CN106011216A - 一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物联合培养生产1,5‑戊二胺的方法。该方法包括：配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液以及赖氨酸溶液；对发酵罐，步骤1中的培养基以及三角瓶灭菌，其中步骤1中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌；取三角烧瓶接入种子培养基，分别接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌培养后作为发酵菌种；向装有发酵培养基的发酵罐中通入无菌空气或纯O2，接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌作为出发菌株，并加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液和乳糖诱导液，控制菌体比生长速率发酵；厌氧转化阶段，控制葡萄糖浓度和pH即得产物1,5‑戊二胺的方法。本发明方法简单易行，节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及1,5-戊二胺发酵和生物催化领域，具体涉及一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法。
背景技术
1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine ），又名尸胺（Cadaverine）、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺或尸毒素，是生物胺类（包括腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等）中的一种，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成的产物。在农业、医学和工业上具有广泛的应用。在农业上, 1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育,改善植物果实发育,提高果实产量；医学上，亦可以作为一种有效治疗痢疾的药物成份；工业上是一种极为重要的化工原料，与己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合可分别形成新型材料聚酰胺5.6、聚酰胺5.4和聚酰胺5.10。
随着经济快速发展，大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。世界上每年消耗大量石化资源来源的聚酰胺，戊二胺作为聚酰胺的重要组成单体，生物法合成戊二胺具有经济学和生态学双重意义，生物法合成戊二胺的基因工程菌主要有谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌。目前生物法合成1,5-戊二胺主要有两种方式：发酵法和生物转化法。发酵法原料来源广泛且可再生，成本低，产量也较高，污染也较小，但其调控过程比较复杂；生物转化法产量高，成本低，过程简单，有利于下游提取操作。但其要实现工业化生产，需要获得大量菌体，这就需要有合适的培养基和发酵培养技术。而微生物联合培养则是联合培养一株一葡萄糖为唯一碳源的高产丁二酸大肠杆菌和一株以甘油为唯一碳源产高活性赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌，将发酵和转化有机结合在一起来进行，该方法不仅节约发酵成本，而且省略了收集菌体这一步骤。并且该方法可以直接得到丁二酸戊二胺盐，可用于聚酰胺5.4合成。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，简化生产方法，降低生产成本。
一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液以及转化用赖氨酸溶液；
步骤2，对发酵罐，发酵培养基，种子培养基，葡萄糖补料培养液，甘油补料培养液，乳糖诱导液，赖氨酸溶液以及三角瓶进行灭菌处理，其中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌后再于其他成分合并；
步骤3，取两个灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，分别接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌摇床培养后作为发酵菌种；
步骤4，将灭过菌的发酵培养基接入发酵罐中，通入无菌空气或纯O2，再按照接种量总体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，向发酵罐中加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液和乳糖诱导液，发酵过程中控制菌体比生长速率，温度，pH和溶氧；
步骤5，当菌体干重达到15-20g/L，停止通无菌空气或纯O2，转入厌氧转化过程，在此过程中添加葡萄糖补料培养液控制葡萄糖浓度在1-4g/L之间，用赖氨酸溶液来控制pH在6.5-7.5之间，发酵24小时得产物1，5-戊二胺。
作为优选的是, 步骤1中发酵培养基的中葡萄糖与甘油的总含碳浓度为25-50g/L。
作为优选的是,发酵菌种中产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌的接种体积比为15：（1–3）。
