CN106071106B - 发酵棉籽蛋白及固态好氧发酵制备发酵棉籽蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵棉籽蛋白及固态好氧发酵制备发酵棉籽蛋白的方法。本发明要解决的技术问题是是提供一种发酵棉籽蛋白。该发酵棉籽蛋白由以下重量配比的原料发酵而成：棉粕粉97～99份、玉米粉0～1.5份、混合酵母菌固体菌种0.7～1.5份、混合营养盐0.1～0.4份、混合酶制剂0.03～0.1份、水；水的总重量占其它五种原料总重量的0.6～0.9倍。而发酵棉籽蛋白的固态好氧发酵制备方法，则主要包括以下步骤：取各原料混合均匀，在好氧状态下于30～35℃下发酵45～48h，干燥即可。本发明方法可以有效地除去棉粕中的棉酚和抗营养因子，为棉粕的有效利用提供了一条更好的方式。
Description
技术领域
本发明属于制备微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵棉籽蛋白及固态好氧发酵制备发酵棉籽蛋白其制备方法。
背景技术
目前我国养殖业严重依赖玉米-豆粕型日粮，特别是主要蛋白质原料豆粕，绝大部分为进口，受制于国际市场，常造成养殖成本大幅波动，风险增大。另外，进口豆粕中含有转基因成分，不符合有机农产品的要求。
棉粕为棉籽榨油后的副产物，营养成分丰富，蛋白在40％以上，氨基酸组成较平衡，精氨酸含量高于豆粕。我国每年棉粕产量约600万吨，资源量全球第一，但棉粕含有较多有毒的棉酚及抗营养因子，限制了其在动物日粮中的应用。
棉酚主要存在于棉仁色素腺体内，是一种不溶于水而溶于有机溶剂的黄褐色聚酚色素。在制油过程中，由于蒸炒，压榨等热作用，大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚，结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在，对动物毒性较大，尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长，可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降，甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。未经处理的棉粕中游离棉酚含量在800～1100mg/kg。由于毒性棉酚的存在，棉粕在畜禽饲料中的使用量为3～6％，幼畜禽一般不使用棉粕。
目前商业化棉籽蛋白产品仅有采用有机溶剂浸提的脱酚棉粕，游离棉酚含量可在400mg/kg以下，但浸提法会造成部分营养物质的流失。
而现有技术采用的生物处理方法主要是厌氧微生物发酵法，但是如果要要同时兼顾脱毒和消除抗营养因子、提高消化吸收率、提高营养价值和饲喂效果等方面的效果，则是非常困难，很难达到想要的效果。为解决上述难题，现有实验技术主要采用复杂的菌株组合，分别加入不同菌株分解相应的物质，但是这些方法往往违背微生物学原理，菌株太多往往互为污染菌，相互影响、长势差；或者这些菌株本身的最适生长条件相差较大，在相同基质中生长相互干扰。此外，现有技术的发酵方法中，往往加入较多麸皮及玉米辅料(占10～20％)，以及采用混合粕类发酵，棉粕含量在总原料中通常低于80％，棉酚等不良因子含量被冲稀，难度远低于单一棉粕发酵，也不能达到单一饲料原料的要求(单一成分占95％以上)。
从微生物学角度，对一种原料基质，需选择独特的菌株，和相应的培养条件。现有技术中，还有采用通用发酵剂，工艺简单，用于各种原料发酵(如豆粕、棉粕和糟渣等)，实际上对每一种原料都不能达到最佳；若工业放大后，发酵效率较低，只适合于副业性农业生产。
本领域目前还没有开发出较好的，能在单一基质条件下，对棉粕中的棉酚及抗营养因子等都能很好地进行分解处理，并提高蛋白溶解度的生物学方法。
发明内容
针对已有的化学脱酚法和微生物发酵法存在的缺陷，本发明提供一种发酵棉籽蛋白及其制备方法。该方法棉粕占总原料97％以上，为单一原料的发酵。采用高好氧发酵和酶解同步进行处理棉粕，不仅能够降低有毒游离棉酚，同时还能明显降解原料中如植酸等抗营养因子和增加酸溶性蛋白含量，从而提高产品的营养价值。
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种发酵棉籽蛋白。该发酵棉籽蛋白由以下重量配比的原料发酵而成：棉粕粉97～99份、玉米粉0～1.5份、混合酵母菌固体菌种0.7～1.5份、混合营养盐0.1～0.4份、混合酶制剂0.03～0.1份、水；水的总重量占其它五种原料总重量的0.6～0.9倍。
优选的，上述发酵棉籽蛋白由以下重量配比的原料发酵而成：棉粕粉98份、玉米粉0.5份、混合酵母菌固体菌种1.2份、混合营养盐0.25份、混合酶制剂0.05份和水，水的总重量占其它五种原料总重量的0.8倍。
其中，上述发酵棉籽蛋白中所述的棉粕粉为棉粕经过2.0mm孔径的粉碎机粉碎后，再用20目筛子分筛得到。
进一步的，上述发酵棉籽蛋白中的，混合酵母菌固体菌种包括以下菌种：扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、产朊假丝酵母菌(Candida utilis)和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)。
先分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和产朊假丝酵母菌及马克斯克鲁维酵母菌的混合酵母培养液。再将扣囊复膜孢酵母固体菌种和产朊假丝酵母菌及马克斯克鲁维酵母菌的混合液体菌种混合接种到麸皮玉米培养基中，经培养得到混合酵母菌固体菌种。
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述的扣囊复膜孢酵母固体菌种的制备方法为：
从扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的斜面保藏菌种中挑取1环(接种环)，接入100mL土豆蔗糖培养液中，于28～32℃温度摇瓶培养(150～200rpm)培养2～3d，得到扣囊复膜孢酵母培养液。再按重量比计，扣囊复膜孢酵母液︰麸皮玉米培养基＝0.5～1.5︰100，将培养液转入麸皮玉米培养基中，于28～32℃温度培养2～3d，即得扣囊复膜孢酵母固体菌种。
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述的混合酵母培养液的制备方法为：
分别从产朊假丝酵母菌(Candida utilis)和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)的斜面保藏菌种中各挑取1环(接种环)，分别接入100mL土豆蔗糖培养液中，于28～32℃温度摇瓶培养(150～200rpm)培养2～3d，分别得到产朊假丝酵母菌培养液和马克斯克鲁维酵母菌培养液；再按重量比，产朊假丝酵母菌培养液︰马克斯克鲁维酵母菌培养液＝0.75～0.9︰0.1～0.25混合接入土豆蔗糖培养液中，于28～32℃温度摇瓶培养(150～200rpm)培养2～3d，即得到混合酵母液；其中，产朊假丝酵母菌培养液和马克斯克鲁维酵母菌培养液总重量与土豆蔗糖培养液重量比为1︰100；
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述的混合酵母菌固体菌种的制备方法为：
按重量比计，扣囊复膜孢酵母固体菌种：混合酵母液︰麸皮玉米培养基＝0.5～1.0︰0.2～0.5：100，混合均匀，于28～32℃温度培养2～3d，即得混合酵母菌固体菌种。
优选的，上述发酵棉籽蛋白中所述产朊假丝酵母菌培养液︰马克斯克鲁维酵母菌培养液＝0.85︰0.15。
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述的麸皮玉米培养基的制备方法为：按重量配比计，麸皮︰玉米︰水＝7～8︰2～3︰8将三者混匀后于118～126℃下灭菌25～40min，冷却即可。
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述的混合营养盐的制备方法为：按重量配比计，取1份KCl、0.5份MgSO4、0.05份FeSO4和0.025份ZnSO4混匀即可。
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述的混合酶制剂的制备方法为：按重量配比计，植酸酶︰纤维素酶︰木聚糖酶︰果胶酶︰木瓜蛋白酶＝10～20︰2～3︰0.8～1.5︰0.8～1.5︰0.8～1.5将五者混匀即可。
优选的，上述发酵棉籽蛋白中所述的混合酶制剂为按重量配比计植酸酶︰纤维素酶︰木聚糖酶︰果胶酶︰木瓜蛋白酶＝10︰2︰1︰1︰1。
具体的，上述发酵棉籽蛋白中所述植酸酶的酶活力为5000单位，所述纤维素酶的酶活力为5000单位，所述木聚糖酶的酶活力为10万单位，所述果胶酶的酶活力为3万单位，所述木瓜蛋白酶的酶活力为80万单位。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述发酵棉籽蛋白的固态好氧发酵方法。该方法包括以下步骤：
A、粉碎和筛分：取棉粕用2.0筛子的粉碎机粉碎。再用20～30目孔径的筛子粉筛后的棉粕粉；
B、混合：取棉粕粉、玉米粉、混合酵母菌固体菌种、混合营养盐、混合酶制剂和水混匀得发酵料；
C、发酵：将发酵料在好氧状态下于30～35℃下发酵45～50h，干燥后即得到发酵棉籽蛋白。
常用的干燥方式温度为在不高于60度的环境下自然干燥。
