CN111172157B - 人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒 - Google Patents

人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒。所述试剂盒包含线粒体基因组全环扩增引物、单细胞裂解液，高通量文库构建的末端修复、磷酸化、3’加腺苷酸组分，高通量文库构建的接头以及正、反向文库扩增引物等。本方法在基于线粒体基因组完整全环扩增的体系中实现了单个或几个细胞线粒体基因组DNA的高通量测序文库构建，同时规避了常规单细胞扩增体系带来的高脱靶率，高比例假阳性位点检出率，从而在单细胞层面摒除了线粒体突变检测中的大量弊端，实现了高灵敏度，精确度检测；同时由于本方法采用线粒体全环全长扩增的方式，可以在检出突变位点的同时，发现线粒体DNA的大片段重复和缺失。

Description

人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库 构建的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒。
背景技术
线粒体基因组(mtDNA)是细胞的第二套遗传物质。人类线粒体基因组为16569bp，呈双链环状，双链为H链和L链，包括37个基因，编码13种蛋白质及D环的非编码区。mtDNA易受外界环境影响，突变率比核基因组高10～20倍；由于mtDNA的基因排列紧凑，基因间区只有87bp，因此任何突变都可能影响基因组的某一重要功能区。同时，mtDNA为裸露分子，没有组蛋白保护，且位于线粒体内膜附近，直接暴露呼吸链代谢产生的超氧离子和自由基中，极易受氧化损伤，且缺乏有效损伤修复能力。
线粒体基因组突变导致的疾病发病率和死亡率高，如Leber遗传性视神经病(LHON)、肌阵挛性癫痫伴碎红肌纤维病(MERRF)、眼肌麻痹综合征(Kearns-Sayre)、线粒体肌病脑病伴乳酸中毒(MELAS综合征)等。虽有部分报道显示，父系也可能将部分线粒体信息传递给子代，但线粒体基因组大多为母系遗传，因此，母体***中致病的线粒体基因组突变将直接遗传给其所有的儿女，而其女儿会将这些致病突变继续传递给下一代；据统计，大约每200个新生儿中就有1个带有可能致病的线粒体DNA突变，由于线粒体突变的瓶颈效应，致病突变可与健康的mtDNA共存于一个细胞或细胞群内；只有当突变频率越过阈值(60-85％)时，才会出现疾病临床征象；而mtDNA疾病的流行率在1/10000左右。
据FDA和HFEA研究报道，通过线粒体置换(mitochondrial replacement，MR)可以预防线粒体DNA疾病遗传风险，即通过从线粒体病患者的***中取出细胞核，然后将其植入另一个去除了细胞核的无线粒体疾病正常供体的***中。由此所获得含有母亲的细胞核DNA和另一名正常女性的线粒体DNA的***；而有报道称人自体颗粒细胞线粒体移植改善卵子质量和胚胎发育；以上种种涉及单细胞移植或线粒体移植的应用或研究提出了基于单细胞或少量细胞层面进行线粒体突变检测以及准确性的需求。
在常规细胞起始量如血液线粒体检测方案中，起始实验材料往往为通过基于醇沉淀的方法获得的核基因组DNA和mtDNA混合物，主要使用以下几种方法：1)通过使用多对引物，对线粒体基因组全环进行分段式扩增后并按一定比例混合扩增产物后，构建高通量测序文库。这种方法操作冗长，极其依赖于样本DNA提取前处理方式，且多对引物扩增得到的数个DNA片段受不同引物间扩增效率的影响，无法进行mtDNA大片段重复或缺失的分析，与此同时，核基因组中存在线粒体假基因，若引物扩增区域较短，引物极易与核基因组DNA结合，造成非特异扩增，实验结果无法排除假基因的干扰；无法准确诊断出线粒体疾病。值得一提的是，基于PCR方法进行扩增引物结合位置的碱基突变往往无法实现检出。2)部分商品化试剂盒针对人的线粒体基因组设计探针，基于文库构建联合线粒体探针液相杂交捕获的方式构建高通量测序文库以寻找可能的致病性mtDNA突变；这种方法操作，同样依赖于样本DNA提取前处理方式，是否可以获得完整的线粒体全环基因组；同样，由于线粒体基因组只占核基因组的1％不到，需要通过高通量文库的高循环数PCR循环将包含线粒体***片段在核基因的高度背景中富集出来并进行捕获，同时杂交捕获后的产物需要经过大量的PCR循环数扩增后才能满足高通量测序上机要求，这种方法同样无法进行mtDNA大片段重复或缺失的分析。
而单细胞或少量细胞的核基因组在皮克级别，线粒体基因组只有飞克级别，因此无法进行DNA提取前处理，只能通过基于MALBAC单细胞扩增或SMART单细胞扩增进行模板富集，而这两种单细胞扩增技术受随机引物脱靶率高，重复度高导致的假阳性位点极多等因素在实际应用中备受诟病；因此，亟需开发一种能够在单细胞层面进行特异性线粒体完整全环扩增，且可规避常规细胞起始量线粒体检测以及高通量测序中的种种弊端的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种人类线粒体全环扩增引物，包括2对引物，mtDNA-1F和mtDNA-1R以及mtDNA-2F和mtDNA-2R，它们的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1-2和SEQ ID NO:3-4所示。
其中，所述mtDNA-1F的5’端首个碱基与mtDNA-1R的5’端首个碱基在环状线粒体基因组上的结合位置相邻；在环状线粒体基因组进行反向扩增，其中，mtDNA-1F的核苷酸序列为：5’-GTTGCGGTCTGTTAGTAGTATAGTGATG-3’；mtDNA-1R的核苷酸序列为：5’-CTCAACACCACCTTCTTCGACC-3’；另一对人类线粒体全环扩增引物mtDNA-2F以及mtDNA-2R，所述mtDNA-2F的5’端首个碱基与mtDNA-2R的5’端首个碱基在环状线粒体基因组上的结合位置相邻；在环状线粒体基因组进行反向扩增，其中，mtDNA-2F的核苷酸序列为：5’-GGTTGTTTGGGTTGTGGCTCAG-3’；mtDNA-2R的核苷酸序列为：5’-CAGCTCTCCCTAAGCTTCAAAC-3’；四条引物的线粒体基因组结合位置没有重叠区；其中，mtDNA-1F/1R用于校准mtDNA-2F/2R结合位置的突变位点，mtDNA-2F/2R用于校准mtDNA-1F/1R结合位置的突变位点；
第二方面，本发明提供一种带有独立分子标签(UMI)的用于Illumina二代测序平台的测序接头，所述测序接头是由单链AS2和S2按等摩尔比混合退火而成的双链接头。
单链AS2的核苷酸序列为：5’-/PO4/-CATAGCTGANNNNCGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’；(SEQ ID NO:5)
单链S2的核苷酸序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCGMMMMTCAGCTATGT-3’；(SEQ ID NO:6)
