CN107058414B - 一种制备l-丙氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备L‑丙氨酸的方法，其为，在利用葡萄糖浓度为110‑125g/L的葡萄糖培养基对德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108进行培养的过程中，当发酵液中残糖含量低于50g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，继续培养至发酵结束。本方法操作简单易行，可以提高L‑丙氨酸的发酵水平，降低残糖含量，缩短发酵周期，提高转化率。

Description

一种制备L-丙氨酸的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种用于制备L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸是人体血液中含量最高的氨基酸，具有广泛的用途。L-丙氨酸具有独特的改善风味的效果，食品和饮料中添加L-丙氨酸可以明显提高食品和饮料中蛋白质的利用率，从而改善有机酸的酸味；L-丙氨酸是一种很好的利尿药，是生产维生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；另外添加L-丙氨酸还可以提高聚乳酸的性能。
目前，工业上大多采用酶法生产L-丙氨酸，即通过富含L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物细胞催化L-天冬氨酸而得到。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备投资小，提取工艺简单，但主要原料L-天冬氨酸价格波动太大，不能保证常年稳定生产。近年来，出现了以葡萄糖为主要原料、厌氧直接发酵生产L-丙酸的方法，随着L-丙氨酸含量的不断积累，残糖含量逐渐降低，但是当残糖降低到一定程度时，菌种的代谢能力下降，致使发酵周期延长，残糖不能进一步消耗，发酵转化率难以进一步提高，造成后提取困难，生产成本增加。因此开发出一种能够有效提高L-丙氨酸发酵水平的方法具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备L-丙氨酸的方法，其为：在利用葡萄糖浓度为110-125g/L的葡萄糖培养基对德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108进行培养的过程中，当发酵液中残糖含量低于50g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，继续培养至发酵结束。
考虑到微生物培养的特殊性和实验误差，上述与种子液相同的新鲜种子液是指二者的制备方法相同，且二者的OD值的大小差别在0.5以内。
本发明所用的菌种为：Lds.0108，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO：M2013361。
当发酵进行到后期时，营养成分大大消耗，各种次级代谢产物逐渐积累，对参与反应的各种酶的活力产生了不利影响，菌种的代谢活力降低，发酵液中的营养成分减少，此时，向处于发酵后期的发酵液中加入新鲜的种子液，由于新鲜种子液中菌种处于对数生长期，菌种的代谢活力强，营养成分高，参与代谢反应的酶活力较高，因此在其它发酵条件不变的情况下，L-丙氨酸的发酵水平得到提高，残糖降低，转化率提高，发酵周期缩短，从而降低了生成成本。
优选的，当发酵液中残糖含量为30-45g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液。当残糖含量在这个范围内时，发酵液中的营养成分逐渐减少，菌种的代谢活力逐渐降低，及时补加新鲜种子液，可以最大限度地提高转化率。
优选的，补加的新鲜种子液的体积占补加后发酵液总体积的1.5％-3.0％。若补加的新鲜种子液太少，则菌种数量较少，酶活力不够，达不到预期效果；若补加的新鲜种子液太多，则占用较多发酵罐体积，同时造成不必要的浪费。
优选的，所述新鲜种子液OD值为4.0-8.0。此时新鲜种子液中菌种处于对数生长期，菌种的代谢活力强，营养成分高，参与代谢反应的酶活力较高。
优选的，每升所述葡萄糖培养基中，包括葡萄糖110-125g，Na2HPO4·12H2O 20g，KH2PO4 2.0g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量无机盐溶液10ml/L，余量为纯化水；
所述微量无机盐溶液中：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量。
优选的，所述培养条件为：温度：30℃；通风量：0m3/h，压力：0.04MPa-0.06MPa；pH：6.5-7.0。在实际生产中一般都是用液氨来调节pH，一方面控制pH，另一方面可以补充无机氮源。
上述的优选方案中的一个或多个，均可与总的培养方案：在利用葡萄糖浓度为110-125g/L的葡萄糖培养基对德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108进行培养的过程中，当发酵液中残糖含量低于50g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，继续培养至发酵结束；进行组合使用，组合后所得的任何一个方案均在本申请要保护的范围内。
进一步优选的，本发明所述的方法，包括如下步骤：
1)制备德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108种子液；
2)向所述葡萄糖培养基中接种体积分数为5-10％的所述种子液进行发酵培养；
3)当发酵液中葡萄糖的浓度小于50g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，继续培养至发酵结束。
优选的，所述种子液的制备包括如下步骤：
1)在无菌条件下，将菌种接种到LB斜面培养基上，在30℃条件下恒温培养18h；
2)在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面上的菌体洗下，制成菌悬液；
3)将菌悬液接种到灭菌后的液体LB培养基中，发酵条件为：温度：30℃；空气流量：2L/min，罐压0.04-0.06MPa；培养至OD值为4.0-8.0。
更优选的，本发明所述的方法，包括如下步骤：
1、制备德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108种子液；
1)在无菌条件下，将菌种接种到LB斜面培养基上，在30℃条件下恒温培养18h；
