CN104596959A - 一种基于dna酶检测钾离子浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法。包括：配制标准溶液DNA酶体系；配制待测溶液DNA酶体系；配制标准溶液及待测溶液；测量标准溶液在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线；测量待测溶液的吸光度，根据标准曲线，得到待测样品中钾离子的浓度。本发明利用DNA酶特异识别钾离子调控的G-四链体结构，可在生理钠离子浓度下操作而不受影响，对钾离子特异性高；使用DNA酶设计的探针，对钾离子调控的G-四链体结构变化十分敏感，伴有颜色的改变，同时在紫外吸收光谱中有明显的变化；只需要紫外吸收光谱仪，测试成本低；所用试剂品种少，只需按比例混合就可检测，操作简单、快捷且成本低廉，该体系在缓冲液中操作，环保无污染。

Description

一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法。

背景技术

人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重要指标。尿液、血清中钾离子的含量水平在临床上可用了诊断一些肾脏、心脏等方面的疾病。

正常情况下，人体的钾离子浓度有一个合理的参考范围，如血清中：3.5～5.5mmol/L；尿液中25～125mmol/24h。当钾离子含量高于参考值时，表现出高钾症，其原因主要有：急性肾功能衰竭、严重溶血或组织损伤、急性酸中毒或组织缺氧、肾上腺皮质功能减退、醛固酮缺乏、长期应用利尿剂、家族性高血钾等。血清钾高还可引起严重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性应激紊乱，以及特异的心电图改变。血清钾高于7mmol/L时，就有这些现象出现，超过10mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而导致死亡。反之，当钾的摄入量不足、钾丢失严重、肾脏疾病转入多尿期等情况时则会出现低钾症。

现有技术中测定钾离子浓度的方法主要有：中子活化法、同位素稀释质谱法、化学测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。

(1)火焰光度法：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na⁺和K⁺，该方法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。通常采用的定量方法有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内标，测定的是锂/钾电流的比值，而不是单独钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。

(2)离子选择电极法(ISE法)：在专用仪器上进行血清和尿液的钾、钠离子测定。因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是：离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分采用间接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。目前主要的电极种类有：玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K⁺电极。这些电极都具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化，且价格昂贵。

(3)化学测定法：目前K⁺的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。

(4)酶法：酶法测定钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶Ⅰ的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。

(5)原子分光光度法也可用于检测血清中钾、钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火焰光度法简便。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法。

本发明所提供的基于DNA酶检测钾离子浓度的方法，包括下述：

(1)配制标准溶液DNA酶体系

用含钠离子的缓冲液溶解可溶性钾盐配置多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入DNA，得到多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系；所述多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系反应后，得到多个构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向各个所述DNA G-四链体的体系中加入氯化血红素，得到氯化血红素含量相同的多个DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述多个DNA G-四链体-氯化血红素体系反应后，得到多个标准溶液DNA酶体系；所述DNA为能够形成G-四链体的DNA；

(2)配制待测溶液DNA酶体系

将待测样品加入到所述含钠离子的缓冲液，得到待测样品溶液，向所述待测样品溶液中加入所述DNA，得到待测样品-DNA体系，所述待测样品-DNA体系中所述DNA的含量与所述多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系中所述DNA的含量相同；所述待测样品-DNA体系反应后，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入氯化血红素，反应后，得到DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述多个DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同；所述DNA G-四链体-氯化血红素体系反应后，得到待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液及待测溶液的配制

将2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐ABTS溶液与H₂O₂混合，得到混合液，将该混合液称为底物溶液，向所述多个标准溶液DNA酶体系中的每一个标准溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到多个标准溶液样本；向所述待测溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到待测溶液样本；

(4)标准曲线的制备

测量所述多个标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线；

(5)待测样本检测

测量所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据所述标准曲线，得到所述待测样品中钾离子的浓度。

上述方法所述(1)中，所述多个可为2个以上，如7个。

上述方法所述(1)中，所述含钠离子的缓冲液通过下述至少一种缓冲液制备得到：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

所述含钠离子的缓冲液的pH值为6.2-8.2。

所述钠离子来源于可溶性钠盐，如氯化钠、溴化钠、碘化钠和硝酸钠。

所述可溶性钾盐的非限制性实例包括：氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、溴化钾或碘化钾。

上述方法所述(1)中，所述能够形成G-四链体的DNA选自下述至少一种：GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG(核苷酸序列如序列表中序列1所示)、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列2所示)和TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列3所示)。