其中，/PO4/表示磷酸化修饰；N、M各自独立地选自A、T、G或C；NNNN与MMMM互补配对，且NNNN不为AAAA或CCCC等碱基不平衡以及碱基排列汉明距离＜2的组合，MMMM不为AAAA或CCCC等碱基不平衡以及碱基排列汉明距离＜2的组合。即，NNNN及MMMM各自的碱基排列汉明距离≥2(表5)。
第三方面，本发明提供一种单细胞分离及裂解方法，所述方法包括：收集受试者的细胞，用透明质酸酶消化，取0.5ml消化后的细胞液，加入1ml含50％SSS的HTF培养液终止消化，350g离心1分钟，收集细胞沉淀，然后加入含10％SSS的HTF培养液，350g离心1分钟，用1ml含10％SSS的HTF培养液重悬细胞沉淀，用显微注射针逐个吸出细胞，加入到预先装有4μL DPBS缓冲液的EP管中，加入1M二硫苏糖醇溶液2.75μL和重组缓冲液DLB(凯杰Qiagen商品号150343)0.25μL；65℃反应10分钟。
本发明中，所述细胞来自人类***外周颗粒细胞、人类***外周滋养层细胞或人类***。
第四方面，本发明提供人类单细胞线粒体基因组全环扩增的方法，按照上述方法进行单细胞分离及裂解，将所得单细胞裂解液作为模板，分别利用引物mtDNA-1F/mtDNA-1R和mtDNA-2F/mtDNA-2R进行PCR扩增；
PCR反应体系如下：LongAmp Taq 2×Master Mix(NEB，商品号：M0287S)15μL，10μMmtDNA-1F和mtDNA-1R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL；或者，LongAmp Taq2×Master Mix(NEB，商品号：M0287S)15μL，10μM mtDNA-2F和mtDNA-2R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。可选地，单细胞裂解液可根据实际情况调整加入体积值，单细胞裂解液与无核酸酶水的体积之和为12μL。
PCR反应程序为：94℃60秒；94℃10秒，65℃16分钟，35个循环；65℃10分钟。
第五方面，本发明提供用于构建人类单细胞线粒体高通量测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含线粒体基因组全环扩增引物、单细胞裂解液，高通量文库构建的末端修复、磷酸化、3’加腺苷酸组分，高通量文库构建的接头以及正、反向文库扩增引物等。具体地，所述试剂盒包含如下成分中的至少一种：SEQ ID NO:1-4所示引物、SEQ ID NO:5-6所示测序接头、单细胞分离及裂解方法中使用的试剂，用于单细胞线粒体基因组全环扩增的酶和缓冲液，优选LongAmp Taq 2×Master Mix(NEB商品号M0287S)，用于PCR扩增产物纯化的试剂，优选QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰Qiagen商品号28106)。
第六方面，本发明提供所述试剂盒在人类单细胞线粒体高通量测序文库构建中的应用。
第七方面，本发明提供一种人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法，包括以下步骤：
1)按照上述方法进行人类单细胞线粒体基因组全环扩增，PCR扩增产物经纯化后，进行片段化处理，将片段化双链DNA依次进行平末端修复，5’末端磷酸化修饰和3’末端加单碱基A。
2)将步骤1)得到的DNA片段连接Illumina Truseq测序接头(优选SEQ ID NO:5-6所示测序接头)。
优选地，将步骤1)得到的DNA片段连接由单链AS2和S2按等摩尔比混合退火而成的双链接头。
3)以步骤2)得到的连接产物为模板，使用I5和I7标签化的Illumina文库扩增引物进行PCR扩增，得到高通量测序文库。
前述的方法，步骤1)使用超声片段化或酶切片段化对PCR扩增产物进行片段化；优选超声片段化。
利用T4 DNA聚合酶进行平末端修复。
利用T4多核苷酸激酶和三磷酸腺苷进行5’末端磷酸化修饰。
利用Klenow聚合酶进行3’末端加单碱基A。
步骤2)采用T-A连接方式将DNA片段与测序接头连接(利用T4 DNA连接酶进行连接)。
步骤3)利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，优选NEB Q5热启动DNA聚合酶或KAPA高保真热启动聚合酶。
步骤3)所用I5和I7标签化的Illumina文库扩增引物序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(i5)ACACTCTTTCCCTACACGAC-3’(i5代表Pooling测序中，P5端用于区分样本的Index)
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7)GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(i7代表Pooling测序中，P7端用于区分样本的Index)
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
利用本发明提供的人类线粒体完整全环扩增引物，单细胞裂解方法，校正方法设置方法以及文库构建方法，可以实现在单细胞层面对线粒体完整全环进行扩增，排除核基因组线粒体假基因干扰，通过两对全环引物，校正引物结合位置的真突变或假阳性位点；同时，UMI接头的引入大幅降低了由于Illumina测序平台自身测序错误率带来的假阳性位点的掺杂，实现对线粒体全环点突变，大片段重复缺失的精确检测；同时，本方法具有操作时间短，成本低，临床适用性强的优点。
本方法在基于线粒体基因组完整全环扩增的体系中实现了单个或几个细胞线粒体基因组DNA的高通量测序文库构建，同时规避了常规单细胞扩增体系带来的高脱靶率，高比例假阳性位点检出率，从而在单细胞层面摒除了线粒体突变检测中的大量弊端，实现了高灵敏度，精确度检测；同时由于本方法采用线粒体全环全长扩增的方式，可以在检出突变位点的同时，发现线粒体DNA的大片段重复和缺失。
附图说明
图1为本发明实施例1和实施例2颗粒细胞、***的两对引物扩增的线粒体全环产物电泳图。
图2A-图2D为本发明实施例1和实施例2颗粒细胞、***线粒体文库的安捷伦2200微电泳峰图。
图3A-图3D为本发明实施例1和实施例2颗粒细胞、***线粒体文库未去重的平均测序深度图。
图4A为本发明实施例1颗粒细胞两对全环扩增产物构建文库的突变位点韦恩图。
图4B为本发明实施例2***两对全环扩增产物构建文库的突变位点韦恩图。
图5为本发明实施例3颗粒细胞的两对引物扩增的线粒体全环产物电泳图。
图6A-图6D为本发明实施例3中4个颗粒细胞文库的安捷伦2200微电泳峰图。
图7A-图7D为本发明实施例3中4个颗粒细胞线粒体文库的去重后的平均测序深度图。
图8为本发明实施例3中4个颗粒细胞线粒体文库的突变位点韦恩图。
具体实施方式