作为优选的是，步骤4中通入无菌空气或纯O2的量为0.03-0.08L/（min· L），葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液补加按照设定比生长速率在0.04-0.08h-1之间进行指数流加，乳糖诱导培养液流加速率为20-50mL/h 。
作为优选的是，步骤4中，温度控制在32-37℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在25%-35%。
作为优选的是,步骤4中pH通过体积比为50%的氨水来调节。
作为优选的是，步骤5中控制葡萄糖浓度在1-4g/L。
有益效果
本发明方法使得1,5-戊二胺的生产方法变得更加简单，与全细胞转化相比不仅省去了收集菌体的步骤，而且有效的省去了转化过程中酸的添加。转化过程中产生的二氧化碳也得到了充分的利用，这从很大程度上节约了生产成本。
附图说明
图1为本发明微生物联合培养产物MS分析结果，其中峰1为单丹酰尸胺；
图2为微生物联合培养产物MS分析结果，其中峰2为双丹酰尸胺。
具体实施方式
实施例1
一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液、赖氨酸溶液，配方如下：
种子培养基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 0.8%，氨苄青霉素0.01%，氯霉素0.01%，pH7.0。
发酵培养基（g/L）：3.0 g citric acid, 3.0 g Na2HPO4·7H2O, 8.00 g KH2PO4,0.20 g NH4Cl, 0.75 g (NH4)2SO4, 0.84 g NaHCO3, 1.00gMgSO4·
7H2O, 10.0 mg CaCl2·2H2O,0.28mg FeSO4·7H20，20mg/L硫胺素（过滤除菌），2mg/L生物素（过滤除菌），微量元素混合液 0.1%，30g/L葡萄糖（分消），2g/L甘油（分消），氨苄青霉素0.01%，氯霉素0.01%。
微量元素混合液（M）：(NH4)6Mo7O24 3x10-9 M，H3BO3 4x10-7 M，CoCl2·6H20 3x10-8 M，CuSO4·5H2O 1x10-8 M，MnCl2·4H20 8x10-8 M，ZnSO4·7H2O 1x10-8 M。
葡萄糖补料培养液：600g/L葡萄糖溶液，灭菌条件为115 ℃，10 min。
甘油补料培养液：230g/L甘油溶液。灭菌条件为115 ℃，10 min。
乳糖诱导培养液：120g/L乳糖溶液。灭菌条件为115 ℃，10 min。
赖氨酸溶液：400g/L赖氨酸溶液。
步骤2，对发酵罐，发酵培养基，种子培养基，葡萄糖补料培养基，甘油补料培养基，乳糖诱导培养基，赖氨酸溶液以及500ml三角瓶在121℃下灭菌15min备用，其中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌后再于其他成分合并；
步骤3，取灭菌后的三角烧瓶，接入50ml种子培养基，分别接入产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌株，摇床37℃转速为200rpm下培养8小时；
步骤4，将发酵培养基接入灭过菌的发酵罐中，通入无菌空气，通气量为0.07L/（min·L），再按照接种量与发酵培养基的体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，其中产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌株比例为15:1，使菌体生长并消耗发酵罐中的发酵培养基，待培养基中的初始碳源消耗完后按照发酵培养基中葡萄糖与甘油比例补加葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液，过程中控制菌体比生长速率为0.07h-1，同时以30ml/h的速率添加乳糖诱导培养液；
步骤5，待菌体干重达到15g/L时停止通入空气，在此之前发酵过程pH控制为6.8，温度为37℃。停止通空气后，改通CO2，同时停止流加甘油补料培养液和乳糖诱导培养液，继续流加葡萄糖补料培养液，在这个过程中控制糖浓度在1-2g/L之间，并用赖氨酸溶液代替氨水来控制pH为6.8，温度控制为37℃，24小时后测定戊二胺产量。
1,5-戊二胺含量用丹磺酰氯衍生化后，HPLC-MS分析。衍生步骤如下：移取100 ul离心后的转化液到5 ml离心管中，依次加入2 M NaOH溶液200 μl, 饱和NaHCO3溶液300 μl，10 g/1的1,7-二氨基庚烷溶液（内标）100 μl及10 g/l 的丹磺酰氯溶液1 ml。混匀后置于40 ℃水浴中避光反应45 min，而后加入25%的氨水100 μl，混匀后室温避光静置30 min。反应结束后，用乙腈定容至5 ml。
HPLC-MS分析使用电喷雾离子质谱，色谱柱为Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6mm × 5 μm)。HPLC条件为：流动相A：100% 乙腈，流动相B：0.1 M 乙酸铵溶液，采用梯度洗脱，条件如下：初始：50% A；19 min：90% A；20-30 min：50% A；流速：1.0 ml/min；柱温：40±1 °C；进样量：10 μl。检测使用紫外检测器，检测波长254 nm。
转化产物经HPLC-MS分析（如图1、图2所示），峰1分子量为335（336-1=335），峰2分子量为568（569-1=568），分别于单丹酰尸胺和双丹酰尸胺的分子量吻合。
实施例2
步骤1至步骤3同实施例1。