上述方法所述(2)中，所述待测样品为人或动物的血液、尿液或其他体液。

上述方法所述(3)中，所述混合液中的ABTS与H₂O₂的摩尔浓度比为0.1～50，如0.2～10，具体可为5.8。

所述标准溶液样本中的钠离子浓度可为大于0小于等于30mmol/L，如10mmol/L-25mmol/L，具体可为10mmol/L、11mmol/L、13mmol/L、19mmol/L或23mmol/L。

所述标准溶液样本中的DNA分子的浓度可为0.01～10μmol/L，如0.1～2μmol/L，具体可为0.1μmol/L、0.3μmol/L、0.7μmol/L、0.8μmol/L、0.45μmol/L或1.8μmol/L。

所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度可为0.01～10μmol/L，如0.1～2μmol/L，具体可为0.2μmol/L、0.4μmol/L或0.48μmol/L。

上述方法所述(1)、(2)和(3)中，所述反应的时间均为0.1-3小时。

上述方法所述(3)中，所述待测溶液样本中的钠离子浓度、DNA分子的浓度、和氯化血红素的浓度分别与所述标准溶液样本中的钠离子浓度、DNA分子的浓度、和氯化血红素的浓度相等。

本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钾离子浓度，例如，可以检测人或动物血液、尿液或其他体液中的钾离子浓度。

本发明的方法的主要优点在于：

1)本发明利用DNA酶特异识别钾离子调控的G-四链体构象变化，可在生理钠离子浓度下操作而不受影响，对钾离子特异性高；

2)本发明使用DNA酶设计的探针，对钾离子调控的G-四链体构象变化十分敏感，伴有颜色的改变，同时在紫外吸收光谱中展现出明显的变化；

3)本发明所设计的探针，只需要紫外吸收光谱仪，测试成本低廉，便于行业内推广应用；

4)本发明所用试剂成分只有4～5种，只需按比例混合就可检测，操作简单、快捷且成本低廉，该体系在缓冲液环境中操作，环保无污染；

5)本发明所用试剂成分简单、种类少，相互之间不会产生影响，且稳定性好，可长时间储存，能很好保证应用测试效果；

6)应用本发明提供的检测方法可以用来测定人体和其它动物体内钾离子的含量，也可用来检测水质等其他样本中的钾离子水平。

附图说明

图1为标准溶液样本中钠离子浓度为10mmol/L时，钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线。

图2为标准溶液样本中钠离子浓度为13mmol/L时，钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线。

图3为标准溶液样本中钠离子浓度为11mmol/L时，钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线。

图4为标准溶液样本中钠离子浓度为19mmol/L时，钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线。

图5为标准溶液样本中钠离子浓度为23mmol/L时，钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线。

图6为标准溶液样本中钠离子浓度为23mmol/L时，钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用于测量吸光值的仪器为安捷伦-可见光谱仪(Agilent 8453UV-visible spectrophotometer)；Hitachi F4500spectrofluorometer(Japan)。能够形成G-四链体的DNA均购自上海生工生物技术有限公司。

实施例1

对两个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样1为26.2mmol/L、尿样2为18.4mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列2所示)。

将0.1μmolDNA样品溶解于1mL不含金属离子的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配制。

(1)配制标准溶液DNA酶

用28.5μL含有17.5mmol/L钠离子的Tris-HCl缓冲溶液溶解可溶性钾盐配制多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入1.5μL 100μmol/L的DNA母液，反应3小时，得到一系列构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20μL的10μmol/L的氯化血红素溶液，反应0.1-3小时，得到50μL一系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；

(2)配制待测溶液DNA酶

将9μL尿样1加入到19.5μL含有25.6mmol/L钠离子Tris-HCl缓冲溶液中，向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA，反应3小时，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入和步骤(1)相同量的氯化血红素，反应3小时，得到50μL待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液和待测溶液的配制

取225μL 105mmol/L的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)加入3375μL Tris-HCl(含有12mmol/L Na⁺)，平均分到9个管里，每份400μL，在每份中随后加入50μL 9mmol/L的H₂O₂，形成显色底物。将步骤(1)和步骤(2)的50μL含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系加入上述显色底物，反应10分钟，得到标准溶液样本和待测溶液样本。(其中，所述标准溶液样本钾离子浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8mmol/L，标准溶液样本和待测溶液样本中，DNA分子的浓度均为0.3μmol/L，氯化血红素的浓度均为0.4μmol/L)

(4)标准曲线的制备

测量所述标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线，如图1。

(5)待测样本检测

测试所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，将测得的吸光度与步骤(4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，得到所述待测溶液样本中的钾离子浓度，结合尿液1的稀释比例(所述待测溶液样本中尿液1占1.8％)，计算出尿液1中的钾离子浓度为25.3mmol/L，与尿样1中钾离子的实际浓度(26.2mmol/L)吻合。