本发明提供两对人类线粒体全环扩增引物mtDNA-1F/mtDNA-1R及mtDNA-2F/mtDNA-2R、一种单细胞分离后的裂解方法、一种用于校正单细胞扩增的分管扩增方法、一种单细胞裂解液进行线粒体基因组全环聚合酶链式(PCR)反应扩增体系和方法以及基于上述进行人类单细胞线粒体高通量测序文库构建的方法。
根据本发明的典型实施方式，提供了两对人类线粒体全环扩增引物mtDNA-1F/mtDNA-1R及mtDNA-2F/mtDNA-2R，所述mtDNA-1F的5’端首个碱基与mtDNA-1R的5’端首个碱基在环状线粒体基因组上的结合位置相邻；在环状线粒体基因组进行反向扩增，其中，mtDNA-1F的核苷酸序列为：5’-GTTGCGGTCTGTTAGTAGTATAGTGATG-3’；mtDNA-1R的核苷酸序列为：5’-CTCAACACCACCTTCTTCGACC-3’；另一对人类线粒体全环扩增引物mtDNA-2F以及mtDNA-2R，所述mtDNA-2F的5’端首个碱基与mtDNA-2R的5’端首个碱基在环状线粒体基因组上的结合位置相邻；在环状线粒体基因组进行反向扩增，其中，mtDNA-2F的核苷酸序列为：5’-GGTTGTTTGGGTTGTGGCTCAG-3’；mtDNA-2R的核苷酸序列为：5’-CAGCTCTCCCTAAGCTTCAAAC-3’；四条引物的线粒体基因组结合位置没有重叠区。
根据本发明的典型实施方式，提供一种单细胞分离后的裂解方法，收集患者的细胞，从中心培养皿吸出约0.5ml(含有透明质酸酶)，加入1毫升含50％SSS的输卵管液培养液HTF终止消化，350g离心1分钟，加入含10％SSS的HTF培养液，350g离心1分钟，用1毫升上述培养液重悬细胞沉淀，取出10微升加入培养皿盖，盖油，用显微注射内径20微升的针逐个吸出颗粒细胞，逐个加入到预先分装含有4微升杜氏磷酸缓冲液DPBS的0.2毫升EP管中，加入1摩尔/升的二硫苏糖醇2.75微升与重组缓冲液DLB(凯杰Qiagen商品号150343)0.25微升，总体积为7微升；65℃反应10分钟后，置于-80℃超低温冰箱速冻或直接进入后续反应；优选地，单细胞为人类***外周颗粒细胞、人类***外周滋养层细胞或人类***；
根据本发明的典型实施方式，提供一种用于校正单细胞扩增引物位置突变的校正方法，优选地，同一管单细胞裂解液混匀并迅速分为两管后，使用无重叠区域的两对引物mtDNA-1F/mtDNA-1R及mtDNA-2F/mtDNA-2R分别进行扩增反应。
根据本发明的典型实施方式，提供一种单细胞裂解液进行线粒体基因组全环聚合酶链式(PCR)反应扩增方法，所述PCR反应体系为：
LongAmp Taq 2×Master Mix(NEB，商品号：M0287S)15μL，10μM mtDNA-1F和mtDNA-1R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL；或者，LongAmp Taq2×MasterMix(NEB，商品号：M0287S)15μL，10μM mtDNA-2F和mtDNA-2R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
PCR反应程序为：94℃60秒；94℃10秒，65℃16分钟，35个循环；65℃10分钟。
本发明提供一种人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法，包括以下步骤；
1)将mtDNA-1F/mtDNA-1R和mtDNA-2F/mtDNA-2R扩增单细胞裂解液并纯化的PCR产物，分别进行片段化处理，将片段化双链线粒体DNA片段依次进行平末端修复，5’末端磷酸化修饰和3’末端加单碱基A；优选地，使用超声片段化或酶切片段化对PCR产物进行片段化；更优选地，片段化处理选择超声片段化仪；优选地，利用T4 DNA聚合酶进行平末端修复；利用T4多核苷酸激酶和三磷酸腺苷进行5’末端磷酸化修饰；利用Klenow聚合酶进行3’末端加单碱基A；
2)步骤1)得到的双链线粒体DNA片段经T-A连接方式连接Illumina Truseq测序接头；优选地，连接带有独立分子标签(Unique Molecular Index，UMI)的接头(如SEQ ID NO:5-6所示测序接头)；优选利用T4 DNA连接酶进行连接；
3)以步骤2)得到的连接产物为模板，使用I5和I7标签化的Illumina文库扩增引物进行PCR扩增，得到高通量测序文库；优选地，利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，优选NEBQ5热启动DNA聚合酶或KAPA高保真热启动聚合酶。
本发明还提供一种基于人类单细胞线粒体高通量测序文库构建方法的试剂盒，所述试剂盒包含如下成分中的至少一种：所述两对相互校正的人类线粒体全环扩增引物mtDNA-1F/1R及mtDNA-2F/2R、所述用于单细胞裂解的组分、所述用于单细胞线粒体基因组全环扩增的酶和缓冲液、所述用于PCR产物纯化的试剂、所述文库构建的酶，试剂，缓冲液等。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1单个颗粒细胞进行线粒体高通量测序文库构建的方法
本实施例采用显微操作分离的单个人***外周颗粒细胞进行线粒体高通量测序文库的构建。
具体操作步骤如下：
1、单细胞收集和裂解
收集病人的颗粒细胞，从中心培养皿吸出约0.5ml(含有透明质酸酶)，加入1毫升含50％SSS的输卵管液培养液HTF终止消化，350g离心1分钟，加入含10％SSS的HTF培养液，350g离心1分钟，用1毫升上述培养液重悬细胞沉淀，取出10微升加入培养皿盖，盖油，用显微注射内径20微升的针逐个吸出颗粒细胞，逐个加入到预先分装含有4微升杜氏磷酸缓冲液DPBS的0.2毫升EP管中，加入1摩尔/升的二硫苏糖醇2.75微升与重组缓冲液DLB(凯杰Qiagen商品号150343)0.25微升，总体积为7微升；65℃反应10分钟。
2、单细胞裂解液分管操作
使用10微升量程移液器将单细胞裂解液反复吸打10次后，短暂离心，迅速吸取3.5微升至另一0.2毫升离心管中，将细胞裂解液分为两管，管壁标记SCL1和SCL2；
3、单细胞扩增
管SCL1使用的扩增序列如下：
mtDNA-1F：5’-GTTGCGGTCTGTTAGTAGTATAGTGATG-3’；
mtDNA-1R：5’-CTCAACACCACCTTCTTCGACC-3’；
反应体系为：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-1F和mtDNA-1R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
管SCL2使用的扩增序列如下：
mtDNA-2F：5’-GGTTGTTTGGGTTGTGGCTCAG-3’；
mtDNA-2R：5’-CAGCTCTCCCTAAGCTTCAAAC-3’；
反应体系为：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-2F和mtDNA-2R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
管SCL1和管SCL2的PCR反应程序为：94℃60秒；94℃10秒，65℃16分钟，35个循环；65℃10分钟，4℃放置。
4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳
配制2％的琼脂糖凝胶，PCR产物3微升与3微升6×上样缓冲液溴酚蓝指示剂吹打10次充分混匀，瞬时离心后与λDNA HindIII maker(NEB，N3012L)分别加入点样孔；电泳程序执行：恒电压90V，电泳时间40分钟。
5、PCR产物回收
使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，商品号：28106)进行PCR产物回收，详细实验步骤严格参考试剂盒说明书；使用30微升EB buffer回溶(Qiagen，商品号：19086)。
6、PCR产物Qubit质检
使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒(Thermo，商品号：Q32850)进行回收PCR产物定量，详细实验步骤参考试剂盒说明书。
7、PCR产物进行高通量测序文库构建
1)PCR产物片段化
将纯化后的PCR产物稀释到5纳克/微升后，取20微升加入0.2ml PCR管中，置于超声波片段化仪中，设置片段化频率40KHz，片段化时间，第一个循环，5分钟开，5分钟关；第二个循环，3分钟开，3分钟关；第三个循环，3分钟开，3分钟关；第四个循环，5分钟开，5分钟关。
2)片段化产物末端修复，5’末端磷酸化，3’末端加腺苷酸
片段化后的PCR产物，直接加入KAPA HyperPlus文库构建试剂盒(Cat/No.KK8515)末端修复加A缓冲液3微升，KAPA HyperPlus末端修复加A酶2微升，用无核酸酶的去离子水补足至总体积30微升，轻柔震荡混匀后，将上述反应混合物20℃孵育10分钟，65℃孵育30分钟。
3)接头连接
使用的Truseq接头序列的双链信息如下：
第一核苷酸链AS1：5’-/PO4/-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’
第二核苷酸链S1：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
向上一步反应液中加入15微升KAPA HyperPlus连接缓冲液，2微升接头，5微升KAPA HyperPlus连接酶，并用无核酸酶的去离子水补足至总体积60微升。将上述反应混合物20℃反应40分钟；加入48微升(0.8倍反应体积)的Agencourt AMPure XP磁珠(BeckmanCoulter Cat/No.10453438)。吸打10次混匀，室温放置10分钟；置磁力架5分钟，移除上清；样品保持在磁力架上，小心加入200微升80％新鲜配制的乙醇，室温静置30s；移除上清，重复洗涤一次；开盖干燥4分钟；加入21微升无核酸酶的去离子水洗脱，室温孵育5分钟，置磁力架1分钟，吸取20微升上清到一个新的0.2毫升PCR管中。
4)文库扩增
所用引物序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(i5)ACACTCTTTCCCTACACGAC-3’(简称引物1，i5代表Pooling测序中，P5端用于区分样本的Index)
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7)GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(简称引物2，i7代表Pooling测序中，P7端用于区分样本的Index)
将上述引物稀释到10uM。
向上一步吸打混匀的磁珠中加入25微升2×KAPA HiFi热启动酶预混液，2.5微升引物1，2.5微升引物2。将上述混合反应液执行以下程序：1)98℃孵育45秒；2)98℃孵育15秒，60℃孵育30秒，72℃孵育30秒，10个循环；3)72℃孵育1分钟，4℃放置。
5)文库的纯化与质检
加入50微升(1.0倍反应体积)的Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman CoulterCat/No.10453438)。吸打10次混匀，室温放置10分钟；置磁力架5分钟，移除上清；样品保持在磁力架上，小心加入200微升80％新鲜配制的乙醇，室温静置30S；移除上清，重复洗涤一次；开盖干燥4分钟；加入21微升无核酸酶的去离子水洗脱，室温孵育5分钟，置磁力架1分钟，吸取20微升上清到一个新的0.2毫升PCR管中。使用Qubit dsDNABR Assay试剂盒(Thermo，商品号：Q32850)进行文库浓度定量，详细实验步骤参考试剂盒说明书。
8、高通量测序
将上一步纯化好的文库按照illumina HiseqX的操作步骤，进行高通量测序，设置每个文库的测序量为500M，即理论总测序深度在16000×左右，理论有效测序深度在13500×左右。
9、数据分析
1)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具将原始下机FASTQ文件进行格式转换；
2)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具对转换数据进行过滤，质控得到converted.fasta文件；
3)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具分析读段(reads)并与剑桥大学提供的人类线粒体基因组(rCRS)进行常规比对和基于覆盖度的COV比对；
4)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)分析线粒体SNP结果，并将SNP百分比＜2％的位点过滤。
10、结果分析
如图1中第一泳道(1)和第二泳道(2)所示，单个颗粒细胞分别经两对引物(mtDNA-1F/mtDNA-1R与mtDNA-2F/mtDNA-2R)扩增的片段大小约为16Kb左右，与线粒体全长16569bp理论片段大小符合，Marker选择为λDNA经HindIII酶切片段Marker；
如图2A和图2B所示，单个颗粒细胞分别使用两对引物扩增的PCR产物经文库构建后，经安捷伦2200微电泳凝胶结果显示，文库大小在460bp左右，***片段为350-367bp左右，呈illumina标准文库峰型分布；
如图3A和图3B所示，Illumina PE150模式，3.4M原始读段(Raw reads)的测序量下，单个颗粒细胞分别使用两对引物扩增的PCR产物构建的文库的平均测序深度均在15000×以上；
如图4A所示，单个颗粒细胞分别使用两对引物扩增的PCR产物构建的文库中，32个突变频率为100％的纯质性突变位点在两个文库中全部检出，同时在每个文库中分别检测到的异质性位点(>2％)分别为64个和59个，将上述结果综合后得到单个颗粒细胞的全部纯质性突变位点和异质性突变位点结果为155个；值得注意的是，这些突变位点中，突变频率低于20％的位点可能存在illumina测序平台在高深度测序下的测序错误位点掺杂，即假阳性位点；
如表1和表2所示，单个颗粒细胞分别使用两对引物扩增的PCR产物构建的文库测序结果通过NextGeNe软件得到突变位点信息和频率。
表1颗粒细胞mt1F/1R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000111
Figure BDA0002378359240000121
Figure BDA0002378359240000131
表2颗粒细胞mt2F/2R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000132
Figure BDA0002378359240000141
Figure BDA0002378359240000151
注：本发明表格中：代表碱基缺失。
实施例2单个***进行线粒体高通量测序文库构建的方法
本实施例采用显微操作分离的病人的单个***细胞进行线粒体高通量测序文库的构建。
具体操作步骤如下：
1、单细胞裂解
通过显微操作分选的单个人***加入到预先分装4微升杜氏磷酸缓冲液DPBS的0.2毫升EP管中，加入1摩尔/升的二硫苏糖醇2.75微升与重组缓冲液DLB(凯杰Qiagen商品号150343)0.25微升，65℃反应10分钟。
2、单细胞裂解液分管操作
使用10微升量程移液器将单细胞裂解液反复吸打10次后，短暂离心，迅速吸取3.5微升至另一0.2毫升离心管中，将细胞裂解液分为两管，管壁标记SCL1和SCL2；
3、单细胞扩增
管SCL1使用的扩增序列如下：
mtDNA-1F：5’-GTTGCGGTCTGTTAGTAGTATAGTGATG-3’；
mtDNA-1R：5’-CTCAACACCACCTTCTTCGACC-3’；
反应体系为：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-1F和mtDNA-1R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
管SCL2使用的扩增序列如下：
mtDNA-2F：5’-GGTTGTTTGGGTTGTGGCTCAG-3’；
mtDNA-2R：5’-CAGCTCTCCCTAAGCTTCAAAC-3’；
反应体系为：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-2F和mtDNA-2R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
管SCL1和管SCL2的PCR反应程序为：94℃60秒；94℃10秒，65℃16分钟，35个循环；65℃10分钟，4℃放置。
4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳
配制2％的琼脂糖凝胶，PCR产物3微升与3微升6×上样缓冲液溴酚蓝指示剂吹打10次充分混匀，瞬时离心后与λDNA HindIII maker分别加入点样孔；电泳程序执行：恒电压100V，电泳时间40分钟。
5、PCR产物回收
使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，商品号：28106)进行PCR产物回收，详细实验步骤参考试剂盒说明书；使用30微升EB buffer回溶(Qiagen，商品号：19086)。
6、PCR产物Qubit质检
使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒(Thermo，商品号：Q32850)进行回收PCR产物定量，详细实验步骤参考试剂盒说明书。
7、PCR产物进行高通量测序文库构建
1)PCR产物片段化
将纯化后的PCR产物稀释到5纳克/微升后，取20微升加入0.2ml PCR管中，置于超声波片段化仪中，设置片段化频率40KHz，片段化时间，第一个循环，5分钟开，5分钟关；第二个循环，3分钟开，3分钟关；第三个循环，3分钟开，3分钟关；第四个循环，5分钟开，5分钟关；
2)片段化产物末端修复，5’末端磷酸化，3’末端加腺苷酸
片段化后的PCR产物，直接加入KAPA HyperPlus文库构建试剂盒(Cat/No.KK8515)末端修复加A缓冲液3微升，KAPA HyperPlus末端修复加A酶2微升，用无核酸酶的去离子水补足至总体积30微升，轻柔震荡混匀后，将上述反应混合物20℃孵育10分钟，65℃孵育30分钟。
3)接头连接
使用的Truseq接头序列的双链信息如下：
第一核苷酸链AS1：5’-/PO4/-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’
第二核苷酸链S1：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
此序列为Illumina公开的Truseq文库接头；
向上一步反应液中加入15微升KAPA HyperPlus连接缓冲液，2微升接头，5微升KAPA HyperPlus连接酶，并用无核酸酶的去离子水补足至总体积60微升。将上述反应混合物20℃反应40分钟；加入48微升(0.8倍反应体积)的Agencourt AMPure XP磁珠(BeckmanCoulter Cat/No.10453438)。吸打10次混匀，室温放置10分钟；置磁力架5分钟，移除上清；样品保持在磁力架上，小心加入200微升80％新鲜配制的乙醇，室温静置30s；移除上清，重复洗涤一次；开盖干燥4分钟；加入21微升无核酸酶的去离子水洗脱，室温孵育5分钟，置磁力架1分钟，吸取20微升上清到一个新的0.2毫升PCR管中。
4)文库扩增
所用引物序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(i5)ACACTCTTTCCCTACACGAC-3’(简称引物1，i5代表Pooling测序中，P5端用于区分样本的Index)
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7)GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(简称引物2，i7代表Pooling测序中，P7端用于区分样本的Index)
将上述引物稀释到10uM。
向上一步吸打混匀的磁珠中加入25微升2×KAPA HiFi热启动酶预混液，2.5微升引物1，2.5微升引物2。将上述混合反应液执行以下程序：1)98℃孵育45秒；2)98℃孵育15秒，60℃孵育30秒，72℃孵育30秒，8个循环；3)72℃孵育1分钟，4℃放置。
5)文库的纯化与质检
加入50微升(1.0倍反应体积)的Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman CoulterCat/No.10453438)。吸打10次混匀，室温放置10分钟；置磁力架5分钟，移除上清；样品保持在磁力架上，小心加入200微升80％新鲜配制的乙醇，室温静置30S；移除上清，重复洗涤一次；开盖干燥4分钟；加入21微升无核酸酶的去离子水洗脱，室温孵育5分钟，置磁力架1分钟，吸取20微升上清到一个新的0.2毫升PCR管中。使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒(Thermo，商品号：Q32850)进行文库浓度定量，详细实验步骤参考试剂盒说明书。
8、高通量测序
将上一步纯化好的文库按照illumina HiseqX的操作步骤，进行高通量测序；，设置每个文库的测序量为500M，即理论总测序深度在16000×左右，理论有效测序深度在13500×左右。
9、数据分析
1)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具将原始下机FASTQ文件进行格式转换；
2)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具对转换数据进行过滤，质控得到converted.fasta文件；
3)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具分析读段(reads)并与剑桥大学提供的人类线粒体基因组(rCRS)进行常规比对和基于覆盖度的COV比对；
4)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)分析线粒体SNP结果，并将SNP百分比＜2％的位点过滤。
10、结果分析
如图1中第五泳道(5)和第六泳道(6)所示，单个***分别经两对引物(mtDNA-1F/mtDNA-1R与mtDNA-2F/mtDNA-2R)扩增的片段大小约为16Kb左右，与线粒体全长16569bp理论片段大小符合，Marker选择为λDNA经HindIII酶切片段Marker；条带亮度受***线粒体拷贝数远高于颗粒细胞的影响，PCR产物浓度较高，电泳条带亮度较泳道1和泳道2的颗粒细胞PCR扩增产物强；
如图2C和图2D所示，单个***分别使用两对引物扩增的PCR产物经文库构建后，经安捷伦2200微电泳凝胶结果显示，文库大小在445bp左右，***片段为326-336bp左右，呈illumina标准文库峰型分布；
如图3C和图3D所示，Illumina PE150模式，3.4M原始读段(Raw reads)的测序量下，单个***分别使用两对引物扩增的PCR产物构建的文库的平均测序深度均在15000×以上；
如图4B所示，单个***分别使用两对引物扩增的PCR产物构建的文库中，29个突变频率为100％的纯质性突变位点在两个文库中全部检出，同时在每个文库中分别检测到的异质性位点分别为2个和6个，将上述结果综合后得到单个颗粒细胞的全部纯质性突变位点和异质性突变位点结果为37个；
如表3和表4所示，单个***分别使用两对引物扩增的PCR产物构建的文库测序结果通过NextGeNe软件得到突变位点信息和频率。
表3***mt1F/1R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000181
Figure BDA0002378359240000191
表4***mt2F/2R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000192
Figure BDA0002378359240000201
由于实施例1和实施例2分别为***和***外周颗粒细胞，相较于实施例1中的异质性位点，实施例2中的低频异质性位点(异质性比例<20％)数量差异很大，只有几个；可能的原因在于：***中线粒体拷贝数较多(20000-800000个)，illumina测序平台自身测序错误率造成的假阳性位点远小于线粒体拷贝数较少的单个颗粒细胞的测序假阳性位点；即由于颗粒细胞线粒体拷贝数较***少两个数量级(1000个左右)，受有效测序深度极高(平均13500×，部分文库达到16000×以上)的影响，一个假阳性被数量级倍的错读，产生由于二代测序平台的错误率导致的碱基读取错误混入异质性位点统计中，造成与***相比，大量介于2％-20％的“异质性位点”出现，实施例1中低线粒体拷贝的颗粒细胞线粒体文库存在的可能弊端将在实施例3中进行优化。
实施例3单个颗粒细胞使用带有分子标签(Unique molecular Index，UMI)的接头进行线粒体高通量测序文库构建的方法
本实施例采用显微操作分离的单个人***外周颗粒细胞进行线粒体高通量测序文库的构建。
具体操作步骤如下：
1、单细胞收集和裂解
收集病人的颗粒细胞，从中心培养皿吸出约0.5ml(含有透明质酸酶)，加入1毫升含50％SSS的输卵管液培养液HTF终止消化，350g离心1分钟，加入含10％SSS的HTF培养液，350g离心1分钟，用1毫升上述培养液重悬细胞沉淀，取出10微升加入培养皿盖，盖油，用显微注射内径20微升的针逐个吸出颗粒细胞，分别取出2个单细胞，逐个加入到预先分装含有4微升杜氏磷酸缓冲液DPBS的0.2毫升EP管中，管壁标记颗粒细胞1，颗粒细胞2，分别加入1摩尔/升的二硫苏糖醇2.75微升与重组缓冲液DLB(凯杰Qiagen商品号150343)0.25微升，总体积为7微升；65℃反应10分钟。
2、单细胞裂解液分管操作
使用10微升量程移液器将单细胞裂解液反复吸打10次后，短暂离心，迅速吸取3.5微升至另一0.2毫升离心管中，将细胞裂解液分为两管，管壁标记SCL1和SCL2(颗粒细胞1)，SCL3和SCL4(颗粒细胞2)。
3、单细胞扩增
管SCL1使用的扩增序列如下：
mtDNA-1F：5’-GTTGCGGTCTGTTAGTAGTATAGTGATG-3’；
mtDNA-1R：5’-CTCAACACCACCTTCTTCGACC-3’；
反应体系为：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-1F和mtDNA-1R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
管SCL2使用的扩增序列如下：
mtDNA-2F：5’-GGTTGTTTGGGTTGTGGCTCAG-3’；
mtDNA-2R：5’-CAGCTCTCCCTAAGCTTCAAAC-3’；
反应体系为：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-2F和mtDNA-2R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL。
管SCL1和管SCL2的PCR反应程序为：94℃60秒；94℃10秒，65℃16分钟，35个循环；65℃10分钟，4℃放置。
4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳
配制2％的琼脂糖凝胶，PCR产物3微升与3微升6×上样缓冲液溴酚蓝指示剂吹打10次充分混匀，瞬时离心后与λDNA HindIII maker分别加入点样孔；电泳程序执行：恒电压100V，电泳时间40分钟。颗粒细胞的两对引物扩增的线粒体全环产物电泳结果见图5。
5、PCR产物回收
使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，商品号：28106)进行PCR产物回收，详细实验步骤参考试剂盒说明书；使用30微升EB buffer回溶(Qiagen，商品号：19086)。
6、PCR产物Qubit质检
使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒(Thermo，商品号：Q32850)进行回收PCR产物定量，详细实验步骤参考试剂盒说明书。
7、PCR产物进行高通量测序文库构建
1)PCR产物片段化
将纯化后的PCR产物稀释到10纳克/微升后，取20微升加入0.2ml PCR管中，置于超声波片段化仪中，设置片段化频率40KHz，片段化时间，第一个循环，5分钟开，5分钟关；第二个循环，4分钟开，4分钟关；第三个循环，4分钟开，4分钟关；第四个循环，5分钟开，5分钟关。
2)片段化产物末端修复，5’末端磷酸化，3’末端加腺苷酸
片段化后的PCR产物，直接加入KAPA HyperPlus文库构建试剂盒(Cat/No.KK8515)末端修复加A缓冲液3微升，KAPA HyperPlus末端修复加A酶2微升，用无核酸酶的去离子水补足至总体积30微升，轻柔震荡混匀后，将上述反应混合物20℃孵育10分钟，65℃孵育30分钟。
3)接头连接
使用的带有独立分子标签(Unique molecular Index，UMI)的接头接头序列的双链信息如下：
第一核苷酸链AS2：5’-/PO4/-CATAGCTGANNNNCGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’
第二核苷酸链S2：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCGMMMMTCAGCTATGT-3’
此序列为依据Illumina公开的Truseq文库接头，自行设计的携带独立分子标签(UMI)的接头序列，其中，NNNN表示四碱基随机序列，共计220种随机组合(剔除掉部分随机组合序列，如AAAA、CCCC等碱基不平衡以及碱基排列汉明距离＜2的组合)；AAAA、CCCC四碱基UMI碱基序列信息见表5。
表5四碱基UMI碱基序列信息
Figure BDA0002378359240000221
Figure BDA0002378359240000231
Figure BDA0002378359240000241
Figure BDA0002378359240000251
向上一步反应液中加入15微升KAPA HyperPlus连接缓冲液，4微升接头，5微升KAPA HyperPlus连接酶，并用无核酸酶的去离子水补足至总体积60微升。将上述反应混合物20℃反应30分钟；加入48微升(0.8倍反应体积)的Agencourt AMPure XP磁珠(BeckmanCoulter Cat/No.10453438)。吸打10次混匀，室温放置10分钟；置磁力架5分钟，移除上清；样品保持在磁力架上，小心加入200微升80％新鲜配制的乙醇，室温静置30S；移除上清，重复洗涤一次；开盖干燥4分钟；加入21微升无核酸酶的去离子水洗脱，室温孵育5分钟，置磁力架1分钟，吸取20微升上清到一个新的0.2毫升PCR管中。
4)文库扩增
所用引物序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(i5)ACACTCTTTCCCTACACGAC-3’(简称引物1，i5代表Pooling测序中，P5端用于区分样本的Index)
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(i7)GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(简称引物2，i7代表Pooling测序中，P7端用于区分样本的Index)
将上述引物稀释到10uM。
向上一步吸打混匀的磁珠中加入25微升2×KAPA HiFi热启动酶预混液，2.5微升引物1，2.5微升引物2。将上述混合反应液执行以下程序：1)98℃孵育45秒；2)98℃孵育15秒，60℃孵育30秒，72℃孵育30秒，10个循环；3)72℃孵育1分钟，4℃放置。
5)文库的纯化与质检
加入50微升(1.0倍反应体积)的Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman CoulterCat/No.10453438)。吸打10次混匀，室温放置10分钟；置磁力架5分钟，移除上清；样品保持在磁力架上，小心加入200微升80％新鲜配制的乙醇，室温静置30S；移除上清，重复洗涤一次；开盖干燥4分钟；加入21微升无核酸酶的去离子水洗脱，室温孵育5分钟，置磁力架1分钟，吸取20微升上清到一个新的0.2毫升PCR管中。使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒(Thermo，商品号：Q32850)进行文库浓度定量，详细实验步骤参考试剂盒说明书。
8、高通量测序
将上一步纯化好的文库按照illumina HiseqX的操作步骤，进行高通量测序；设置测序数据量为500M。
9、数据分析
1)使用UMI tool对下机数据进行UMI去重；
2)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具将处理后的BAM文件进行格式转换；
3)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具对转换数据进行过滤，质控得到converted.fasta文件；
4)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)工具分析读段(reads)并与剑桥大学提供的人类线粒体基因组(rCRS)进行常规比对和基于覆盖度的COV比对；
5)使用NextGeNe(Softgenetics,State College,PA,USA)分析线粒体SNP结果，并将SNP百分比＜2％的位点过滤。
10、结果分析：结果如表6-表9所示。
表6颗粒细胞1mt1F/1R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000261
Figure BDA0002378359240000271
表7颗粒细胞1mt2F/2R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000272
表8颗粒细胞2mt1F/1R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000273
