这样的环体系进行各种附加替换以增强活性。
经修饰糖的制备方法是本领域技术人员熟知的。
在具有经修饰糖部分的核苷中，保留核碱基部分(天然、经修饰或其组合)以与合适的核酸靶标杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或更多个具有经修饰糖部分的核苷。在某些实施方案中，经修饰糖部分是2’-MOE。在某些实施方案中，所述2’-MOE经修饰糖苷布置在缺口聚物基序中。在某些实施方案中，经修饰糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)经修饰核苷布置在缺口聚物基序的翼中。
组合物和用于配制药物组合物的方法
可以将反义寡核苷酸与药学上可接受的活性或惰性物质混合来制备药物组合物或制剂。组合物和药物组合物的配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用剂量。
可以通过将反义化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合来将靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS是适合在待肠胃外递送的组合物中使用的稀释剂。因此，在一个实施方案中，本文所述方法中使用包含靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是PBS。在某些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐，或者任何其他寡核苷酸，其在施用于动物(包括人)时能够(直接地或间接地)提供其生物活性代谢物或残余物。因此，例如，本公开内容还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐及其他生物学等同变体。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可包括在反义化合物的一端或两端并入额外的核苷，其在体内由内源核酸酶切割从而形成活性反义化合物。
缀合的反义化合物
可以使反义化合物与一个或多个部分或缀合物共价连接，其增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。典型的缀合物基团包括胆固醇部分和脂质部分。额外的缀合物基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。
反义化合物也可修饰为具有一个或多个稳定基团，所述稳定基团一般连接到反义化合物的一端或两端以增强性能，例如核酸酶稳定性。稳定基团包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免受外切核酸酶降解，并可有助于在细胞内递送和/或定位。帽可存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或可存在于两个末端。帽结构是本领域熟知的，包括例如反向脱氧无碱基帽。可用于使反义化合物的一端或两端具帽以赋予核酸酶稳定性的其他3’和5’稳定基团包括在2013年1月16日公开的WO 03/004602中公开的那些。
细胞培养和反义化合物处理
可以在多种细胞类型中在体外对反义化合物对共济失调蛋白2核酸的水平、活性或表达的作用进行测试。用于这样的分析的细胞类型可得自供应商(例如美国菌种保藏中心，Manassus，VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；Clonetics Corporation,Walkersville,MD)，并根据供应商的说明书使用市售试剂(例如，Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)来培养。示例性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞和原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外测试
本文描述了用反义寡核苷酸处理细胞的方法，可以对所述反义寡核苷酸进行适当修饰以用其他反义化合物处理。
当培养的细胞达到大约60至80％汇合时，可以用反义寡核苷酸处理细胞。
通常用于向培养细胞中引入反义寡核苷酸的一种试剂包括阳离子脂质转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可以将反义寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的期望终浓度，并且LIPOFECTIN浓度范围可为2至12ug/mL/100nM反义寡核苷酸。
用于向培养细胞中引入反义寡核苷酸的另一种试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1低血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的期望浓度，并且LIPOFECTAMINE浓度范围可以为2至12ug/mL/100nM反义寡核苷酸。