步骤4，将发酵培养基接入灭过菌的发酵罐中，并加入按15:1配比的葡萄糖和甘油溶液通入无菌空气，通气量为0.07L/（min·L），再按照接种量与发酵培养基的体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，其中产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌株比例为15:1，使菌体生长并消耗发酵罐中的发酵培养基，待培养基中的初始碳源消耗完后按照发酵培养基中葡萄糖与甘油比例补加葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液，过程中控制菌体比生长速率为0.07h-1，同时以30ml/h的速率添加乳糖诱导培养液；
步骤5，待菌体干重达到15g/L时停止通入空气，在此之前发酵过程pH控制为6.8，温度为37℃。停止通气后，此步骤不通入CO2，丁二酸生产所需固定的CO2由赖氨酸脱羧提供，同时停止流加甘油补料培养液和乳糖诱导培养液，继续流加葡萄糖补料培养液，在这个过程中控制糖浓度在1-2g/L之间，并用赖氨酸溶液代替氨水来控制pH为6.8，温度控制为37℃。24小时后测定戊二胺产量。测量方法同实施例1。
实施例3
步骤1-步骤3同实施例1，其中发酵培养基中葡萄糖浓度为25g/L，甘油浓度为5g/L。
步骤4，将发酵培养基接入灭过菌的发酵罐中，并加入按5:1配比的葡萄糖和甘油溶液通入无菌空气，通气量为0.07L/（min·L），再按照接种量与发酵培养基的体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，其中产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌株比例为5:1，使菌体生长并消耗发酵罐中的发酵培养基，待培养基中的初始碳源消耗完后按照发酵培养基中葡萄糖与甘油比例补加葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液，过程中控制菌体比生长速率为0.07h-1，同时以25ml/h的速率添加乳糖诱导培养液；
步骤5，待菌体干重达到20g/L时停止通入空气，在此之前发酵过程pH控制为6.8，温度为37℃。停止通空气后，改通CO2，同时停止流加甘油补料培养液和乳糖诱导培养液，继续流加葡萄糖补料培养液，在这个过程中控制糖浓度在1-2g/L之间，并用赖氨酸溶液代替氨水来控制pH为6.8，温度控制为37℃。24小时后测定戊二胺产量。测量方法同实施例1。
对比例
以上述产赖氨酸脱羧酶菌株进行发酵，并在后期投入底物赖氨酸用丁二酸进行pH调控，其他反应条件同实施例1，发酵结束后发酵液中戊二胺最高浓度达到50.62g/L。
本发明方法产1,5-戊二胺的产量记录于下表中。
从上述数据可以看出，本发明产1,5-戊二胺量大，制备过程简单，适合产业化。
Claims (7)
1.一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，配种子培养基、发酵培养基、葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液、乳糖诱导液以及赖氨酸溶液；
步骤2，对发酵罐，发酵培养基，种子培养基，葡萄糖补料培养液，甘油补料培养液，乳糖诱导液，赖氨酸溶液以及三角瓶进行灭菌处理，其中发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌后再于其他成分合并；
步骤3，取两个灭菌后的三角烧瓶，接入灭菌后的种子培养基，分别接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌摇床培养后作为发酵菌种；
步骤4，将灭过菌的发酵培养基接入发酵罐中，通入无菌空气或纯O2，再按照接种量总体积比为10%向发酵罐中接入发酵菌种，向发酵罐中加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液和乳糖诱导液，发酵过程中控制菌体比生长速率，温度，pH和溶氧；
步骤5，当菌体干重达到15-20g/L，停止通无菌空气或纯O2，转入厌氧转化过程，在此过程中添加葡萄糖补料培养液控制葡萄糖浓度，用赖氨酸溶液来控制pH，发酵24小时得产物1，5-戊二胺。
2.根据权利要求1所述微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤1中发酵培养基的中葡萄糖与甘油的总含碳浓度为25-50g/L。
3.根据权利要求1所述微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤4中，发酵菌种中产丁二酸菌与产赖氨酸脱羧酶菌的接种体积比为15：（1–3）。
4.根据权利要求1所述微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤4中，通入无菌空气或纯O2的量为0.03-0.08L/（min·L），葡萄糖补料培养液和甘油补料培养液补加按照设定比生长速率在0.04-0.08h-1之间进行指数流加，乳糖诱导培养液流加速率为20-50mL/h。
5.根据权利要求1所述微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤4中，温度控制在32-37℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在25%-35%。
6.根据权利要求1所述微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤4中发酵过程中pH通过体积比为50%的氨水来调节。
7.根据权利要求1所述微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于：步骤5中控制葡萄糖浓度在1-4g/L。
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