CN104372037A - 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104372037A CN104372037A CN201410609027.0A CN201410609027A CN104372037A CN 104372037 A CN104372037 A CN 104372037A CN 201410609027 A CN201410609027 A CN 201410609027A CN 104372037 A CN104372037 A CN 104372037A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tank
- residual sugar
- sugar
- succinic acid
- grades
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241000948980 Actinobacillus succinogenes Species 0.000 claims abstract description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 13
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 10
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 230000004941 influx Effects 0.000 claims description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 claims description 3
- 235000014380 magnesium carbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229960001708 magnesium carbonate Drugs 0.000 claims description 3
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 claims description 3
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 abstract 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000004631 polybutylene succinate Substances 0.000 description 4
- 229920002961 polybutylene succinate Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 241000417230 Actinobacillus succinogenes 130Z Species 0.000 description 1
- 241000722955 Anaerobiospirillum Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000005431 greenhouse gas Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- -1 poly butylene succinate Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液；第二步，对串联发酵罐组、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；第三步，取灭菌后的血清瓶，接入灭菌后的种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌（ Actinobacillus succinogenes ）NJ113摇床培养后作为发酵菌种；第四步，多级连续发酵。由于本发明生产方法简单，丁二酸的产率和纯度高，适合产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于丁二酸制备领域，具体涉及一种多级连续发酵生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸，又名琥珀酸（succinate acid），是一种常见的天然有机酸，是三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在于动、植物和微生物中。作为一种重要的碳四平台化合物，丁二酸是重要的中间产物和1，4-丁二醇（BDO）、γ-丁内酯、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、已二酸、苹果酸以及新型的生物降解塑料产品聚丁二酸丁二醇酯（PBS）等专业化学制品的前体物质，这些化学品的市场总额达150亿美金。最新的研究结果还表明丁二酸在生物降解塑料的制备应用方面具有非常广阔的前景。将丁二酸与1,4-丁二醇进行聚合反应可生成一类新型的生物降解塑料产品——聚丁二酸丁二醇酯（PBS）。
丁二酸的合成方法有化学法和生物法，目前工业应用的主要为化学法生产丁二酸。化学法主要有催化加氢法、石蜡氧化法、电化学合成法。但是化学法主要利用不可再生的石油资源作为原料，成本高，污染严重而且无法可持续发展，严重限制了丁二酸的发展。近年来，随着石化资源的日益枯竭，环境危机日益加剧，越来越多的国内外研究者将目光放在了生物法制备丁二酸上。与传统化学法相比，生物法具有明显的优势。生物法发酵丁二酸具有成本低、优良的环境效益以及具有固定温室气体CO2等优势。丁二酸是三羧酸循环的中间代谢产物，也是众多厌氧微生物和兼性厌氧微生物的还原性终端代谢产物，几乎所有的动植物均能合成丁二酸，常用微生物有产琥珀酸厌氧螺菌，产琥珀酸放线杆菌，大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，曼海姆产琥珀酸菌等。
中国专利CN101857888 A 公开了一种利用乳清发酵生产丁二酸的方法，采用产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培养基中发酵产琥珀酸，产物浓度高达47.51g/L，收率高达67.9％。
发明内容
解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，制备过程简单，丁二酸产量高。
技术方案：为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：
一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：
第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液；
第二步，对发酵罐、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；
第三步，取灭菌后的血清瓶，接入灭菌后的种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes ）NJ113摇床培养后作为发酵菌种；
第四步，多级连续发酵，将灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入气体，再按照接种量体积比为3-10%接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级发酵罐、三级发酵罐，依次流到最后一级发酵罐中，通过调节通气量、一级发酵罐的初糖浓度、各级发酵罐的补糖速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率控制各级发酵罐内的糖浓度，通过控制各级发酵罐中细胞生物量和细胞回流速率来完成丁二酸的发酵，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为35-40℃进行50-750h。