用于向培养细胞中引入反义寡核苷酸的另一种技术包括电穿孔。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可以在反义寡核苷酸处理后16至24小时收获细胞，此时通过本文所述和本领域已知的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。一般而言，当进行多次重复处理时，数据表示为重复处理的平均值。
细胞系与细胞系之间使用的反义寡核苷酸的浓度不同。用于确定针对特定细胞系的反义寡核苷酸最佳浓度的方法是本领域熟知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，通常以1nM至300nM的浓度范围使用反义寡核苷酸。当采用电穿孔转染时，以625到20,000nM的较高浓度使用反义寡核苷酸。
RNA分离
可对细胞总RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法是本领域熟知的。使用本领域中熟知的方法来制备RNA，例如根据制造商的推荐规程使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
靶水平或表达的抑制的分析
可以以本领域中已知的多种方式对共济失调蛋白2核酸的水平或表达的抑制进行测定。例如，可通过例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或定量实时PCR来对靶核酸水平进行定量。可对细胞总RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法是本领域熟知的。Northern印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR可使用可购自PE-Applied Biosystems,Foster City,CA的市售ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测***并根据制造商的说明书使用来方便地实现。
靶RNA水平的定量实时PCR分析
靶RNA水平的定量可以使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测***(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根据制造商的说明书通过定量实时PCR来完成。定量实时PCR的方法是本领域熟知的。
在实时PCR之前，对分离的RNA进行逆转录酶(RT)反应，产生互补DNA(cDNA)，该cDNA随后用作实时PCR扩增的底物。在相同的样品孔中依次进行RT和实时PCR反应。RT和实时PCR试剂可获自Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT实时-PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)靶标数量使用其表达恒定的基因(例如亲环素A)的水平来归一化，或者通过采用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来归一化。亲环素A表达通过实时PCR、通过与靶标同时、复用或单独运行来进行定量。总RNA使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)来定量。Jones,L.J.等(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)中教导了通过RIBOGREEN进行RNA定量的方法。使用CYTOFLUOR4000仪器(PE Applied Biosystems)来测量RIBOGREEN荧光。
探针和引物被设计用于与共济失调蛋白2核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法是本领域熟知的，并且可以包括使用软件例如PRIMER EXPRESS软件(AppliedBiosystems,Foster City,CA)。
蛋白质水平分析
可以通过测量共济失调蛋白2蛋白质水平来评估共济失调蛋白2核酸的反义抑制。共济失调蛋白2蛋白质水平可以以本领域熟知的多种方式来评价或定量，例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如，胱天蛋白酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光激活细胞分选(FACS)。针对靶标的抗体可以识别并获自多种来源，例如MSRS抗体目录(AerieCorporation,Birmingham,MI)，或者可通过本领域中熟知的常规单克隆抗体或多克隆抗体产生方法来制备。
反义化合物的体内测试
在动物中对反义化合物(例如，反义寡核苷酸)进行测试以评估其抑制共济失调蛋白2表达并产生表型改变(例如改进的运动功能和认知)的能力。在某些实施方案中，通过对动物的行走起动分析、旋转杆、握力、爬杆、旷场表现、平衡木、后爪足迹测试来测量运动功能。
测试可以在正常的动物或实验性疾病模型中进行。为了施用于动物，将反义寡核苷酸配制在药学上可接受的稀释剂(例如磷酸盐缓冲盐水)中。施用包括肠胃外施用途径，例如腹膜内、静脉内和皮下。反义寡核苷酸的剂量和给药频率的计算在本领域技术人员的能力范围内，并且取决于诸如施用途径和动物体重的因素。用反义寡核苷酸治疗一段时间后，从CNS组织或CSF分离RNA并测量共济失调蛋白2核酸表达的变化。
某些适应症
在某些实施方案中，本文提供了用于治疗个体的方法、化合物和组合物，包括施用本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，个体患有神经变性疾病。在某些实施方案中，个体处于产生神经变性疾病的风险之中，所述神经变性疾病包括但不限于脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。在某些实施方案中，个体已被鉴定为患有共济失调蛋白2相关疾病。在某些实施方案中，本文提供了用于在个体中预防性降低共济失调蛋白2表达的方法。某些实施方案包括通过向有此需要的个体施用治疗有效量的靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物来治疗该个体。
在一个实施方案中，在个体中施用治疗有效量的靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物伴随着共济失调蛋白2水平的监测，以确定个体对所述反义化合物施用的响应。医师可利用个体对施用所述反义化合物的响应来确定治疗性干预的量和持续时间。
在某些实施方案中，施用靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物导致共济失调蛋白2表达降低至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或者由这些数值中的任何两个限定的范围。在某些实施方案中，在动物中施用靶向共济失调蛋白2核酸的反义化合物导致改善的运动功能。在某些实施方案中，施用共济失调蛋白2反义化合物将运动功能改善至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或者由这些数值中的任何两个限定的范围。
在某些实施方案中，将包含靶向共济失调蛋白2的反义化合物的药物组合物用于制备用于治疗患有或易患神经变性疾病的患者的药物，所述神经变性疾病包括脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森症。
实施例
非限制性公开内容和通过引用并入
虽然根据某些实施方案对本文所述的某些化合物、组合物和方法进行了特别描述，但下述实施例仅用于对本文所述的化合物进行解释说明而无意于限制。本申请中引用的每个参考文献均通过引用整体并入本文。
实施例1：通过MOE缺口聚物对HepG2细胞中人共济失调蛋白2的反义抑制
设计靶向共济失调蛋白2核酸的反义寡核苷酸，并对其在体外对共济失调蛋白2mRNA的影响进行测试。在具有相似培养条件的一系列实验中对反义寡核苷酸进行测试。每个实验的结果示于如下所示的单独的表中。利用电穿孔用4,500nM的反义寡核苷酸转染以每孔20,000个细胞的密度培养的HepG2细胞。约24小时的处理时间后，从细胞中分离RNA并通过定量实时PCR测量共济失调蛋白2mRN A水平。使用人引物探针组RTS3642(正向序列ACCAAAGAGTAG TTAATGGAGGTGTTC，在本文中指定为SEQ ID NO:5；反向序列AGAAGGTGGGCGAGAGGAA，在本文中指定为SEQ ID NO:6；探针序列CTGGCCATCGCCTTGCCCA，在本文中指定为SEQ ID N O:7)来测量mRNA水平。根据如通过测量的RNA总含量来调节共济失调蛋白2mRNA水平。结果表示为共济失调蛋白2相对于未经处理对照细胞的抑制百分比。
下表中的嵌合反义寡核苷酸设计为5-10-5MOE缺口聚物。该缺口聚物的长度为20个核苷，其中中间的缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成，并通过在5’方向和3’方向侧接分别包含5个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷均具有2’-MOE修饰。贯穿每个缺口聚物的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键合。贯穿每个缺口聚物的所有胞嘧啶残基均为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示在人基因序列中缺口聚物所靶向的最靠5’-核苷。“终止站点”表示在人基因序列中缺口聚物所靶向的最靠3’-核苷。在下表中所列的每个缺口聚物都靶向在本文中指定为SEQ ID NO：1的人共济失调蛋白2mRNA(GENBANK登记号NM_002973.3)或者在本文中指定为SEQ ID NO：2的人共济失调蛋白2基因组序列(从核苷酸2465000至2616000截短的GENBANK登记号NT_009775.17的补体)。一些寡核苷酸不靶向SEQID NO：1或SEQ ID NO：2，而是靶向变体基因序列，SEQ ID NO：3(GENBANK登记号BX410018.2)。‘n/a’表示反义寡核苷酸不以100％的互补性靶向特定基因序列。
表1
通过靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物的共济失调蛋白2mRNA抑制
表2
通过靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚物的共济失调蛋白2mRNA抑制
表3
通过靶向SEQ ID NO:3的5-10-5MOE缺口聚物的共济失调蛋白2mRNA抑制
实施例2：通过MOE缺口聚物在HepG2细胞中人共济失调蛋白2的剂量依赖性反义抑制
选择来自实施例1表现出显著的共济失调蛋白2mRNA体外抑制的缺口聚物并在HepG2细胞中以多种剂量进行测试。以每孔20,000个细胞的密度平板接种细胞，并利用电穿孔用0.625μM、1.250μM、2.500μM、5.000μM和10.000μM的反义寡核苷酸浓度进行转染，如在下表中指定的。在约16小时的处理时间后，从细胞中分离RNA并通过定量实时PCR测量共济失调蛋白2mRNA水平。使用人引物探针组RTS3642测量mRNA水平。根据如通过测量的RNA总含量来调节共济失调蛋白2mRNA水平。结果表示为共济失调蛋白2相对于未经处理对照细胞的抑制百分比。
还示出了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在经反义寡核苷酸处理的细胞中，共济失调蛋白2mRNA水平以剂量依赖性的方式显著降低。
表4
剂量响应测定
实施例3：在SCA2BAC小鼠模型中人共济失调蛋白2的反义抑制
选择来自实施例1表现出显著的共济失调蛋白2mRNA体外抑制的缺口聚物并在SCA2[Q22]-BAC小鼠模型中于体内进行测试。该小鼠模型创建于Pulst实验室(Universityof Utah,Salt Lake City)，其使用FVB/B6杂交背景小鼠进行脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)的研究。这些小鼠具有整个176kb人ATXN2基因区，包括16kb的上游序列和2.5kb的下游序列。
处理
分别通过脑室内注射向3只小鼠的组施用生理盐水(0.9％)或反义寡核苷酸。向五到七周龄小鼠分别输注氧气和3％异氟烷的混合物，进行3-4分钟以引起镇静作用。然后用剪切工具除去头皮上的毛发。将小鼠放置在立体定位仪(仅用于小鼠的Stoelting)中。首先用碘擦洗，然后用70％乙醇清洗头皮。用#10解剖刀刀片从眼之间的位置后方的区到后部1.5cm的区形成切口。用无菌棉签除去骨膜。将具有26号针头的Hamilton注射器放置在立体定位仪的针托中并用生理盐水(0.9％)或反义寡核苷酸(250μg)在盐水(0.9％)中的溶液填充到10μL刻度。将针定位在头骨上的前囟，然后置于向右1mm和向后0.46mm。这样将针的尖端刚好***头骨，然后定位2.5mm向下进入右侧脑室。之后压低注射器的活塞以递送5-7μL的期望体积。等待4分钟以使心室压力均衡，然后移除针并缝合头皮。然后用聚乙烯吡咯酮溶液处理切口并将小鼠送回其笼中仰卧以便恢复。每天监测小鼠。
RNA分析
7天后，将小鼠置于异氟醚中直到它们不再呼吸。然后取出脑。在冠状区收集三份脑，包括用于RNA分析的一个3mm区。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从30mg组织中分离RNA。用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)产生cDNA。通过SYBR Green法用iCycler(Bio-Rad公司)在96孔板(一式四份)标准曲线进行实时PCR(qPCR)。反应为20μL，由15ng的cDNA、2μL的每种引物(0.3μM终浓度)和10μL的SYBR Green Master Mix(Bio-Rad)组成。循环参数包括95°变性步骤进行10秒，在退火温度孵育20秒，并在72°进行第二孵育40秒。各平板包括使用从多个pGL2-5A3转基因小鼠制备的小脑RNA标准曲线。通过变性分析和凝胶电泳验证单个扩增子。
来自小鼠和人共济失调蛋白2的RNA分析结果示于下表中。如所指示，一些ISIS寡核苷酸在小鼠的脑中减少人共济失调蛋白2mRNA。
表5
在SCA[Q22]-BAC小鼠中与盐水(0.9％)对照相比共济失调蛋白2mRNA的抑制百分比
实施例4：在ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的反义抑制
选择来自实施例1表现出显著的共济失调蛋白2mRNA体外抑制的缺口聚物并在ATXN2-Q127小鼠模型中于体内进行测试。该小鼠模型(Hansen,S.T.等，Human.MolecularGenetics 2012.1-13)在Purkinje细胞蛋白质-2(Pcp2)启动子的调节下表达全长突变体ATXN2Q127互补DNA。该模型示出早发型进展性运动受损表型伴随小脑Purkinje细胞中弥散性细胞质聚集体的形成。
处理
分别通过脑室内注射向3只小鼠的组施用生理盐水(0.9％)或反义寡核苷酸。向五到七周龄小鼠分别输注氧气和3％异氟烷的混合物，进行3-4分钟以引起镇静作用。然后用剪切工具除去头皮上的毛发。将小鼠放置在立体定位仪(仅用于小鼠的Stoelting)中。首先用碘擦洗，然后用70％乙醇清洗头皮。用#10解剖刀刀片从眼之间的位置后方的区到后部1.5cm的区形成切口。用无菌棉签除去骨膜。将具有26号针头的Hamilton注射器放置在立体定位仪的针托中并用生理盐水(0.9％)或反义寡核苷酸(250μg)在盐水(0.9％)中的溶液填充到10μL刻度。将针定位在头骨上的前囟，然后置于向右1mm和向后0.46mm。这样将针的尖端刚好***头骨，然后定位2.5mm向下进入右侧脑室。之后压低注射器的活塞以递送5-7μL的期望体积。等待4分钟以使心室压力均衡，然后移除针并缝合头皮。然后用聚乙烯吡咯酮溶液处理切口并将小鼠送回其笼中仰卧以便恢复。每天监测小鼠。
RNA分析
7天后，将小鼠置于异氟醚中直到它们不再呼吸。然后取出脑。在冠状区收集三份脑，包括用于RNA分析的一个3mm区。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从30mg组织中分离RNA。用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)产生cDNA。通过SYBR Green法用iCycler(Bio-Rad)在96孔板(一式四份)标准曲线进行实时PCR(qPCR)。反应为20μL，由15ng的cDNA、2μL的每种引物(0.3μM终浓度)和10μL的SYBR Green Master Mix(Bio-Rad公司)组成。循环参数包括95°变性步骤进行10秒，在退火温度孵育20秒，并在72°进行第二孵育40秒。各平板包括使用从多个pGL2-5A3转基因小鼠制备的小脑RNA标准曲线。通过变性分析和凝胶电泳验证单个扩增子。用管家基因肌动蛋白对所有mRNA水平进行归一化。
来自小鼠和人共济失调蛋白2的RNA分析结果示于下表中。如所指示，一些ISIS寡核苷酸在小鼠的脑中减少人共济失调蛋白2mRNA。
还进行了小胶质细胞增生(microgliosis)标记物AIF/Iba1的qPCR分析以测量炎症。结果示于下表中。
表6
在ATXN2-Q127小鼠中与盐水(0.9％)对照相比共济失调蛋白2mRNA的抑制百分比
表7
在ATXN2-Q127小鼠中与盐水(0.9％)对照相比Iba1mRNA水平
的增加百分比
实施例4：ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的剂量依赖性反义抑制
在ATXN2-Q127小鼠模型中对不同剂量的ISIS 564133进行测试。
处理
分别通过脑室内注射向3只小鼠的组施用生理盐水(0.9％)或ISIS 564133，剂量为50μg、100μg、200μg、250μg或300μg。以与该研究中所述相同的方式对小鼠进行施用并每天进行监测。
RNA分析
7天后，将小鼠置于异氟醚中直到它们不再呼吸。然后取出脑。在冠状区收集三份脑，包括用于RNA分析的一个3mm区，如上所述。用管家基因肌动蛋白对所有mRNA水平进行归一化。
来自小鼠和人共济失调蛋白2的RNA分析结果示于下表中。
表8
在ATXN2-Q127小鼠中与盐水(0.9％)对照相比共济失调蛋白2mRNA的抑制百分比
实施例5：在ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的时间依赖性反义抑制
施用ISIS 564133，并在ATXN2-Q127小鼠模型中于不同时间点测试mRNA水平的降低
处理
分别通过脑室内注射向3只小鼠的组施用生理盐水(0.9％)或ISIS 564133，剂量为200μg。以与该研究中所述相同的方式对小鼠进行施用并每天进行监测。
RNA分析
9天、18天、27天和84天后，将小鼠组置于异氟醚中直到它们不再呼吸。然后取出脑。在冠状区收集三份脑，包括用于RNA分析的一个3mm区，如上所述。用管家基因肌动蛋白对所有mRNA水平进行归一化。
来自人共济失调蛋白2的RNA分析结果示于下表中。进行相应蛋白质样品的Western分析并确认qPCR结果。
表9
ATXN2-Q127小鼠中的共济失调蛋白2mRNA水平
| 时间点 | 相对于肌动蛋白的ATXN2表达 |
| 盐水(0.9％)对照 | 8.4 |
| 9天 | 2.9 |
| 18天 | 0.9 |
| 27天 | 1.4 |
| 84天 | 2.7 |
使用内部产生的兔抗寡核苷酸抗体在第7天进行小脑Purkinje细胞的免疫组化染色。结果示出ISIS寡核苷酸位于ATXN-Q127小鼠的小脑Purkinje细胞中。
实施例6：在ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的反义抑制的作用
向ATXN2-Q127小鼠模型和野生型小鼠施用ISIS寡核苷酸。在第3天，利用旋转杆测试评价运动能力。
以与上述研究中所述相同的方式通过脑室内注射向ATXN2-Q127小鼠组施用50μg、100μg或200μg生理盐水(0.9％)或ISIS564133。以与上述研究中所述相同的方式通过脑室内注射向野生型小鼠组施用200μg生理盐水(0.9％)或ISIS寡核苷酸。以与上述研究中所述相同的方式通过脑室内注射向ATXN2-Q127小鼠组施用200μg生理盐水(0.9％)或ISIS546127或ISIS 564216。6周后，对小鼠进行旋转杆测试。
旋转杆测定
在Rotamex旋转杆上进行加速旋转杆测定。进行旋转杆测试超过五天。在第一天，通过触摸小鼠使小鼠适应技术员。在第二天，在4分钟范例中将小鼠引入旋转杆，所述4分钟范例包括2分钟的10RPM恒定速度，然后2分钟的10至30RPM范围的速度。第3-5天的测试是相同的，其中，将小鼠放置在0RPM速度的旋转杆上，然后经6分钟将旋转杆加速到40RPM。每天进行两次，并记录每天的“掉落等待时间”的平均值，以秒为单位。将掉落等待时间定义为动物从旋转杆落下之前的时间量。当小鼠不再中断旋转杆上方的红外光线时自动记录。还自动记录第一次被动旋转的时间(小鼠停止行走，抓杆并随杆旋转时)，该时间一般反映掉落等待时间。这项研究包括每次连续三次5分钟试验，每次试验之间有20分钟的休息时间。在第3-5天，在每天进行的两次重复测试之间让小鼠休息1.5-2小时。
旋转杆测试的结果列于下表中。如下表所示，用ASO处理将旋转杆性能提高多达约20％。
表10
ATXN2-Q127小鼠的旋转杆性能测试
实施例7：在ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的反义抑制的作用
向ATXN2-Q127小鼠模型和野生型小鼠施用ISIS寡核苷酸。评估共济失调蛋白2以及若干Purkinje细胞(PC)基因的小脑表达。
以与上述研究中所述相同的方式通过脑室内注射向ATXN2-Q127小鼠组施用200μg生理盐水(0.9％)或ISIS 564133。以与上述研究中所述相同的方式通过脑室内注射向野生型小鼠组施用200μg生理盐水(0.9％)或ISIS 564133。5周后，对小鼠实施安乐死并评估多种基因mRNA水平的小脑表达。
RNA分析
将小鼠组置于异氟烷中直至它们不再呼吸。然后取出脑。在冠状区收集三份脑，包括用于RNA分析的一个3mm区，如上所述。用管家基因肌动蛋白对所有mRNA水平进行归一化。测量人共济失调蛋白2、鼠共济失调蛋白2、Pcp2、Calb1、Rgs8和Fam107b的RNA水平。已证实这些PC特异性基因中的一些的转录变化以进展性减少SCA2模型(Hansen,S.T.等，Hum.Mol.Genet.2013.22:271-283)。
RNA分析的结果示于下表中，并且证实用靶向共济失调蛋白2的ISIS寡核苷酸处理与转基因对照组相比提高所有PC特异性基因的表达水平。
表11
ATXN2-Q127小鼠中的PC-特异性mRNA水平
实施例8：在ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的反义抑制的作用
向ATXN2-Q127小鼠模型和野生型小鼠施用ISIS寡核苷酸。使用旋转杆测试评价运动性能。
以与上述研究中所述相同的方式通过脑室内注射向ATXN2-Q127小鼠(7.5周龄)组施用200μg生理盐水(0.9％)或ISIS 546127或ISIS 564216。5周和9周后，对小鼠进行旋转杆测试。
旋转杆测定
在Rotamex旋转杆上进行加速旋转杆测定。进行旋转杆测试超过五天。在第一天，通过触摸小鼠使小鼠适应技术员。在第二天，在4分钟范例中将小鼠引入旋转杆，所述4分钟范例包括2分钟的10RPM恒定速度，然后2分钟的10至30RPM范围的速度。第3-5天的测试是相同的，其中，将小鼠放置在0RPM速度的旋转杆上，然后经6分钟将旋转杆加速到40RPM。每天进行两次，并记录每天的“掉落等待时间”的平均值，以秒为单位。将掉落等待时间定义为动物从旋转杆落下之前的时间量。当小鼠不再中断旋转杆上方的红外光线时自动记录。还自动记录第一次被动旋转的时间(小鼠停止行走，抓杆并随杆旋转时)，该时间一般反映掉落等待时间。这项研究包括每次连续三次5分钟试验，每次试验之间有20分钟的休息时间。在第3-5天，在每天进行的两次重复测试之间让小鼠休息1.5-2小时。
旋转杆测试的结果列于下表中。如下表所示，用ASO处理在第5周将旋转杆性能提高多达约20％，并且在第9周提高约27％。
表12
ATXN2-Q127小鼠的旋转杆性能测试(掉落的平均等待时间，按秒计)
实施例9：在ATXN2-Q127小鼠模型中人共济失调蛋白2的反义抑制的作用
在ATXN2-Q127小鼠模型中施用ISIS寡核苷酸。使用旋转杆测试评价运动性能。
对7周龄ATXN2-Q127小鼠进行旋转杆测试，然后分成两组，每组30只小鼠，使得两组的平均旋转杆性能、平均体重和性别组成相同。在8周龄时，一组小鼠通过脑室内(ICV)注射接受生理盐水，一组通过ICV注射接受210μg ISIS 564216，以与上述研究中所述相同的方式给药。5周后(13周龄)，再次对小鼠进行旋转杆测试。注射后6周(14周龄)，小鼠接受第2次ICV注射，与在8周龄时接受的注射相同。5周后(19周龄，第一次ICV注射后11周)，对小鼠进行第三次旋转杆测试。
旋转杆测试