重复上述操作，测得尿液2中的钾离子浓度为19.3mmol/L，与尿样2中钾离子的实际浓度(18.4mmol/L)吻合。

实施例2

对两个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样3为32.7mmol/L、尿样4为11.4mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG(核苷酸序列如序列表中序列1所示)。

将0.1μmol DNA样品溶解于1mL不含金属离子的咪唑-盐酸缓冲液(pH7.4)中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配置。

(1)配制标准溶液DNA酶

用29.5μL含有22mmol/L钠离子的咪唑-盐酸缓冲液溶解可溶性钾盐配制多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入0.5μL 100μmol/L的DNA母液，反应2小时，得到一系列构象不同的DNA G-四链体的体系；分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20μL的12μmol/L的氯化血红素溶液，反应2小时，得到一系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；

(2)配制待测溶液DNA酶

将20μL尿样3加入到9.5μL含有68.4mmol/L钠离子的咪唑-盐酸缓冲溶液中，向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA，反应2小时，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入和步骤(1)相同量的氯化血红素，反应2小时，得到待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液和待测溶液的配制

取225μL 105mmol/L的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)加入3375μL咪唑-盐酸(含有15.6mmol/L Na⁺)，平均分到9个管里，每份400μL，在每份中随后加入50μL 9mmol/L的H₂O_2，形成显色底物。将步骤(1)和步骤(2)的50μL含G-四链体-氯化血红素DNA酶体系加入上述显色底物，反应10分钟，得到标准溶液样本和待测溶液样本。(其中，标准溶液样本中钾离子浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8mmol/L，标准溶液样本和待测溶液中DNA分子的浓度均为0.1μmol/L、氯化血红素的浓度均为0.48μmol/L)

(4)标准曲线的制备

测量所述标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线，如图2。

(5)待测样本检测

测试所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，将测得的吸光度与步骤(4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，得到所述待测溶液样本中的钾离子浓度，结合尿液3的稀释比例(所述待测样本溶液中尿液3占4％)，计算出尿液3中的钾离子浓度为31.4mmol/L，与尿样3中钾离子的实际浓度(32.7mmol/L)吻合。

重复上述操作，测得尿液4中的钾离子浓度为10.5mmol/L，与尿样4中钾离子的实际浓度(11.4mmol/L)吻合。

实施例3

对两个尿液样本的钾离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钾离子浓度如下：尿样5为16.8mmol/L、尿样6为23.2mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列3所示)。

将0.05μmol DNA样品溶解于1mL不含金属离子的三乙醇胺缓冲液(pH7.4)中，制备浓度为50μmol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配置。

(1)配置标准溶液DNA酶

用25.5μL含有21.5mmol/L钠离子的三乙醇胺缓冲溶液溶解可溶性钾盐配制多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入4.5μL 50μmol/L的DNA母液，反应1小时，得到一系列构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20μL的5μmol/L的氯化血红素溶液，反应1小时，得到50μL一系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；

(2)配制待测溶液DNA酶

将18μL尿样5加入到7.5μL含有73.1mmol/L钠离子的三乙醇胺缓冲溶液中，向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA，反应0.1-3小时，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入和步骤(1)相同量的氯化血红素，反应0.1-3小时，得到50μL待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液和待测溶液的配制

取225μL 105mmol/L的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)加入3375μL三乙醇胺(含有13.2mmol/L Na⁺)，平均分到9个管里，每份400μL，在每份中随后加入50μL 9mmol/L的H₂O₂，形成显色底物。将步骤(1)和步骤(2)的50μL含G-四链体-氯化血红素DNA酶体系加入上述显色底物，反应5分钟，得到标准溶液样本和待测溶液溶液。(其中，标准溶液样本钾离子浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8mmol/L，标准溶液样本和待测溶液样本中，DNA分子的浓度均为0.45μmol/L，氯化血红素的浓度均为0.2μmol/L)

(4)标准曲线的制备

测量标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线，如图3。

(5)待测样本检测

测试所述标准溶液样本在420nm处的吸光度，将测得的吸光度与步骤(4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，得到所述待测溶液样本中的钾离子浓度，结合尿液5的稀释比例(待测样本溶液中尿液5占3.6％)，计算出尿液5中的钾离子浓度为15.4mmol/L，与尿样5中钾离子的实际浓度(16.8mmol/L)吻合。