2)在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面上的菌体洗下，制成菌悬液；
3)将菌悬液接种到灭菌后的液体LB培养基中，发酵条件为：温度：30℃；空气流量：2L/min，罐压0.04-0.06MPa；培养至OD值为4.0-8.0；
2、德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108的培养
向葡萄糖培养基中接种6％的所述种子液，在温度：30℃；通风量：0m3/h，压力：0.04MPa-0.06MPa；液氨控制pH：6.5-7.0的条件下进行发酵；
所述新鲜培养基的组成为每升所述葡萄糖培养基中，包括葡萄糖110-125g，Na2HPO4·12H2O 20g，KH2PO4 2.0g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量无机盐溶液10ml，余量为纯化水；
所述微量无机盐溶液中：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量。
3、补充新鲜种子液
当发酵液中葡萄糖的浓度为30-45g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，至补加的新鲜种子液的体积占补加后发酵液总体积的1.5％-3.0％，继续培养至发酵结束。
本发明所述的方法包括如下有益效果：
本发明的方法在培养的后期添加新鲜种子液，由于酶活力的提高，可提高对培养基中营养成分的利用率，进而提高L-丙氨酸的产量，还可缩短发酵的周期。放罐后发酵液中L-丙氨酸的浓度由不补加种子液的80-90g/L提高到100-110g/L，残糖含量由原来的1.3-2.1g/L降低到0.5-0.8g/L，发酵周期由原来的42h缩短到36h，发酵转化率由原来的约80％提高到约90％。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及一种制备L-丙氨酸的方法,包括如下步骤:
1、制备种子液
(1)在无菌条件下，将Lds.0108接种到LB斜面培养基上，在30℃恒温培养箱中培养18h。
(2)在无菌条件下，用150ml无菌生理盐水将斜面上的菌体洗下，制成菌悬液。
(3)将菌悬液接种到灭菌后的液体LB培养基中，10L种子罐按7L配料。温度：30℃；空气流量：2L/min，罐压0.04-0.06MPa；培养时间：5.6h，OD(600nm)：4.30，移种到发酵培养基中。
2、制备葡萄糖培养基
按以下成分含量配制发酵培养基：葡萄糖110g/L，Na2HPO4·12H2O 20g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量无机盐10ml/L，纯化水余量；
其中微量无机盐包括：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量。
121℃灭菌30min，降温到30℃后，备用。
3、将上述制备得到的种子液按种量6％接种到所述葡萄糖培养基中，100L发酵罐按70L配料，在发酵温度30℃；空气流量0m3/h，罐压0.04-0.06MPa的条件下进行培养；发酵过程中采用液氨控制pH为6.5-7.0；
4、当发酵液中残糖含量为33.6g/L时，补加新鲜种子液(新鲜种子液按与种子液相同的方法制备，其OD值为4.25)，补加的新鲜种子液的体积占补加后总发酵液体积的2.0％，继续培养至发酵结束，整个发酵周期为22h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为97g/L，残葡萄糖浓度为0.5g/L，发酵转化率为88.2％。
实施例2
本实施例涉及一种制备L-丙氨酸的方法,包括如下步骤:
1、按照与实施例1中相同的方法，制备得到OD值为5.24的种子液；
2、制备葡萄糖培养基
按以下成分含量配制发酵培养基：葡萄糖120g/L，Na2HPO4·12H2O 20g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量无机盐10ml/L，纯化水余量；
其中微量无机盐包括：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量。
将上述培养基在121℃灭菌30min，降温到30℃后，备用。
3、将上述制备得到的种子液按种量6％接种到所述葡萄糖培养基中，100L发酵罐按70L配料，在发酵温度30℃；空气流量0m3/h，罐压0.04-0.06MPa的条件下进行培养；发酵过程中采用液氨控制pH为6.5-7.0；
4、当发酵液中残糖含量为38.7g/L时，补加新鲜种子液(新鲜种子液按与种子液相同的方法制备，其OD值为5.36)，补加的新鲜种子液的体积占补加后总发酵液体积的2.5％，继续培养至发酵结束，整个发酵周期为25h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为107g/L，残葡萄糖浓度为0.6g/L，发酵转化率为89.2％。
实施例3
本实施例涉及一种制备L-丙氨酸的方法,包括如下步骤：
1、制备种子液
(1)在无菌条件下，将Lds.0108接种到LB斜面培养基上，在30℃恒温培养箱中培养18h。
(2)在无菌条件下，用150ml无菌生理盐水将斜面上的菌体洗下，制成菌悬液。
(3)将菌悬液接种到灭菌后的液体LB培养基中，100L种子罐按70L配料。温度：30℃；空气流量：20L/min，罐压0.04-0.06MPa；培养时间：5.2h,OD(600nm)：3.25，移种到二级种子培养基中。
(4)将一级种子液接种于液体LB培养基中，10T种子罐按7T配料。温度：30℃；空气流量：120m3/h，罐压0.04-0.06MPa；培养时间：6.5h，OD(600nm)：7.65，移种到发酵培养基中。
2、制备培养基
按以下成分含量配制发酵培养基：葡萄糖125g/L，Na2HPO4·12H2O 20g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，微量无机盐10ml/L，纯化水余量；
其中微量无机盐包括：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量。
121℃灭菌30min，降温到30℃后，备用。
3、将上述制备得到的种子液按种量6％接种到所述葡萄糖培养基中，100T发酵罐按70T配料，在发酵温度30℃；空气流量0m3/h，罐压0.04-0.06MPa的条件下进行培养；发酵过程中采用液氨控制pH为6.5-7.0；