作为优选的是，当发酵罐数量为3个时，该三级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：90%-80%残糖；二级：60%-45%残糖；三级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为4个时，该四级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级：70%-55%残糖；三级：40%-25%残糖；四级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为5个时，该五级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为6个时，该六级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级：80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：50%-40%残糖；五级：30%-20%残糖；六级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为7个时，该七级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级：80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：60%-45%残糖；五级：45%-35%残糖；六级：35%-15%残糖；七级：15%-0%残糖。
作为优选的是，第四步，所述气体为体积比为1:1的CO2和H2的混合气、纯CO2 或纯N2中的一种，通气量为0.01-0.04 L/（min·L）。
作为优选的是，第四步，一级发酵罐的初糖浓度为50- 150 g/L，各级发酵罐的补糖速率为10-40 ml/h，发酵液流出速率为40-160 ml/h，发酵液流入速率为10-150 ml/h，细胞回流速率10-50 ml/h。
作为优选的是，碳源补料罐培养液为葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中一种。
作为优选的是，第四步，pH通过加入碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁中的一种或多种来调节。
有益效果
本发明利用多级连续发酵生产丁二酸的方法简单，易操作，与现有发酵技术相比，丁二酸的产量高，适合工业化操作。
附图说明
图1为丁二酸标准品的高效液相色谱图；
图2为实施例1的发酵产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明所说的多级连续发酵是根据串联发酵罐的个数来定，如串联三个发酵罐即为三级连续发酵，其中第一个发酵罐为一级发酵罐，第二个发酵罐为二级发酵罐，第三个发酵罐为三级发酵罐。
实施例1
一种多级连续发酵装置生产丁二酸的方法，包括以下步骤：
第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液，配方如下：
种子培养基(g·L-1)：葡萄糖10(分消)，酵母膏5，玉米浆 5，NaHCO3 10，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4·3H2O 15.5，pH 7.0。
初始发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖40(分消)，酵母膏10，玉米浆10，乙酸钠 1.36，KH2PO4 3，MgCl2·6H2O 0.2，CaCl2 0.2，NaCl 1，Na2HPO4·12H2O 0.31，NaH2PO4·2H2O 1.6，pH 7.0。
碳源补料罐培养液(g·L-1)：葡萄糖750。
培养基补料罐培养液(g·L-1)：酵母膏30，玉米浆30，乙酸钠 4.08，KH2PO4 9，MgCl2·6H2O 0.6，CaCl2 0.6，NaCl 3，Na2HPO4·12H2O 0.93，NaH2PO4·2H2O 4.8，pH 7.0。
第二步，取五个1L发酵罐、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及100ml的血清瓶在121℃下灭菌15分钟，备用；
第三步，取灭菌后的血清瓶，接入20ml的种子培养基，通入CO2 ，再接入产琥珀酸放线杆菌NJ113，摇床37℃转速为180 rpm下培养10小时，作为发酵菌种；
第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养基，通入体积比为1:1的CO2和H2混合气，利用储气罐控制通气量为0.02 L/（min·L），按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率20-30ml/h，葡萄糖补糖速率为10-20 ml/h，发酵液流出速率为40-50 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用氢氧化钠控制pH为6.5，发酵温度：37℃，控制细胞回流速率10 ml/h，发酵120 h后，取发酵产物进行高效液相色谱分析，并测定发酵产物的量。
实施例2
第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为200g/L蔗糖溶液。
第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养基，通入体积比为1:1的CO2和H2混合气，利用储气罐控制通气量为0.01L/（min·L），按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率120-150 ml/h，蔗糖补糖速率为30 ml/h，发酵液流出速率为150-160 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为150g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用氢氧化镁控制pH为6.5，细胞回流速率50 ml/h，发酵120 h后，取发酵产物进行高效液相色谱分析，并测定发酵产物的量。
实施例3
第一步至第三步同实施例2。
第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养基，利用储气罐控制纯N2，通气量为0.04 L/（min·L），按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率90-110 ml/h，蔗糖补糖速率为20 ml/h，发酵液流出速率为110 -140ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为80g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用碳酸钠控制pH为6.5，细胞回流速率40 ml/h，发酵120 h后，取发酵产物进行高效液相色谱分析，并测定发酵产物的量。
实施例4
第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为淀粉糖化液。
第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养基，通入纯N2，利用储气罐控制通气量为0.01 L/（min·L），按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率50-70 ml/h，淀粉糖化液补糖速率为30-40 ml/h，发酵液流出速率为80-110 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用碳酸钾和碳酸镁混合控制pH为6.5，细胞回流速率30 ml/h，发酵120 h后，测定发酵产物的量。
实施例5
第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为糖蜜。
第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养基，通入纯CO2，利用储气罐控制通气量为0.02 L/（min·L），按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率110-130 ml/h，糖蜜补糖速率为30-40 ml/h，发酵液流出速率为140-160 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用氢氧化钾控制pH为6.5，细胞回流速率50 ml/h 发酵120 h后，测定发酵产物的量。