优选的，上述制备方法，步骤B中发酵时发酵料的厚度为不大于60mm。
优选的，上述制备方法，步骤B中发酵采用的容器为不锈钢材质或竹材质的任意一种。比如，可采用不锈钢发酵盘或竹制的发酵盘。
本发明的有益效果在于：本发明发酵棉粕与未处理棉粕(粗蛋白44％左右)相比，在相同含水量条件下，粗蛋白≥50％，总氨基酸≥44％，游离棉酚去除率≥60％，植酸降解率约30％，果胶降解率42％，酸溶性蛋白含量增加100％以上，大幅提高饲喂价值总。本发明发酵原料中棉粕占97％以上，比现有技术能更充分有效地处理棉粕。应用本发明产品可以降低养殖成本、增加收益；使用本发明产品可以提高动物机体和肠道健康水平，增强抗病力，可以常规不用抗生素，有利于推行无抗健康养殖；经过酶处理和发酵，富含生长因子和肽类等，可以改善肉蛋等品质，提高农产品质量；改善养殖环境，有利于对粪便无害化和资源化，发展清洁养殖和生态循环。
具体实施方式
现有技术采用化学溶剂法以及厌氧微生物发酵法，要同时兼顾脱毒和消除抗营养因子、提高消化吸收率、提高营养价值和饲喂效果很难达到想要的效果。为解决上述困难，现有技术主要采用复杂的菌株组合，加入菌株分解相应的物质，但是这些方法往往违背微生物学原理，菌株太多往往互为污染菌，相互影响、长势差；或者这些菌株本身的最适生长条件相差较大，在相同基质中生长相互干扰。所以，必须要合理地选择菌株和酶制剂，才能在单一基质条件下，对棉粕中的棉酚及抗营养因子进行很好的加工处理。
为了能够很好地脱除有毒有害物质、选择合适的菌种，本发明用细菌、酵母菌和丝状真菌三大类微生物的数百株菌，在棉粕培养基中分别进行厌氧和好氧培养，测定了菌株的生长量、棉酚分解率、粗蛋白含量和外观气味，排除了丝状真菌；进一步的，又根据菌株混合培养测定菌株的生长量、棉酚分解率、粗蛋白含量和外观气味等指标，再综合考虑菌株本身的安全性、工业化生产的难易程度，发酵的综合效果等最终确定选择扣囊复膜孢酵母、产朊假丝酵母菌和马克斯克鲁维酵母菌三种菌株来处理加工棉粕。
通过实验发现，上述三种菌株中，主菌株是扣囊复膜孢酵母，生物量高有降棉酚能力，次菌株产朊假丝酵母菌有微弱降棉酚能力，马克斯克鲁维酵母菌属生香酵母，能产少量酯香，改善发酵棉籽蛋白适口性；这三株菌均能对肠道革兰氏阴性菌有抑制作用，能提高肠道非特异性免疫力，部分细胞能通过肠道，进入粪便，有利于清洁养殖。
本发明还发现，次菌株接种量过大会降低主菌株的降棉酚能力，因此，优选的方案是在工业生产条件下比较准确确定主和次菌株的接种比例。经过大量的实验研究发现，先将产朊假丝酵母菌和马克斯克鲁维酵母菌混合扩大培养后得到混合酵母菌培养液，控制添加到混合酵母菌固体菌种中的比例，然后与扣囊复膜孢酵母固体菌种的比例为0.2～0.5:0.5～1.0时能够很好地分解棉酚。在制备混合酵母菌固体菌种时，优选为混合酵母菌培养液0.4份，扣囊复膜孢酵母固体菌种0.8份。
进一步发现，虽然上述三种菌株组合发酵可以分解棉酚，但对降解抗营养因子和提高消化吸收作用有限。为了解决上述问题，本发明最初通过大量筛选，选出植酸酶产生菌和果胶酶产生菌等，加入菌株组合中，期望能够起到降低抗营养因子的作用，后来实验发现，在以单一棉粕原料和多种菌的条件下，不是植酸酶和果胶酶的最佳产酶条件，较复杂的菌株组合难以兼顾既分解棉酚，又降低抗营养因子。
面对上述难题，又进一步研究，发现可以添加复合酶制剂来解决上述问题，通过实验发现采用纤维素酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶的共同作用不仅能分解菜籽粕中主要抗营养因子，还能提高微生物的脱酚能力；进一步发现，酶复合使用有一定协同作用，例如棉粕中植酸含量较高，植酸酶对植酸的分解，既能减少植酸对营养元素的结合，从植酸分解释放的磷又为微生物生长提供养分，有利于微生物生长，此外果胶和木聚糖等的降解产物也能提供微生物生长的养分。
实验还发现，在同样的使用条件下，木瓜蛋白酶对其它几种酶蛋白有降解作用，随着时间延长，酶活性下降。因此，又对木瓜蛋白酶的用量及比例做了实验研究，控制木瓜蛋白酶的加入量，可以使其它几种酶的活性在处理过程的前10h内保留50％以上。通过工业生产实验发现，当植酸酶︰纤维素酶︰木聚糖酶︰果胶酶︰木瓜蛋白酶＝10～20︰2～3︰0.8～1.5︰0.8～1.5︰0.8～1.5比例来制备混合酶制剂，可以很好地处理棉籽粕中的抗营养因子。优选植酸酶︰纤维素酶︰木聚糖酶︰果胶酶︰木瓜蛋白酶＝10︰2︰1︰1︰1，结果发现，发酵棉籽蛋白的酸溶蛋白比原来棉籽粕提高约100％，对棉酚分解率提高到60％左右。
本发明发现：在加入酶制剂的同时，应当控制菌种接种量，酶解过程也是菌种扩增过程。如果接种量过大，细胞增殖过快，发酵时间过短，不利于酶解作用；反之接种量过小，发酵时间延长，容易造成杂菌增生。
