CN106086189A - 一种提高数据均一性的rad建库方法 - Google Patents

一种提高数据均一性的rad建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高数据均一性的RAD建库方法。它包括内切酶的选择消化、磁珠纯化和筛选、末端修复加A碱基、加测序接头、磁珠纯化、PCR扩增、样品浓度检测、样品混池。本发明方法PCR扩增效率高，得到的DNA测序数据均一性好，可以满足自然群体或者家系的遗传学分析。

Description

一种提高数据均一性的RAD建库方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体的说，它涉及一种提高数据均一性的RAD建库方法。
背景技术
随着2005年高通量二代测序的兴起，从基因组DNA层面研究家系和自然群体的遗传规律、进化规律以及种属的鉴定已经成为分子生物学领域的主流研究手段，但是鉴于测序成本的高企以及一些复杂物种的全基因组序列未知，科学家建立了一种和基因组限制性内切酶酶切位点相关联的简化基因组(Restriction-site associated DNA，简称RAD)建库方法来克服以上两点障碍。
RAD建库方法是允许多个样品(如12/24/36/48/96)混池测序，现行的简化基因组测序，数据均一性不好，混池的样品测序数据量和预期的有一定的波动，部分样品数据量比预期的多，部分数据量比预期的少，造成后续信息分析质量不佳。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明采用单个样品建库，PCR后根据特异性引物的种类来进行混池，避免PCR扩增时的扩增不均一性和操作误差带来的差异性，提供一种使用和DNA II型限制性内切酶酶切位点相关联的基因组DNA片段来构建测序文库的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明是一种提高数据均一性的RAD建库方法，包括以下步骤：
(1)内切酶的选择消化：在0.2ml PCR管中取总量1ug、浓度为25ng/ul、体积40ul的基因组DNA样本，加入1ul DNA II型限制性内切酶、5ul内切酶缓冲 液、4ul去离子水，在37℃孵育15分钟，然后65℃孵育15分钟；
(2)磁珠纯化和筛选：将步骤(1)的酶切产物补去离子水至100ul，加入45ul的DNA纯化磁珠，漩涡混匀，室温静置5分钟，然后将0.2ml PCR管置于磁力架上，待液体澄清，将上清液转移至新的0.2ml PCR管，加入20ul DNA纯化磁珠，室温静置5分钟，加入当天配置的80％乙醇清洗磁珠两遍，弃掉上清液，让磁珠风干，然后用55.5ul的不含核酸酶的去离子水洗脱DNA；
(3)末端修复加A碱基：向步骤(2)得到的DNA中加入3ul末端修复加A碱基的混合酶液和6.5ul末端修复加A碱基酶缓冲液，在20℃孵育30分钟，65℃孵育30分钟；
(4)加测序接头：向步骤(3)得到产物中加入15ul TA连接酶混合液、2.5ul DNA测序接头和1ul增强连接混合液，20℃孵育15分钟，然后用DNA纯化磁珠纯化产物；
(5)PCR扩增：取出步骤(4)中得到的产物15ul到新的0.2ml的PCR管中，再加入25ul的PCR高保真聚合酶混合液、5ul特异性引物和5ul PCR通用引物，混匀后置于PCR仪上进行反应；
(6)向步骤(5)中加入DNA纯化磁珠进行纯化；
(7)样品浓度检测：向步骤(6)中得到的DNA用特异性荧光定量仪进行浓度测定；
(8)样品混池：根据PCR特异性引物的种类和样品的浓度以及测序要求的数据量来确定不同的样品混池的个数和质量比。
作为优化，所使用的DNA II型限制性内切酶为四碱基内切酶，规格为10,000U/ml。
作为优化，所述步骤(2)中，所述DNA纯化磁珠为美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)生产的DNA纯化磁珠。
作为优化，所述步骤(3)中，所述末端修复加A碱基的混合酶液和末端修复加A碱基酶缓冲液均为美国新英格兰生物实验公司(New England Biolabs)试剂盒产品。
作为优化，所述步骤(7)中，所述的特异性荧光定量仪检测试剂盒为美国生命科学公司(Life Technologies)生产的高灵敏性荧光定量试剂盒。
作为优化，PCR仪温度设定程序如下：
作为优化，所述步骤(1)中，在37℃孵育15分钟后，取1.5ul酶切产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
作为优化，所述步骤(2)中，加入当天配置的80％乙醇为200ul。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明无需特异性的合成和酶切位点黏性末端互补的测序接头。
2、本发明中的四碱基II型限制型内切酶可以根据物种的不同和酶切位点的偏好来选择合适的内切酶，灵活性较高。
3、本发明方法使用的酶切片段通过末端修复加A碱基再加接头的方法，接头的连接效率高，提高单个样品的数据均一性。
4、本发明方法使用磁珠纯化和筛选代替琼脂糖电泳回收，可以节省操作的时间，缩短建库周期。
5、本发明方法使用单个样品建库，然后再混池的方法，可以很大程度上避免测序数据的不均一。
附图说明
图1：本发明的建库流程图；
图2：利用本方法的MseI(四碱基II型限制型内切酶)酶切片段和现有RAD建库方法的EcorI(六碱基II型限制型内切酶)酶切片段分布图；其中，3为DNA Marker(DNA片段大小标准参考)，1为MseI酶切片段，2为EcorI酶切片段。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行进一步详细说明：
优选试剂：此处实施采用优选试剂，但其它公司的试剂也能够实现。
四碱基II型限制性内切酶，规格为10,000U/ml；
DNA纯化磁珠，美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)生产；
末端修复加A碱基的混合酶液，美国新英格兰生物实验公司(New EnglandBiolabs)试剂盒产品；
