CN106093017A - 一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液 10~200mmol/L、氯化钴0.01~1.00 mmol/L、稳定剂1~10g/L，其溶剂为纯化水，试剂R2：Na2HPO4 10~200mmol/L、显色剂0.1~3.0g/L、稳定剂 1~10g/L，其溶剂为纯化水，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测血清样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的缺血修饰白蛋白的浓度。本发明具有准确度高等优点。

Description

一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法。
背景技术
心肌缺血时，人血清白蛋白通过缺血部位时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，其氨基末端被修饰，这种N-末端被损害或被铜占据的白蛋白称为缺血修饰白蛋白（IMA），其特点是N-末端和钴等过渡金属离子的结合率下降,心肌缺血5-10min，缺血修饰白蛋白即可在血液中检出，1-2h达高峰，3-6h回到基础水平。
缺血修饰白蛋白是急性冠脉综合征（ACS）诊断的生物标志,ACS具有发病急、变化快、临床表现与危险性不均一等特征，早期诊断困难,传统的生物标志物如肌钙蛋白（cTn）、肌红蛋白（Myo）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）只有在心肌发生坏死时才升高，但这时已给患者带来了不可逆的病理损害,因此，急需一种可以反映心肌缺血的早期敏感的生化指标用于早期诊断，而缺血修饰白蛋白是近年来的研究热点，为ACS早期诊断的研究开辟了新的道路。
缺血修饰白蛋白对ACS患者心肌缺血检出的灵敏度是ECG的2倍、cTn的4倍,缺血修饰白蛋白是检测冠脉痉挛导致缺血的生化标志物。
缺血修饰白蛋白不仅可以用于ACS患者的早期诊断，还可以用于冠脉事件即PCI术后判断指标。无侧支循环患者的IMA值明显高于有侧支循环者，IMA值升高与病变严重程度相关。
缺血修饰白蛋白值可作为早期辨别急性脑卒中生化标志物，脑出血发作初期，其中位数水平增加。
目前检测缺血修饰白蛋白的主要方法有比色法，但是比色法所用的显色物质不稳定，准确度不够高，需要进行改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术稳定性差、准确度不高的缺陷，而提供一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 10~200mmol/L
氯化钴 0.01~1.00 mmol/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 10~200mmol/L
显色剂 0.1~3.0g/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100mmol/L
氯化钴 0.50 mmol/L
稳定剂 5g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 100mmol/L
显色剂 1.5g/L
稳定剂 5g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的稳定剂为叠氮钠。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的显色剂为二硫苏糖醇。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的稳定剂为叠氮钠。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液的pH值为6～9。
作为优选，本发明还公开了上述测定缺血修饰白蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 10~200mmol/L
氯化钴 0.01~1.00 mmol/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 10~200mmol/L
显色剂 0.1~3.0g/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水。
（b）将待测血清样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的缺血修饰白蛋白的浓度。
本发明的检测原理是：血清中HAS与Co2+结合后剩余的游离钴Co2+与有机显色物反应生成红褐色产物，在505nm的波长下闭塞，其吸光度与Co2+浓度成正比，从而计算求的血清样本中IMA的浓度。
样本中IMA浓度
式中：ΔAT 以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS 以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS 校准液中IMA的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明所述的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒通过添加稳定剂，可以促使整个试剂盒的稳定性的提高，也就利于整个试剂盒的测定准确度以及精密度的提高，另外通过使用二硫苏糖醇作为显色剂，使得游离钴Co2+与有机显色物产生的有色物质显色更明显，测定更灵敏，存在更稳定，测定的准确度也就更高。
具体实施方式
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 100mmol/L
氯化钴 0.50 mmol/L
叠氮钠 5g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 100mmol/L
二硫苏糖醇 1.5g/L
叠氮钠 5g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液 200mmol/L
氯化钴 1.00 mmol/L
叠氮钠 1g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 10mmol/L
二硫苏糖醇 3.0g/L
叠氮钠 10g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 100mmol/L
氯化钴 0.50 mmol/L
叠氮钠 5g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 100mmol/L
二硫苏糖醇 1.5g/L
叠氮钠 5g/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长505nm、副波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应。
3、检测步骤
（a） 取225ul试剂R1与30ul待测血清样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入75ul试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)
根据
样本中IMA浓度计算出样本中的缺血修饰白蛋白的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液 200mmol/L
氯化钴 1.00 mmol/L
叠氮钠 1g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Na2HPO4 10mmol/L
二硫苏糖醇 3.0g/L
叠氮钠 10g/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长505nm、副波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应。
3、检测步骤
（a） 取225ul试剂R1与30ul待测血清样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入75ul试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)
根据样本中IMA浓度计算出样本中的缺血修饰白蛋白的浓度。
表1为实施例1所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的缺血修饰白蛋白的浓度为56U/mL，测定结果见表1:
表1
第1次（U/mL） 第2次（U/mL） 第3次（U/mL） 均值（U/mL） 偏差（%）
实施例1 55 55 54 54.67 2.38
实施例2 58 58 57 57.67 2.98
由表1可知，本发明所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的缺血修饰白蛋白的浓度为78U/mL，测定结果见表2：
表2
第1次（U/mL） 第2次（U/mL） 第3次（U/mL） 均值（U/mL） 偏差（%）
实施例1 78 78 76 77.33 0.86
实施例2 80 79 81 80.00 2.56
由表2可知，本发明所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定缺血修饰白蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 10~200mmol/L
氯化钴 0.01~1.00 mmol/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Na2HPO4 10~200mmol/L
显色剂 0.1~3.0g/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100mmol/L
氯化钴 0.50 mmol/L
稳定剂 5g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Na2HPO4 100mmol/L
显色剂 1.5g/L
稳定剂 5g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的稳定剂为叠氮钠。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的显色剂为二硫苏糖醇。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的稳定剂为叠氮钠。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液的pH值为6～9。
8.根据权利要求1或2所述的一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 10~200mmol/L
氯化钴 0.01~1.00 mmol/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Na2HPO4 10~200mmol/L
显色剂 0.1~3.0g/L
稳定剂 1~10g/L
其溶剂为纯化水
（b）将待测血清样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的缺血修饰白蛋白的浓度。
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