本发明还发现，加入的水量为其他固态原料0.6～0.9倍时，既可很好地满足酶解对水的需要，又能达到较好的增菌和脱酚效果。
发明人研究发现，发酵料太薄容易失水，并且需要的容器也多，造价高，如果发酵料太厚会成为厌氧发酵，效果变差，所以发酵料的厚度为不大于60mm，优选的，发酵时发酵料的厚度为不大于50mm。即采用薄层固态好氧发酵，有利于提高生物量。
优选的，好氧发酵采用的容器为不锈钢材质或竹材质的任意一种。
进一步优选的，上述发酵棉籽蛋白的制备方法，步骤B中发酵采用的容器为的容器为可采用不锈钢发酵盘或竹制的发酵盘。比如，可采用长不大于2000mm、宽不大于1000mm，高不大于60mm的不锈钢不金属浅盘作为发酵盘。
总的说来，相对于以前报道的主要为单纯厌氧发酵的生物学方法。本发明方法是以好氧发酵方式为基础，同时加入酶处理过程，在提高棉酚去除率的同时，有效降低抗营养因子和提高蛋白消化率，提高了棉粕的饲喂价值，起到了综合优化的作用，其实现的难度非常大，但是能获得非常好的综合效益。本发明方法与传统发酵法比较见表1。
表1本发明方法与传统发酵法处理棉籽粕比较
本发明与其它生物法不同，针对单一棉粕原料，创造性地使用高好氧固态发酵方式，能快速分解毒性物质和显著提高蛋白质和氨基酸含量，同步进行的酶水解作用则能很有效地降解抗营养因子。
下列试验例与实施例中，所采用的扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)菌种已于2016年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12221。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 该菌株对菜粕中硫葡萄糖甙以及棉粕中棉酚均有较强脱毒能力，且试口服安全无毒。
产朊假丝酵母来自四川大学微生物实验室保存，原始来源于中国科学院微生物研究所(北京)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGNCC)，菌种编号CGNCC2.281；
马克斯克鲁维酵母保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.9427；
植酸酶购自北京昕大洋科技发展有限公司，纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶均购自四川华德生物工程有限公司。
实施例1棉粕筛分预处理条件
将棉粕原料用工业粉碎机粉碎，粉碎机筛孔为2.0mm。将粉碎后的棉粕分别用10目、20目、30目、40目、60目和80目的筛网分筛，分别称筛上和筛下物的重量。其中10目筛上物全部是短绒毛，占原料总重比例约2％；20目筛上物是短绒毛和少量棉籽皮杂质，占原料总重比例约8％，筛下物无肉眼可见明显的短绒毛；从30目至80目分筛结果，筛上物中棉仁随筛孔越细而增多。综合以上，选取20～30目筛分作为发酵前的预处理，降低纤维物质等杂质含量。优选20目，分析结果：筛分前原料粗蛋白为44％，游离棉酚为852mg/kg；筛分后粗蛋白为为46.2％，游离棉酚为833mg/kg。
实施例2固体生产菌种的制备
从扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的斜面保藏菌种中挑取1环(接种环)，接入100mL土豆培养液中，于30℃温度摇瓶培养(180rpm)52h，得到扣囊复膜孢酵母培养液。
取扣囊复膜孢酵母液50g，接入已灭菌的5000g麸皮玉米培养基(以干料计)中，拌合均匀，于30℃温度培养48h，即得扣囊复膜孢酵母固体菌种。
土豆蔗糖培养液制备：将新鲜土豆削皮后切成大指姆大小的块状，称取100g，加入500g的自来水，煮沸20分钟，纱布过滤，弃渣取上清液，用自来水定容到500g，再加入蔗糖10g，溶化后，分装250ml三角瓶，每瓶100g。灭菌120℃维持30分钟。
麸皮玉米培养基的制备：取麸皮750g，玉米250g，自来水800g，拌合均匀后，于120℃灭菌30min，冷却后可接种。
分别从产朊假丝酵母菌(Candida utilis)和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)的斜面保藏菌种中挑取1环(接种环)，分别接入100g土豆蔗糖培养液中，于30℃温度培养50h，分别得到产朊假丝酵母菌培养液和马克斯克鲁维酵母菌培养液；将产朊假丝酵母菌培养液0.85g︰马克斯克鲁维酵母菌培养液0.15g混合接入100g土豆蔗糖培养液中，于30℃温度培养48h，即得到混合酵母液；
再取扣囊复膜孢酵母固体菌种8g，混合酵母液4g，混合接入已灭菌的1000g麸皮玉米培养基(以干料计)中，拌合均匀，于30℃温度培养52h，即得混合酵母菌固体菌种，用于发酵生产。细胞计数为6.45×109/g培养物。
实施例3营养盐的加入对处理结果的影响
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉。再按实施例2制备混合酵母菌固体菌种。
将KH2PO4、KCl、MgSO4、FeSO4、ZnSO4和植酸酶按下表分组加入，拌合均匀，于30℃温度培养48h，测定发酵后的细胞数和粗蛋白含量。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| 棉粕粉(g) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| 水(g) | 700 | 700 | 700 | 700 | 700 | 700 | 700 | 700 |
| 菌种(g) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(g) | —— | 1 | —— | 1 | 1 | 1 | —— | —— |
| KCl(g) | —— | —— | 1 | —— | —— | —— | 1 | 1 |
| MgSO<sub>4</sub>(g) | —— | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| FeSO<sub>4</sub>(g) | —— | —— | —— | 0.05 | —— | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| ZnSO<sub>4</sub>(g) | —— | —— | —— | —— | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 |
| 植酸酶(g) | —— | —— | —— | —— | —— | —— | —— | 0.2 |
| 细胞数(×10<sup>9</sup>/g) | 1.45 | 1.75 | 1.56 | 1.73 | 1.76 | 1.81 | 1.55 | 1.83 |
| 粗蛋白(％) | 48.20 | 49.35 | 48.82 | 49.84 | 49.86 | 50.20 | 48.84 | 50.61 |
选取营养盐添加为第8组，即：KCl 0.1％、MgSO40.05％、FeSO40.005％、ZnSO40.0025％、植酸酶0.02％。植酸酶对棉粕中植酸分解可为细胞生长提供磷源。以上植酸酶活力单位为5000u/g。
实施例4发酵处理棉粕
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为833mg/kg。再按实施例2分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 100g、MgSO4 50g、FeSO4 5g和ZnSO4 2.5g用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
配制混合酶制剂：称取植酸酶100g、纤维素酶20g、木聚糖酶10g、果胶酶10g、木瓜蛋白酶10g，混合搅拌均匀。
取棉粕粉980g、玉米粉5g、混合酵母菌固体菌种12g、混合营养盐2.5g、混合酶制剂0.5g和800g水拌合混匀，在700×350mm不锈钢盘中平铺均匀，厚度4cm，于30℃温度下发酵48h，50℃温度下干燥24h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵后的细胞数为2.2×109/g，水分12.2％、粗蛋白51.7％、游离棉酚276mg/kg。
天门冬氨酸4.41％、苏氨酸1.60％、丝氨酸2.06％、谷氨酸9.22％、甘氨酸1.97％、丙氨酸2.01％、胱氨酸0.56％、缬氨酸2.04％、蛋氨酸0.75％、异亮氨酸1.53％、亮氨酸3.05％、酪氨酸1.33％、苯丙氨酸2.72％、赖氨酸2.07％、组氨酸1.33％、精氨酸5.16％、脯氨酸2.03％、氨基酸总量43.83％。小肽含量10.3％(对照原料4.4％，水分8.08％)。
实施例5发酵处理棉粕
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为833mg/kg。再按实施例2分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 100g、MgSO4 50g、FeSO4 5g和ZnSO4 2.5g用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
取棉粕粉974g、玉米粉15g、混合酵母菌固体菌种6.7g、混合营养盐4g、混合酶制剂0.3g和700g水拌合混匀，在700×350不锈钢盘中平铺均匀，厚度6cm，于32℃温度下发酵48h，50℃温度下干燥20h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵后的细胞数为1.65×109/g。水分9.8％、粗蛋白51.7％、乳酸含量1.62％、游离棉酚329mg/kg。酸溶蛋白含量10.01％(对照原料为4.94％)，水苏糖＜50.0mg/kg、棉籽糖＜50.0mg/kg。
实施例6发酵处理棉粕
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为833mg/kg。再按实施例2分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 100g、MgSO4 50g、FeSO4 5g和ZnSO4 2.5g用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
配制混合酶制剂：称取植酸酶100g、纤维素酶20g、木聚糖酶10g、果胶酶10g、木瓜蛋白酶10g，混合搅拌均匀。
取棉粕粉980g、玉米粉3g、混合酵母菌固体菌种15g、混合营养盐1g、混合酶制剂1g和600g水拌合混匀，在700×350mm不锈钢盘中平铺均匀，厚度6cm，于32℃温度下发酵50h，50℃温度下干燥20h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵后的细胞数为1.8×109/g，游离棉酚318mg/kg，水分11.12％、粗蛋白50.11％、乳酸含量1.49％、酸溶蛋白含量10.8％(未发酵原料为4.4％，水分8.08％)，水溶蛋白含量12.3％、水苏糖＜50.0mg/kg、棉籽糖＜50.0mg/kg。
实施例7规模化发酵处理棉粕
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为833mg/kg。再按实施例2分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 2000g、MgSO4 1000g、FeSO4 100g和ZnSO4 50g用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
配制混合酶制剂：按植酸酶每1000g配纤维素酶200g、木聚糖酶100g、果胶酶100g、木瓜蛋白酶100g的配比称取需要量的原料，混合搅拌均匀。
取棉粕粉970kg、玉米粉15kg、混合酵母菌固体菌种11kg、混合营养盐3.2kg、混合酶制剂0.8kg和800kg水拌合混匀，在2000×1000×60mm不锈钢发酵盘(底部是40目筛网)中平铺均匀，厚度5cm，每盘装料20kg(以干料计)，共装50盘，于33℃温度下发酵48h，50℃温度下干燥20h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵后的细胞数为2.05×109/g，水分12.5％，粗蛋白50.8％，游离棉酚322mg/kg。
天门冬氨酸4.52％、苏氨酸1.64％、丝氨酸2.15％、谷氨酸9.35％、甘氨酸1.99％、丙氨酸2.01％、胱氨酸0.68％、缬氨酸2.06％、蛋氨酸0.76％、异亮氨酸1.51％、亮氨酸3.02％、酪氨酸1.38％、苯丙氨酸2.76％、赖氨酸2.12％、组氨酸1.38％、精氨酸5.44％、脯氨酸1.95％、氨基酸总量44.76％。酸溶蛋白11.5％(对照原料4.45％，水分8.9％)，水苏糖＜50.0mg/kg、棉籽糖＜50.0mg/kg。
实施例8规模化发酵处理棉粕
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为845mg/kg。再按实施例2方法分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 10kg、MgSO4 5kg、FeSO4 0.5kg和ZnSO4 0.25kg用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
配制混合酶制剂：称取植酸酶10kg、纤维素酶2kg、木聚糖酶1kg、果胶酶1kg、木瓜蛋白酶1kg，混合搅拌均匀。
取棉粕粉990kg、混合酵母菌固体菌种7kg、混合营养盐2.2kg、混合酶制剂0.8kg和900kg水拌合混匀，在2000×1000×60mm不锈钢发酵盘(底部是40目筛网)中平铺均匀，厚度4cm，每盘装料20kg(以干料计)，共装50盘，发酵室控温33℃，发酵48h，50℃温度下干燥20h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵后的细胞数为1.9×109/g。游离棉酚325mg/kg，粗蛋白52.89％、水分9.96％、灰分7.25％、天冬氨酸4.81％、赖氨酸2.29％、脯氨酸1.84％、亮氨酸2.98％、苯丙氨酸2.74％、甘氨酸2.24％、缬氨酸2.14％、组氨酸1.61％、丝氨酸2.44％、异亮氨酸1.53％、蛋氨酸0.61％、丙氨酸2.08％、谷氨酸9.35％、苏氨酸1.71％、精氨酸5.62％、胱氨酸0.86％、游离氨1.43％。酸溶蛋白11.5％(对照原料4.41％，水分8.5％)，水苏糖＜50.0mg/kg、棉籽糖＜50.0mg/kg。
实施例9规模化发酵处理棉粕并进行育肥猪养殖实验
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为845mg/kg。再按实施例2方法分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 10kg、MgSO4 5kg、FeSO4 0.5kg和ZnSO4 0.25kg用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
配制混合酶制剂：称取植酸酶10kg、纤维素酶2kg、木聚糖酶1kg、果胶酶1kg、木瓜蛋白酶1kg，混合搅拌均匀。
取棉粕粉4900kg、玉米粉30kg、混合酵母菌固体菌种50kg、混合营养盐15kg、混合酶制剂5kg和4000kg水拌合混匀，在2000×1000×60mm不锈钢发酵盘(底部是40目筛网)中平铺均匀，厚度5cm，每盘装料20kg(以干料计)，共装250盘，发酵室温度34.5℃，发酵46h，50℃温度下干燥20h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵后的细胞数为1.7×109/g。游离棉酚322mg/kg。粗蛋白53.47％、水分10.12％、灰分6.89％、天冬氨酸4.83％、赖氨酸2.18％、脯氨酸1.77％、亮氨酸2.95％、苯丙氨酸2.99％、甘氨酸2.26％、缬氨酸2.05％、组氨酸1.64％、丝氨酸2.45％、异亮氨酸1.45％、蛋氨酸0.60％、丙氨酸2.07％、谷氨酸9.49％、苏氨酸1.69％、精氨酸5.64％、胱氨酸0.89％、游离氨1.68％。酸溶蛋白11.8％(对照原料4.47％，水分8.65％)，水苏糖＜50.0mg/kg、棉籽糖＜50.0mg/kg。
选内江猪和杜洛克二元杂交猪120只，随机分为2组，每组60只，1组喂传统原料的全价料，另1组喂加有发酵棉籽蛋白的生物饲料。传统饲料组平均体重65.4kg，生物饲料组平均体重64.85kg。
传统饲料配方：玉米69％、豆粕(粗蛋白43％)16％、棉粕(粗蛋白44％)6％、麸皮5％，微量调节剂4％。生物饲料配方：玉米69％、豆粕7％、发酵棉籽蛋白(粗蛋白53.47％)13％、麸皮7％，微量调节剂4％。
生物饲料是将发酵棉籽蛋白13％替换传统饲料组中棉粕和部分豆粕，保持两组粗蛋白一致，代谢能相当，差额部分用2％麸皮补齐。
两组配方单价：传统饲料组高于生物饲料组36元/吨。
在同等饲养条件下喂养82天。传统饲料组：日增重685g、料肉比3.572、钱肉比7.86； 生物饲料组：日增重736g、料肉比3.410、钱肉比7.38，成本降低0.48元/每kg体重增重。
上述的4份微量调节剂包括如下成分：磷酸氢钙10g、赖氨酸2g、铜Cu8.0mg、铁Fe80.0mg、锰Mn60.0mg、锌Zn 40.0mg、硒Se 0.15mg、碘I 0.35mg、维生素A 50000IU、维生素D310000IU、维生素E 25IU、维生素K35mg、维生素B1210mg、维生素B120mg、维生素B216mg、维生素B6 6mg、烟酰胺35mg、泛酸25mg、叶酸0.5mg。微量调节剂中IU——国际单位。
实施例10规模化发酵处理棉粕并进行生长肉鸡养殖实验
将棉粕原料按实施例1粉碎，用20目筛分，得到棉粕粉，游离棉酚为845mg/kg。再按实施例2方法分别制备扣囊复膜孢酵母固体菌种和混合酵母菌液。
配制混合营养盐：称取KCl 10kg、MgSO4 5kg、FeSO4 0.5kg和ZnSO4 0.25kg用粉碎机混合粉碎，全部过100目。
配制混合酶制剂：称取植酸酶10kg、纤维素酶2kg、木聚糖酶1kg、果胶酶1kg、木瓜蛋白酶1kg，混合搅拌均匀。
取棉粕粉980kg、玉米粉7kg、混合酵母菌固体菌种10kg、混合营养盐2.2kg、混合酶制剂0.8kg和800kg水拌合混匀，在2000×1000不锈钢发酵盘(底部是40目筛网)中平铺均匀，厚度4cm，每盘装料20kg(以干料计)，共装50盘，发酵室控温34.8℃，发酵45h，50℃温度下干燥20h后，即得到发酵棉籽蛋白。