Figure BDA0002378359240000281
表9颗粒细胞2mt2F/2R突变以及突变频率
Figure BDA0002378359240000282
Figure BDA0002378359240000291
由于实施例3为同一个病人的两个颗粒细胞，经UMI去重后，平均有效测序深度均在1000×以上(图7A-图7D)，理论变异位点的检出率可至少达到0.1％左右，而检测中除颗粒细胞2 2F/2R这对引物扩增后构建的文库中鉴定到一个<10％的位点，33个在四个文库中共同检出的位点的异质性频率均在90％以上；可见，之前颗粒细胞线粒体文库中大量2％-20％的异质性突变位点应为illumina测序平台在高深度测序下产生的错误假阳性位点，即背景噪音，在实施例3中，4个文库的异质性位点以及异质频率高度一致(97.1％颗粒细胞11F/1R vs颗粒细胞1 2F/2R,94.3％颗粒细胞2 1F/1R vs颗粒细胞2 2F/2R)。可见，通过采用在连接过程中使用带有UMI的接头并经生物信息学分析中的UMI校正后，大量突变频率在2％-20％的“异质性位点”被过滤掉，过滤后的突变位点真实可靠。
4个颗粒细胞文库的安捷伦2200微电泳峰图见图6A-图6D。4个颗粒细胞线粒体文库的突变位点韦恩图见图8。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献:
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序列表
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<120> 人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒
<130> KHP201110113.0
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgcggtct gttagtagta tagtgatg 28
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaacacca ccttcttcga cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttgtttgg gttgtggctc ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagctctccc taagcttcaa ac 22
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catagctgan nnncgatcgg aagagcacac gtctgaactc cagtcac 47
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcgmmmmtca gctatgt 47

Claims (4)

1.人类单细胞线粒体高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)进行人类单细胞线粒体基因组全环扩增，PCR扩增产物经纯化后，进行片段化处理，将片段化双链DNA依次进行平末端修复，5’末端磷酸化修饰和3’末端加单碱基A；
2)将步骤1)得到的DNA片段连接Illumina Truseq测序接头；
3)以步骤2)得到的连接产物为模板，使用I5和I7标签化的Illumina文库扩增引物进行PCR扩增，得到高通量测序文库；
人类单细胞线粒体基因组全环扩增的方法包括：先进行单细胞分离及裂解，将所得单细胞裂解液作为模板，利用人类线粒体全环扩增引物进行PCR扩增；
PCR反应体系如下：LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-1F和mtDNA-1R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL；或者，LongAmp Taq 2×Master Mix 15μL，10μM mtDNA-2F和mtDNA-2R各1.5μL，单细胞裂解液3.5μL，无核酸酶水8.5μL；
PCR反应程序为：94℃60秒；94℃10秒，65℃16分钟，35个循环；65℃10分钟；
其中，mtDNA-1F和mtDNA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示；mtDNA-2F和mtDNA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示；
单细胞分离及裂解的方法包括：收集受试者的细胞，用透明质酸酶消化，取0.5ml消化后的细胞液，加入1ml含50％SSS的HTF培养液终止消化，350g离心1分钟，收集细胞沉淀，然后加入含10％SSS的HTF培养液，350g离心1分钟，用1ml含10％SSS的HTF培养液重悬细胞沉淀，用显微注射针逐个吸出细胞，加入到预先装有4μL DPBS缓冲液的EP管中，加入1M二硫苏糖醇溶液2.75μL和重组缓冲液DLB 0.25μL；65℃反应10分钟；
其中，所述细胞来自人类***外周颗粒细胞、人类***外周滋养层细胞或人类***；
步骤2)中，所述测序接头是带有独立分子标签UMI的用于Illumina二代测序平台的测序接头，所述测序接头是由单链AS2和S2按等摩尔比混合退火而成的双链接头；
单链AS2的核苷酸序列为：5’-/PO4/-CATAGCTGANNNNCGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’；
单链S2的核苷酸序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCGMMMMTCAGCTATGT-3’；
其中，/PO4/表示磷酸化修饰；N、M各自独立地选自A、T、G或C；NNNN与MMMM反向互补配对，且NNNN不为AAAA或CCCC，MMMM不为AAAA或CCCC，且NNNN及MMMM各自的碱基排列汉明距离≥2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)使用超声片段化或酶切片段化对PCR扩增产物进行片段化；
利用T4 DNA聚合酶进行平末端修复；
利用T4多核苷酸激酶和三磷酸腺苷进行5’末端磷酸化修饰；
利用Klenow聚合酶进行3’末端加单碱基A；
步骤2)采用T-A连接方式将DNA片段与测序接头连接；
步骤3)利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)使用超声片段化对PCR扩增产物进行片段化。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)利用NEB Q5热启动DNA聚合酶或KAPA高保真热启动聚合酶。
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