实施例6
第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为木质纤维素水解液。
第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养基，通入纯N2，利用储气罐控制通气量为0.04 L/（min·L），按照接种量为10%（v/v）接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率120-130 ml/h，木质纤维素水解液补糖速率为30-40 ml/h，发酵液流出速率为150-160ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用碳酸钠控制pH为6.5，细胞回流速率50 ml/h，发酵120 h后，测定发酵产物的量。
对比例1
以目前文献报道的连续发酵产丁二酸，以A. succinogenes 130Z为出发菌株，采用单级连续发酵的方式，控制葡萄糖糖浓度为20g/L，稀释率为0.2-1.2，丁二酸的最高浓度只有10.4g/L。
对比例2
以A. succiniciproducens ATCC No. 29305为出发菌株，采用单级连续发酵的方式，控制乳糖浓度为20g/L，稀释率为0.03-0.14，丁二酸的最高浓度只有14.0g/L。
将本发明的发酵产物进行液相色谱分析后，与丁二酸标准品的高效液相色谱图对比，确定本发明的发酵产物为丁二酸。与现有技术相比，本发明发酵生产丁二酸的产量高，工艺简单，适合规模化生产发酵，其中表1为本发明不同实施例发酵得产物的量。
表1 本发明不同实施例发酵得产物的量
Claims (6)
1.一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液；
第二步，对发酵罐、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；
第三步，取灭菌后的血清瓶，接入灭菌后的种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes ）NJ113摇床培养后作为发酵菌种；
第四步，多级连续发酵，将灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入初始发酵培养基，通入气体，再按照接种量体积比为3-10%接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级发酵罐、三级发酵罐，依次流到最后一级发酵罐中，通过调节通气量、一级发酵罐的初糖浓度、各级发酵罐的补糖速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率控制各级发酵罐内的糖浓度，通过控制各级发酵罐中细胞生物量和细胞回流速率来完成丁二酸的发酵，发酵全程pH为6.5-7.5，温度为35-40℃进行50-750h。
2.根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：
当发酵罐数量为3个时，该三级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：90%-80%残糖；二级：60%-45%残糖；三级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为4个时，该四级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级：70%-55%残糖；三级：40%-25%残糖；四级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为5个时，该五级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为6个时，该六级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级：80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：50%-40%残糖；五级：30%-20%残糖；六级：15%-0%残糖；
当发酵罐数量为7个时，该七级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级：80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：60%-45%残糖；五级：45%-35%残糖；六级：35%-15%残糖；七级：15%-0%残糖。
3.根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：第四步，所述气体为体积比为1:1的CO2和H2的混合气、纯CO2 或纯N2中的一种，通气量为0.01-0.04L/（min·L）。
4.根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：第四步，一级发酵罐的初糖浓度为50- 150 g/L，各级发酵罐的补糖速率为10-40 ml/h，发酵液流出速率为40-160 ml/h，发酵液流入速率为10-150 ml/h，细胞回流速率10-50 ml/h。
5.根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：碳源补料罐培养液为葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中一种。
6.根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：第四步，pH通过加入碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁中的一种或多种来调节。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410609027.0A CN104372037A (zh) | 2014-09-11 | 2014-11-04 | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410459744X | 2014-09-11 | ||
| CN201410459744.XA CN104152497A (zh) | 2014-09-11 | 2014-09-11 | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 |
| CN201410609027.0A CN104372037A (zh) | 2014-09-11 | 2014-11-04 | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104372037A true CN104372037A (zh) | 2015-02-25 |
Family
ID=51878123
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410459744.XA Withdrawn CN104152497A (zh) | 2014-09-11 | 2014-09-11 | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 |
| CN201410609027.0A Pending CN104372037A (zh) | 2014-09-11 | 2014-11-04 | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410459744.XA Withdrawn CN104152497A (zh) | 2014-09-11 | 2014-09-11 | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN104152497A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106282248A (zh) * | 2016-08-08 | 2017-01-04 | 山东福洋生物科技有限公司 | 一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法 |