测定发酵棉籽蛋白成品中细胞数为2.15×109/g。粗蛋白49.4％、水分13.3％，游离棉酚317mg/kg。
天门冬氨酸4.52％、苏氨酸1.64％、丝氨酸2.17％、谷氨酸9.77％、甘氨酸2.03％、丙氨酸1.98％、胱氨酸0.60％、缬氨酸2.02％、蛋氨酸0.76％、异亮氨酸1.53％、亮氨酸3.04％、酪氨酸1.38％、苯丙氨酸2.62％、赖氨酸2.19％、组氨酸1.40％、精氨酸5.58％、脯氨酸2.00％、氨基酸总量45.21％。植酸降解率约30％，果胶降解率42％，酸溶性蛋白11.2％(对照原料4.43％，水分8.5％)。
肉鸡喂养实验
选600只1.6kg左右青脚白皮麻羽鸡，随机分为2组，每组300只，对照组平均初重1.645kg/只，生物组平均初重1.618kg/只。
对照组配方为：玉米68％、豆粕(粗蛋白43％)18％、棉粕(粗蛋白44％)6％、麸皮3％、豆油1％、微量调节剂4％；生物饲料组配方为：玉米68％、豆粕(粗蛋白46％)10％、发酵棉籽蛋白(粗蛋白51.3％、水分折算按10％)13％、麸皮4％、豆油1％、微量调节剂4％。生物饲料组用13％发酵棉籽蛋白替换8％豆粕和6％棉粕，不足的1％用麸皮补足。两组能量和粗蛋白水平基本一致。生物蛋白组配方成本单价降低30元/吨饲料。
在同等饲养条件下喂养31天。对照组：总增重110.27kg，料肉比为2.72、饲料价格2.2元/kg钱肉比5.98：1，生物饲料组：总增重120.08kg，料肉比为2.59、饲料价格2.17元/kg、钱肉比为5.62：1，即每公斤增重降低成本0.36元。生物组病死数0只，对照组病死数1只。生物组饲料组未加任何抗生素。
上述微量调节剂为按每kg饲粮：磷酸氢钙10g、胆碱1g、小苏打1g、赖氨酸2g、蛋氨酸1g、植酸酶0.2g、铜Cu8.0mg、铁Fe80.0mg、锰Mn60.0mg、锌Zn 40.0mg、硒Se 0.15mg、碘I0.35mg、维生素A 50000IU、维生素D310000IU、维生素E 25IU、维生素K35mg、维生素B1210mg、维生素B120mg、维生素B2 16mg、维生素B6 6mg、烟酰胺35mg、泛酸25mg、叶酸0.5mg。对照组饲料微量调节剂中每千克还含有：维吉尼亚霉素20mg，盐霉素60mg。生物组饲料微量调节剂中每千克多补充：赖氨酸0.4g。微量调节剂中IU—国际单位。
Claims (7)
1.发酵棉籽蛋白，其特征在于：由以下重量配比的原料发酵而成：棉粕粉97～99份、玉米粉0～1.5份、混合酵母菌固体菌种0.7～1.5份、混合营养盐0.1～0.4份、混合酶制剂0.03～0.1份、水；水的总重量占其它五种原料总重量的0.6～0.9倍；
所述的混合酵母菌固体菌种包括的菌种为：扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、产朊假丝酵母菌(Candida utilis)和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)；
所述混合酶制剂的配比为按重量配比计植酸酶︰纤维素酶︰木聚糖酶︰果胶酶︰木瓜蛋白酶＝10～20︰2～3︰0.8～1.5︰0.8～1.5︰0.8～1.5，将五者混匀即可。
2.根据权利要求1所述的发酵棉籽蛋白，其特征在于：由以下重量配比的原料发酵而成：棉粕粉98份、玉米粉0.5份、混合酵母菌固体菌种1.2份、营养盐0.25份、混合酶制剂0.05份和80份水。
3.根据权利要求1所述的发酵棉籽蛋白，其特征在于：所述的棉粕粉为棉籽经榨油后的粕，再经过粉碎和筛分除去杂质。
4.根据权利要求1所述的发酵棉籽蛋白，其特征在于：所述的营养盐的制备方法为：按重量配比计，取1份KCl、0.5份MgSO4、0.05份FeSO4和0.025份ZnSO4混匀即可。
5.根据权利要求1～4任一项所述的发酵棉籽蛋白，其特征在于：所述混合酶制剂中植酸酶的酶活力为5000单位，纤维素酶的酶活力为5000单位，木聚糖酶的酶活力为10万单位，果胶酶的酶活力为3万单位，木瓜蛋白酶酶活力为80万单位。
6.制备权利要求1～5任一项所述的发酵棉籽蛋白的固态好氧发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、粉碎和筛分：取棉粕用2.0筛子的粉碎机粉碎，再用20～30目孔径的筛子粉筛后的棉粕粉；
B、混合：取棉粕粉、玉米粉、混合酵母菌固体菌种、营养盐、混合酶制剂和水混匀得发酵料；
C、发酵：将发酵料在好氧状态下于30～35℃下发酵45～50h，干燥后即得到发酵棉籽蛋白。
7.根据权利要求6所述的发酵棉籽蛋白的制备方法，其特征在于：步骤B中，好氧状态发酵时发酵料的厚度为不大于60mm。
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