末端修复加A碱基酶缓冲液，美国新英格兰生物实验公司(New England Biolabs)试剂盒产品；
特异性荧光定量仪检测试剂盒，美国生命科学公司(Life Technologies)生产的高灵敏性荧光定量试剂盒；
本实施例是一种提高数据均一性的RAD建库方法，包括以下步骤：
(1)内切酶的选择消化：在0.2ml PCR管中取总量1ug、浓度为25ng/ul、体积40ul的玉米基因组DNA样本，加入1ul DNA四碱基II型限制性内切酶、5ul内切酶缓冲液、4ul去离子水，在37℃孵育15分钟，然后取1.5ul酶切产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后65℃孵育15分钟；
(2)磁珠纯化和筛选：将步骤(1)的酶切产物补去离子水至100ul，加入45ul的DNA纯化磁珠，漩涡混匀，室温静置5分钟，然后将0.2ml PCR管置于磁力架上，待液体澄清，将上清液转移至新的0.2ml PCR管，加入20ul DNA纯化磁珠，室温静置5分钟，加入当天配置的80％乙醇200ul清洗磁珠两遍，弃掉上清液，让磁珠风干，然后用55.5ul的不含核酸酶的去离子水洗脱DNA；
(3)末端修复加A碱基：向步骤(2)得到的DNA中加入3ul末端修复加A碱基的混合酶液和6.5ul末端修复加A碱基酶缓冲液，在20℃孵育30分钟，65℃孵育30分钟；
(4)加测序接头：向步骤(3)得到产物中加入15ul TA连接酶混合液、2.5ul DNA测序接头和1ul增强连接混合液，20℃孵育15分钟，然后用DNA纯化磁珠纯化产物；
(5)PCR扩增：取出步骤(4)中得到的产物15ul到新的0.2ml的PCR管中，再加入25ul的PCR高保真聚合酶混合液、5ul特异性引物和5ul PCR通用引物，混匀后置于PCR仪上进行反应；PCR仪温度设定程序如下：
其中，特异性引物，是为区分不同样品设计的特异标识单个样品的引物，用于在美国测序公司Illumina生产的测序仪上测序后筛选数据。
(6)向步骤(5)中加入DNA纯化磁珠进行纯化；
(7)样品浓度检测：向步骤(6)中得到的DNA用特异性荧光定量仪进行浓度测定；
(8)样品混池：根据PCR特异性引物的种类和样品的浓度以及测序要求的数据量来确定不同的样品混池的个数和质量比。
图2为利用本方法的MseI(四碱基II型限制型内切酶)酶切片段和现有RAD建库方法的EcorI(六碱基II型限制型内切酶)酶切片段分布图，用到的DNA组织样本为玉米的基因组DNA，图中1的酶切片段主带分布在400bp，酶切片段更集中，不需要超声波打断，2的酶切片段主带分布大于1517bp，酶切片段比较分散，需要进行额外的超声波打断仪打断。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在0.2ml PCR管中取总量1ug、浓度为25ng/ul、体积40ul的基因组DNA样本，加入1ulDNA II型限制性内切酶、5ul内切酶缓冲液、4ul去离子水，在37℃孵育15分钟，然后65℃孵育15分钟；
(2)将步骤(1)的酶切产物补去离子水至100ul，加入45ul的DNA纯化磁珠，漩涡混匀，室温静置5分钟，然后将0.2ml PCR管置于磁力架上，待液体澄清，将上清液转移至新的0.2mlPCR管，加入20ul DNA纯化磁珠，室温静置5分钟，加入当天配置的80％乙醇清洗磁珠两遍，弃掉上清液，让磁珠风干，然后用55.5ul的不含核酸酶的去离子水洗脱DNA；
(3)向步骤(2)得到的DNA中加入3ul末端修复加A碱基的混合酶液和6.5ul末端修复加A碱基酶缓冲液，在20℃孵育30分钟，65℃孵育30分钟；
(4)向步骤(3)得到产物中加入15ul TA连接酶混合液、2.5ul DNA测序接头和1ul增强连接混合液，20℃孵育15分钟，然后用DNA纯化磁珠纯化产物；
(5)取出步骤(4)中得到的产物15ul到新的0.2ml的PCR管中，再加入25ul的PCR高保真聚合酶混合液、5ul PCR特异性引物和5ulPCR通用引物，混匀后置于PCR仪上进行反应；
(6)向步骤(5)中加入DNA纯化磁珠进行纯化；
(7)向步骤(6)中得到的DNA用特异性荧光定量仪进行浓度测定；
(8)根据PCR特异性引物的种类和样品的浓度以及测序要求的数据量来确定不同的样品混池的个数和质量比。
2.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所使用的DNAII型限制性内切酶为四碱基内切酶，规格为10,000U/ml。
3.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述DNA纯化磁珠为美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)生产的DNA纯化磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述末端修复加A碱基的混合酶液和末端修复加A碱基酶缓冲液均为美国新英格兰生物实验公司(New England Biolabs)试剂盒产品。
5.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述的特异性荧光定量仪检测试剂盒为美国生命科学公司(Life Technologies)生产的高灵敏性荧光定量试剂盒。
6.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所述步骤(5)中，PCR仪温度设定程序如下：
7.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在37℃孵育15分钟后，取1.5ul酶切产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
8.根据权利要求1所述的一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入当天配置的80％乙醇为200ul。
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