重复上述操作，测得尿液6中的钾离子浓度为21.8mmol/L，与尿样6中钾离子的实际浓度(23.2mmol/L)吻合。

实施例4

对两个血清样本的钾离子浓度进行验证，各血清样本的实际钾离子浓度如下：血清样1为2.5mmol/L、血清样2为4.1mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列2所示)。

将0.1μmol DNA样品溶解于1mL不含金属离子的双甘氨肽缓冲液(pH7.4)中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配置。

(1)配置标准溶液DNA酶

用26.5μL含有35.8mmol/L钠离子的双甘氨肽缓冲溶液溶解可溶性钾盐配制多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入3.5μL 100μmol/L的DNA母液，反应3小时，得到一系列构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入24μL的10μmol/L的氯化血红素溶液，反应3小时，得到50μL一系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；

(2)配制待测溶液DNA酶

将22.5μL血清1加入到4μL含有237.5mmol/L钠离子双甘氨肽缓冲溶液中，向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA，反应3小时，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入和步骤(1)相同量的氯化血红素，反应3小时，得到50μL待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液和待测溶液的配制

取225μL 105mmol/L的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)加入3375μL三乙醇胺(含有22.8mmol/L Na⁺)，平均分到9个管里，每份400μL，在每份中随后加入50μL 9mmol/L的H₂O₂，形成显色底物。将步骤(1)和步骤(2)的50μL含G-四链体-氯化血红素DNA酶加入上述显色底物，反应15分钟，得到标准溶液样本和待测溶液样本。(其中，标准溶液样本钾离子浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8mmol/L，标准溶液样本和待测溶液样本中，DNA分子的浓度均为0.7μmol/L，氯化血红素的浓度均为0.48μmol/L)

(4)标准曲线的制备

测量标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线，如图4。

(5)待测样本检测

测试所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，将测得的吸光度与步骤(4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，得到所述待测溶液样本中的钾离子浓度，结合血清1的稀释比例(待测样本溶液中血清1占4.5％)，计算出血清1中的钾离子浓度为2.7mmol/L，与血清1中钾离子的实际浓度(2.5mmol/L)吻合。

重复上述操作，测得血清2中的钾离子浓度为3.9mmol/L，与血清2中钾离子的实际浓度(4.1mmol/L)吻合。

实施例5

对两个血清样本的钾离子浓度进行验证，各血清样本的实际钾离子浓度如下：血清样3为8.4mmol/L、血清样4为6.4mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG(核苷酸序列如序列表中序列1所示)。

将0.1μmol DNA样品溶解于1mL不含金属离子的三乙醇胺缓冲液(pH7.4)中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配置。

(1)配置标准溶液DNA酶

用26μL含有44.2mmol/L钠离子的三乙醇胺缓冲溶液溶解可溶性钠盐配制多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入4μL 100μmol/L的DNA母液，反应3小时，得到一系列构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20μL的10μmol/L的氯化血红素溶液，反应3小时，得到50μL一系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；

(2)配制待测溶液DNA酶

将7.5μL血清3加入到18.5μL含有62.2mmol/L钠离子三乙醇胺缓冲溶液中，向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA，反应3小时，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入和步骤(1)相同量的氯化血红素，反应3小时，得到50μL待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液和待测溶液的配制

取225μL 105mmol/L的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)加入3375μL三乙醇胺(含有27.6mmol/L Na⁺)，平均分到9个管里，每份400μL，在每份中随后加入50μL 9mmol/L的H₂O₂，形成显色底物。将步骤(1)和步骤(2)的50μL含G-四链体-氯化血红素DNA酶加入上述显色底物，反应4分钟，得到标准溶液样本和待测溶液样本。(其中，标准溶液样本钾离子浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8mmol/L，标准溶液样本和待测溶液样本中，DNA分子的浓度均为0.8μmol/L，氯化血红素的浓度均为0.4μmol/L)

(4)标准曲线的制备

测量所述标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线，如图5。

(5)待测样本检测

测试所述待测溶液样在420nm处的吸光度，将测得的吸光度与步骤(4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，得到所述待测溶液样本中的钾离子浓度，结合血清3的稀释比例(待测样本溶液中血清3占1.5％)，计算出血清3中的钾离子浓度为8.7mmol/L，与血清3中钾离子的实际浓度(8.4mmol/L)吻合。

重复上述操作，测得血清4中的钾离子浓度为6.7mmol/L，与血清4中钾离子的实际浓度(6.4mmol/L)吻合。

实施例6

对两个血清样本的钾离子浓度进行验证，各血清样本的实际钾离子浓度如下：血清样5为5.2mmol/L、血清样6为7.2mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列3所示)。

将0.1μmol DNA样品溶解于1mL不含金属离子的Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中，制备浓度为100μmol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配置。

(1)配置标准溶液DNA酶

用21μL含有54.8mmol/L钠离子的Tris-HCl缓冲溶液溶解可溶性钠盐配制多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入9μL 100μmol/L的DNA母液，反应3小时，得到一系列构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向所述DNA G-四链体的体系中的每一个中加入20μL的10μmol/L的氯化血红素溶液，反应3小时，得到50μL一系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；

(2)配制待测溶液DNA酶

将15μL血清5加入到6μL含有191.7mmol/L钠离子Tris-HCl缓冲溶液中，向得到的溶液中加入和步骤(1)相同量的DNA，反应3小时，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入和步骤(1)相同量的氯化血红素，反应3小时，得到50μL待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液和待测溶液的配制

取225μL 105mmol/L的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)加入3375μL Tris-HCl(含有27.6mmol/L Na⁺)，平均分到9个管里，每份400μL，在每份中随后加入50μL 9mmol/L的H₂O₂，形成显色底物。将步骤(1)和步骤(2)的50μL含G-四链体-氯化血红素DNA酶加入上述显色底物，反应13分钟，得到标准溶液样本和待测溶液样本。(其中，标准溶液样本钾离子浓度分别为0、0.5、1、2、4、6、8mmol/L，标准溶液样本和待测溶液样本中，DNA分子的浓度均为1.8μmol/L，氯化血红素的浓度均为0.4μmol/L)

(4)标准曲线的制备

测量标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线，如图6。

(5)待测样本检测

测试所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，将测得的吸光度与步骤(4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，得到所述待测溶液样本中的钾离子浓度，结合血清5的稀释比例(待测样本溶液中血清5占3％)，计算出血清5中的钾离子浓度为4.9mmol/L，与血清5中钾离子的实际浓度(5.2mmol/L)吻合。

重复上述操作，测得血清6中的钾离子浓度为7.7mmol/L，与血清6中钾离子的实际浓度(7.2mmol/L)吻合。

本发明的显著特色之一是：体系本身可带有一定量的钠离子，这种情况可保证样本中钠离子所能引起的环境的变化忽略不计；

本发明的显著特色之二是：使用DNA酶做为探针的识别基团，反应灵敏度高。

总之，实验证明本发明的测定方法，可通过吸收强度的变化来判断钾离子浓度水平的高低。

Claims (5)

1.一种基于DNA酶检测钾离子浓度的方法，包括下述：

(1)配制标准溶液DNA酶体系

用含钠离子的缓冲液溶解可溶性钾盐配置多个浓度梯度的钾离子溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入DNA，得到多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系；所述多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系反应后，得到多个构象不同的DNA G-四链体的体系，分别向各个所述DNA G-四链体的体系中加入氯化血红素，得到氯化血红素含量相同的多个DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述多个DNAG-四链体-氯化血红素体系反应后，得到多个标准溶液DNA酶体系；所述DNA为能够形成G-四链体的DNA；

(2)配制待测溶液DNA酶体系

将待测样品加入到所述含钠离子的缓冲液，得到待测样品溶液，向所述待测样品溶液中加入所述DNA，得到待测样品-DNA体系，所述待测样品-DNA体系中所述DNA的含量与所述多个DNA含量相同的钾离子-DNA体系中所述DNA的含量相同；所述待测样品-DNA体系反应后，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入氯化血红素，反应后，得到DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述多个DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同；所述DNA G-四链体-氯化血红素体系反应后，得到待测溶液DNA酶体系；

(3)标准溶液及待测溶液的配制

将2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐ABTS溶液与H₂O₂混合，得到混合液，将该混合液称为底物溶液，向所述多个标准溶液DNA酶体系中的每一个标准溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到多个标准溶液样本；向所述待测溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到待测溶液样本；

(4)标准曲线的制备

测量所述多个标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钾离子浓度与吸光强度值的标准曲线；

(5)待测样本检测

测量所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据所述标准曲线，得到所述待测样品中钾离子的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述(1)中，所述含钠离子的缓冲液通过下述至少一种缓冲液制备得到：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

所述含钠离子的缓冲液的pH值为6.2-8.2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述能够形成G-四链体的DNA选自下述至少一种：GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG和TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述(3)中，所述混合液中的2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐与H₂O₂的摩尔浓度比为0.1～50；

所述标准溶液样本中的钠离子浓度为大于0小于等于30mmol/L；

所述标准溶液样本中的DNA分子的浓度为0.01μmol/L～10μmol/L；

所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度可为0.01μmol/L～10μmol/L。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述(2)中，所述待测样品为人或动物体液。