在Rotamex旋转杆上进行加速旋转杆测定。进行旋转杆测试超过五天。在第一天，通过触摸小鼠三次，每次5分钟，使小鼠适应技术员。在第二天，将小鼠引入旋转杆三次，每次10分钟，速度范围是0至10RPM。第3-5天的每一天将小鼠放置在0RPM速度的旋转杆上，然后经6分钟将旋转杆加速到40RPM，每只小鼠进行三次。使用每天三次总试验来计算每天“掉落等待时间”的平均值，以秒为单位。将掉落等待时间定义为动物从旋转杆落下之前的时间量。当小鼠不再中断旋转杆上方的红外光线时自动记录。还自动记录第一次被动旋转的时间(小鼠停止行走，抓杆并随杆旋转时)，该时间一般反映掉落等待时间。
旋转杆测试的结果在下表中表示为每个处理组的平均值。如下表所示，用ASO处理提高了旋转杆性能。
表13
ATXN2-Q127小鼠的旋转杆性能测试
Claims (24)
1.一种化合物，其包含经修饰寡核苷酸，所述经修饰寡核苷酸由12至30个相连的核苷组成并且具有含SEQ ID NO:11-165的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
2.根据权利要求2所述的化合物，其中所述经修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其由单链经修饰寡核苷酸组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷酸间键合是经修饰核苷酸间键合。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中至少一个经修饰核苷酸间键合是硫代磷酸酯核苷酸间键合。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中每个经修饰核苷酸间键合是硫代磷酸酯核苷酸间键合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷酸间键合是磷酸二酯核苷酸间键合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷酸间键合是硫代磷酸酯键，至少一个核苷酸间键合是磷酸二酯键。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷包含经修饰核碱基。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中所述经修饰核碱基是5-甲基胞嘧啶。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述经修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含经修饰糖。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述至少一个经修饰糖是双环糖。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述双环糖包含4’-CH(R)-O-2’桥，其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中R是甲基。
15.根据权利要求13所述的化合物，其中R是H。
16.根据权利要求11所述的化合物，其中所述至少一个经修饰糖包含2’-O-甲氧基乙基。
17.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述经修饰寡核苷酸包含：
由10个相连的脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个相连的核苷组成的5’翼区段；和
由5个相连的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于5’翼区段与3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰糖。
18.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述经修饰寡核苷酸由20个相连的核苷组成。
19.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的化合物或其盐和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
20.一种方法，其包括向动物施用前述权利要求中任一项所述的化合物或组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述动物是人。
22.根据权利要求20和21所述的方法，其中所述施用所述化合物预防、治疗、改善或减缓共济失调蛋白2相关疾病、病症或病状的进展。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或帕金森症。
24.前述权利要求中任一项所述的化合物或组合物用于制备用于治疗神经变性病症的药物的用途。
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