4、当发酵液中残糖含量为41.2g/L时，补加新鲜种子液(新鲜种子液按与种子液相同的方法制备，其OD值为7.46)，补加的新鲜种子液的体积占补加后总发酵液体积的3.0％，继续培养至发酵结束，整个发酵周期为36h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为112g/L，残葡萄糖浓度为0.8g/L，发酵转化率为89.6％。
对比例1
与实施例1相比，其区别在于，不额外添加新鲜种子液，即没有步骤4的操作，直接利用最初的培养液至发酵完成，培养周期为30h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为88g/L，残葡萄糖浓度为2.1g/L，发酵转化率为80％。
对比例2
与实施例1相比，其区别在于，当溶液中残糖的浓度为24.8g/L时，补加相同的新鲜种子液，培养周期为25h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为93.5g/L，残葡萄糖浓度为1.0g/L，发酵转化率为85％。
对比例3
与实施例1相比，其区别在于，当溶液中残糖的浓度为53.6g/L时补加相同的新鲜种子液，培养周期为27h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为91g/L，残葡萄糖浓度为1.4g/L，发酵转化率为82.7％。
对比例4
与实施例1相比，其区别在于，补加新鲜种子液至新鲜种子液占发酵液总体积的1.3％，培养周期为28h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为90g/L，残葡萄糖浓度为1.5g/L，发酵转化率为81.8％。
对比例5
与实施例1相比，其区别在于，补加新鲜种子液的OD值为3.16，培养周期为25h。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中L-丙氨酸含量为94.5g/L，残葡萄糖浓度为0.9g/L，发酵转化率为85.9％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种制备L-丙氨酸的方法，其特征在于，在利用葡萄糖浓度为120-125g/L的葡萄糖培养基对德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108进行培养的过程中，向所述葡萄糖培养基中接种6%的种子液，进行发酵，当发酵液中残糖含量为38.7-45g/L时，向发酵液中补加与接种时的种子液相同的新鲜种子液，所述新鲜种子液OD值为5.36-8.0，补加的新鲜种子液的体积占补加后发酵液总体积的2.5%-3.0%继续培养至发酵结束；
所述德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108菌种为：Lds.0108，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M2013361。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每升所述葡萄糖培养基中，包括葡萄糖120-125g，Na2HPO4·12H2O 20g，KH2PO4 2.0g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量无机盐溶液10ml，余量为纯化水；
所述微量无机盐溶液中：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养条件为：温度：30℃；通风量：0m3/h，压力：0.04MPa-0.06MPa； pH：6.5-7.0。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108种子液；
2）向所述葡萄糖培养基中接种体积分数为6%的所述种子液进行发酵培养；
3）当发酵液中葡萄糖的浓度为38.7-45g/Lg/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，继续培养至发酵结束。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备包括如下步骤：
1）在无菌条件下，将菌种接种到LB斜面培养基上，在30℃条件下恒温培养18h；
2）在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面上的菌体洗下，制成菌悬液；
3）将所述菌悬液接种到灭菌后的液体LB培养基中，发酵条件为：温度：30℃；空气流量：2L/min，罐压0.04-0.06MPa；培养至OD值为5.24-8.0。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、制备德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108种子液；
1）在无菌条件下，将菌种接种到LB斜面培养基上，在30℃条件下恒温培养18h；
2）在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面上的菌体洗下，制成菌悬液；
3）将菌悬液接种到灭菌后的液体LB培养基中，发酵条件为：温度：30℃；空气流量：2L/min，罐压0.04-0.06MPa；培养至OD值为5.24-8.0；
B、德氏乳杆菌突变菌株Lds.0108的培养
向葡萄糖培养基中接种6%的所述种子液，在温度：30℃；通风量：0m3/h，压力：0.04MPa-0.06MPa；液氨控制pH：6.5-7.0的条件下进行发酵；
所述新鲜培养基的组成为每升所述葡萄糖培养基中，包括葡萄糖120-125g，Na2HPO4·12H2O 20g，KH2PO4 2.0g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量无机盐溶液10ml，余量为纯化水；
所述微量无机盐溶液中：FeCl3·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CuCl2·2H2O0.1g/L，ZnCl2 0.2g/L，Na2MoO4·2H2O 0.3g/L，H3BO3 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，纯化水余量；
C、补充新鲜种子液
当发酵液中葡萄糖的浓度为38.7-45g/L时，向发酵液中补加与种子液浓度相同的新鲜种子液，至补加的新鲜种子液的体积占补加后发酵液总体积的2.5%-3.0%，继续培养至发酵结束。
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