| CN107858383A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-03-30 | 北京首钢朗泽新能源科技有限公司 | 一种连续式发酵法制备醇的工艺及装置 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104531782A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-04-22 | 南京工业大学 | 一种用放线杆菌微氧发酵产丙酮酸的方法 |
| CN106011216B (zh) * | 2016-07-28 | 2019-12-27 | 南京工业大学 | 一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法 |
| CN106148444A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-11-23 | 南京工业大学 | 一种多级连续发酵产l‑赖氨酸的方法 |
| CN108130296B (zh) * | 2018-01-17 | 2020-09-01 | 厦门昶科生物工程有限公司 | 一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302546A (zh) * | 2008-06-06 | 2008-11-12 | 江南大学 | 连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法 |
| CN101363033A (zh) * | 2008-09-04 | 2009-02-11 | 江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司 | 2-酮基-d-葡萄糖酸连续发酵工艺 |
| CN101712970A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-05-26 | 南京工业大学 | 一种发酵制备丁二酸的方法 |
-
2014
- 2014-09-11 CN CN201410459744.XA patent/CN104152497A/zh not_active Withdrawn
- 2014-11-04 CN CN201410609027.0A patent/CN104372037A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302546A (zh) * | 2008-06-06 | 2008-11-12 | 江南大学 | 连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法 |
| CN101363033A (zh) * | 2008-09-04 | 2009-02-11 | 江西省德兴市百勤异Vc钠有限公司 | 2-酮基-d-葡萄糖酸连续发酵工艺 |
| CN101712970A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-05-26 | 南京工业大学 | 一种发酵制备丁二酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 姜岷等: "Actinobacillus succinogenes NJ113厌氧发酵产丁二酸培养条件的优化", 《食品与发酵工业》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106282248A (zh) * | 2016-08-08 | 2017-01-04 | 山东福洋生物科技有限公司 | 一种葡萄糖酸钠的连续发酵生产方法 |
| CN107858383A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-03-30 | 北京首钢朗泽新能源科技有限公司 | 一种连续式发酵法制备醇的工艺及装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104152497A (zh) | 2014-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104372037A (zh) | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN103602623B (zh) | 高产l-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产l-丙氨酸的方法 | |
| CN101302546B (zh) | 连续发酵或半连续发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN101709263B (zh) | 一种恒化器连续培养装置 | |
| CN107746862A (zh) | 利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法 | |
| CN106011216A (zh) | 一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法 | |
| CN104651419A (zh) | 一种微生物厌氧发酵联产甘露醇和d-乳酸的方法 | |
| CN104212851A (zh) | 一种多级连续发酵生产l-苯丙氨酸的方法 | |
| CN103952447A (zh) | 一种利用厌氧条件下发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN102286600A (zh) | 一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法 | |
| CN106399387A (zh) | 一种混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法 | |
| CN103667373A (zh) | 微生物发酵产丙酸及其盐联产丁二酸及其盐的方法 | |
| CN108456698A (zh) | 一种基于丁酸梭菌的1,3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法 | |
| CN112592941B (zh) | 一种降低l-组氨酸发酵液粘度的方法 | |
| CN103966298A (zh) | 一种四环素菌渣的循环利用方法 | |
| CN105713932B (zh) | 一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法 | |
| CN104561139A (zh) | 一种提高微生物终细胞密度并缩短培养时间的方法 | |
| CN104498552B (zh) | 一种低pH值胁迫提高ε‑聚赖氨酸产量的方法 | |
| CN103320367A (zh) | 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 | |
| CN103194374B (zh) | 一种发酵生产γ-聚谷氨酸的柱式固定化反应器及其工艺 | |
| CN102321683B (zh) | 采用发酵法制备富马酸发酵液及富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的方法 | |
| CN105177064A (zh) | 一种发酵制备富马酸的工艺 | |
| CN105274018A (zh) | 温敏型谷氨酸棒杆菌、培养基、胶粒及制备方法和应用 | |
| CN102732575A (zh) | 一种利用米根霉发酵生产l-乳酸的方法 | |
| CN101555504B (zh) | 一种利用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株发酵生产d-核糖的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150225 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |