CN109874808B - 丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄子的生防制剂中的应用，本发明通过温室盆栽条件下，对辣椒和茄子接种AMF和/或PSA和病原真菌，研究这些菌剂处理对这两种茄科蔬菜植株光合特性、植株生长发育和灰霉病病害的影响，评价不同AMF+PSA组合促生防病的效应，筛选到高效组合菌剂，为研发促进蔬菜病害的绿色防控措施与可持续安全生产提供技术基础。本发明针对茄科蔬菜所筛选获得的优良AMF+PSA组合菌剂，具备促生防病的药肥双重作用，不仅可为微生物制剂功能与应用提供新思路和途径，对于当代生态农业发展也具有重要意义。

Description

丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科 蔬菜的生防制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用。

背景技术

植物共生微生物在促进作物生长、增强抗逆性、提高产量等发挥着越来越重要的作用。然而，单一的植物共生真菌或共生细菌物种往往难以达到理想的效果，而将一些共生真菌与共生细菌联合接种可协同发挥更大的生理生态效应。一定种类的丛枝菌根真菌(AMF)与植物根围促生细菌(PGPR)组合能够减轻番茄根结线虫的危害、显著提高番茄的番茄红素、抗氧化活性和钾含量、促进薄荷生长、防治黄瓜枯萎病和马铃薯青枯病等；AMF与固氮放线菌弗兰克氏菌(Frankia)联合施用能提高木麻黄在退化和低肥土壤中的存活率，AMF根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)共同作用能更有效改善高粱的品质和增加产量。目前，国际上针对AMF+植物共生放线菌(PSA)对植物病害的影响研究甚少，国内有关AMF+PSA组合对植物的影响研究则尚未见报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供了丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用，本发明通过温室盆栽条件下，对辣椒和茄接种AMF、PSA和病原真菌，研究这些菌剂处理对这两种茄科蔬菜植株光合特性、植株生长发育和灰霉病病害的影响，评价不同AMF+PSA组合促生防病的效应，筛选获得了高效组合菌剂。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用。

进一步的：所述丛枝菌根真菌为摩西斗管囊霉和变形球囊霉。

进一步的：所述植物共生放线菌为浑圆链霉菌、娄彻氏链霉菌和Streptomycescoralus。

进一步的：所述丛枝菌根真菌与植物共生放线菌抵抗的病原真菌为灰葡萄孢。

进一步的：所述摩西斗管囊霉+浑圆链霉菌组成的组合菌剂是用于辣椒的优选生防制剂。

进一步的：所述组合菌剂中摩西斗管囊霉的孢子密度为20个/ml；所述浑圆链霉菌的浓度为4×10⁶CFU·ml^-1。

进一步的：所述摩西斗管囊霉+Streptomyces coralus组成的组合菌剂是用于茄子的优选生防制剂。

进一步的：所述组合菌剂中摩西斗管囊霉的孢子密度为20个/ml；Streptomycescoralus的浓度为4×10⁶CFU·ml^-1。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明中的放线菌是能与植物根系共生的放线菌菌株，这与普通的放线菌不同。将其与植物根系共生的真菌即丛枝菌根真菌菌种进行组合接种以形成三重共生体系，产生更大的生理生态效应。

本发明与不接种对照相比，接种丛枝菌根真菌(AMF)、植物共生放线菌(PSA)和AMF+PSA各处理均能不同程度提高辣椒和茄植株的光合性能、根系活力和生长量；接种病原真菌条件下，接种AMF和PSA处理显著降低植株的病情指数，其中：摩西斗管囊霉+浑圆链霉菌组合对辣椒的促生防病效果最好，对灰霉病的防效达69.1％；摩西斗管囊霉+Streptomycescoralus对茄促生防病效果最佳，对灰霉病的防效达75.5％。

本发明针对茄科蔬菜所筛选获得的优良AMF+PSA组合菌剂，具备促生防病的药肥双重作用，不仅可为微生物制剂功能与应用提供新思路和途径，对于当代生态农业发展也具有重要意义。

附图说明

图1为辣椒和茄中丛枝菌根真菌的侵染定殖状况，其中，A、B为辣椒根系AMF泡囊与菌丝结构；C、D为茄根系AMF泡囊与菌丝结构；

图2为接种丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对辣椒和茄叶片叶绿素含量的影响，其中，不同字母表示差异显著，P＜0.05；

图3为接种丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对辣椒和茄叶绿素荧光的影响，其中，不同字母表示差异显著，P＜0.05；

图4为接种病原真菌条件下各处理辣椒生长发育状况，其中，A为地上部各组合差异；B为地下部各组合差异；

图5为接种病原真菌条件下各处理茄生长状况，其中，A为地上部各组合差异；B为地下部各组合差异；

图6为接种病原真菌条件下丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对辣椒和茄根系活力的影响。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。

实施例1

本发明在温室盆栽条件下，对辣椒和茄分别接种AMF、PSA和病原真菌，研究这些菌剂处理对这两种蔬菜植株光合特性、植株生长发育和灰霉病病害的影响，评价不同AMF+PSA组合促生防病的效应，以期筛选获得高效组合菌剂，为研发促进蔬菜病害的绿色防控措施与可持续安全生产提供技术基础。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)或植物共生放线菌(plantsymbiotic actinomyces，PSA)具有促进植物生长、抑菌、抗逆和防病等作用。本发明旨在评价AMF和PSA对茄科蔬菜促生防病的效应，以期获得高效AMF+PSA组合菌剂。

温室盆栽试验设辣椒(Capsicum annuum品种：羊角椒)和茄(Solanum melongena品种：黑冠长茄)分别接种和不接种AMF摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae,Fm)、变形球囊霉(Glomus versiforme,Gv)、PSA浑圆链霉菌(Streptomyces globosus,Sg)、娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei,Sr)、Streptomyces coralus(Sc)和病原真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)共48个处理，测定各处理植株生长、发病和根系共生体发育状况等。

1材料与方法

1.1试验材料

供试茄科蔬菜为辣椒(Capsicum annuum)品种‘羊角椒’和茄(Solanummelongena)品种‘黑冠长茄’购自北京凤鸣雅世科技发展有限公司。供试AMF为摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae，Fm)和变形球囊霉(Glomus versiforme，Gv)为市售常用菌种，由三叶草培育扩繁，以其根系及基质中的孢子、菌丝和菌根根段为接种物(孢子密度约500个/20ml菌剂)。供试植物共生放线菌为浑圆链霉菌(Streptomyces globosus，Sg)、娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei，Sr)和Streptomyces coralus(Sc)为市售常用菌种；采用高氏1号液体培养基，于28℃和180r·min^-1震荡培养各菌株5d，将其悬浮液稀释至1×10⁸CFU·mL^-1备用。病原真菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)采用PDB培养基，于27℃和180r·min^-1震荡培养10d，过滤后将滤液稀释至1×10⁷CFU·mL^-1备用。盆栽基质为土：砂：草炭＝2:1:1(体积)，经121℃高温灭菌1h后装入消毒的花盆(14cm×23.5cm)。

1.2试验设计

盆栽试验设接种和不接种Fm、Gv、放线菌Sg、Sr、Sc和/或灰葡萄孢，共48个处理，随机排列，重复3次。

1.3试验接种与管理

试验于2018年9月～11月在青岛农业大学日光温室中进行，温度28℃～32℃/15℃～17℃(白天/夜间)。将蔬菜种子用50℃无菌水浸泡30min后用30℃温水浸种8h，之后置于28℃恒温培养箱中，待出芽后选取长势一致的种子播种到装有灭菌基质的消毒花盆中，每盆4～5粒，出苗后观察生长状况，每盆留2～3棵苗。出苗20d后，将12000接种势单位(IPU)AMF菌剂和/或20mL(1×10⁸CFU·mL^-1)PSA悬浮液分别加入相对应处理，不接种对照则接种等量灭菌基质和/或无菌水。

管理期间根据需要进行浇水、补充Hoagland营养液及其他常规管理，40d后测定AMF侵染率、根围PSA定殖数量、光合参数、叶绿素和叶绿素荧光。于植物生长45d后，将20mL(1×10⁷CFU·mL^-1)灰葡萄孢悬液加入接种病原真菌的各处理；于70d后观测供试植株的各项指标。

1.4数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用DPS 7.5和SPSS11.5统计分析软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和双因素方差分析(Two-way ANOVA)，LSD法，差异显著性水平为P<0.05，图表中数据为平均值±标准差。

2丛枝菌根真菌和植物共生放线菌的侵染和定殖情况

采集辣椒和茄的细根系，洗净，加入5％KOH溶液，80℃水浴5min，清洗3次，加2％HCl浸泡5min后，加入0.1％酸性品红-乳酸甘油染色液，室温下过夜，加乳酸脱色，制片镜检，观测并计算菌根侵染率。

去掉表层土采用5点取样法采集植物根围土，将5g土样加入装有95mL灭菌水的三角瓶中，稀释20倍液于28℃150r·min^-1震荡30min，取上清液进行梯度稀释，采用高氏1号培养基以100μL稀释液进行涂布，每处理重复3次，28℃培养7d后观察和计数。

试验表明，接种AMF的辣椒和茄均被侵染定殖，根内可以看到清晰的泡囊、菌丝结构等(图1)。两种蔬菜接种Fm处理的侵染率均高于接种Gv处理的。接种PSA显著提高了Fm的侵染率，其中，辣椒接种Sg和茄接种Sc促进Fm侵染的效应最大；而PSA却降低了Gv的侵染率。Fm提高了根围PSA的数量，Gv降低了根围PSA的定殖数量。方差分析表明，接种AMF与PSA存在交互作用(表1)。

表1不接种病原真菌条件下辣椒和茄丛枝菌根真菌侵染率和根围放线菌数量

注：表格中的数据为LSD法检验的F值，NS表示不显著；*表示在5％水平差异显著；**表示在1％水平差异显著。同列后不同小写字母表示P＜0.05水平时的显著差异性。PSA＝植物共生放线菌，AMF＝丛枝菌根真菌；下同

3丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对茄科蔬菜光合性能的影响

选择晴朗天气，于上午9:30～11:30用光合仪CIRAS-3测定叶片净光合速率(netphotosynthesis rate，P_n)、蒸腾速率(transpiration rate，T_r)、气孔导度(stomatalconductance，G_s)、细胞间隙二氧化碳浓度(intercellular CO₂concentration，C_i)等参数。

所有接种AMF或/和PSA的处理均增加了辣椒和茄叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率和水分利用率。其中，Fm+Sg组合促进辣椒光合性能的作用最大，Fm+Sc组合促进茄的作用最大。方差分析表明，除了茄的水分利用率外，接种AMF与PSA处理存在交互作用(表2)。

表2丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对辣椒和茄光合性能的影响

4.丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对茄科蔬菜叶绿素与叶绿素荧光的影响

植株叶片叶绿素含量的测定：采用SPAD-502型叶绿素仪测定叶片SPAD值。

植株叶片叶绿素荧光的测定：选择晴朗天气，于上午9:30～11:30用PocketPEA荧光仪测定。叶片暗适应30min后测定暗适应PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)。

接种AMF、PSA和AMF+PSA各处理均能促进辣椒和茄叶片叶绿素合成，增加其含量(图2)，其中，Fm+Sg处理的辣椒叶绿素含量是不接种对照的2.5倍；Fm+Sc处理的茄叶绿素含量最高，是不接种对照的1.7倍。对于两种蔬菜叶绿素荧光参数，接种Fm+PSA处理增加了辣椒和茄叶片的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)，但影响并不显著；其余处理对两种植物叶绿素荧光参数均无显著影响(图3)。

5接种病原真菌条件下丛枝菌根真菌和植物共生放线菌对茄科蔬菜生长的影响

采用常规方法测量植物株高、叶面积、根长、鲜重和干重。

接种灰葡萄孢(Bc)抑制了辣椒和茄植株的生长，植株萎蔫，叶片枯黄并出现病斑，接种AMF或/和PSA处理能显著缓解该状况(图4和图5)。其中，Fm的促生效应大于Gv的，Sc的促生效应大于其他两株放线菌的；Fm+Sg+Bc组合促进辣椒生长的效应最大；Fm+Sc+Bc组合促进茄生长的效应最大。方差分析表明，接种病原真菌条件下，AMF与PSA处理存在交互作用(除茄株高外)(表3)。

表3接种病原真菌条件下丛枝菌根真菌和共生放线菌对辣椒和茄生长的影响

注：BC＝灰葡萄孢，下同

6接种病原真菌条件下丛枝菌根真菌和共生放线菌对茄科蔬菜根系活力的影响

称取0.5g洗净的根系于试管中，采用TTC法测定其根系活力。

AMF或/和PSA处理能不同程度提高辣椒和茄的根系活力，其中，Fm+Sg+Bc组合处理的辣椒根系活力是对照的1.9倍，Fm+Sc+Bc组合处理的茄根系活力是对照的2.0倍(图6)。

7丛枝菌根真菌和共生放线菌对茄科蔬菜灰霉病的影响

灰霉病发病程度分级标准为：0级，无病斑；1级，病斑面积占叶面积5％以下；3级，病斑面积占叶面积5％～15％；5级，病斑面积占叶面积15％～25％；7级，病斑面积占整个果面积26％～50％；9级，病斑面积占整个果面积50％以上。

发病率(％)＝(发病植株数/调查总株数)×100％

病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100

相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

接种AMF或/和PSA处理能减轻病害，其中，Fm+Sg+Bc组合处理降低辣椒灰霉病的病情指数与提高相对防效的作用最大；其次是Fm+Sc+Bc组合处理，防效也达50％以上；作用于茄时Fm+Sc+Bc组合处理的灰霉病病情指数最低，相对防效最大，达到了75.5％。方差分析表明，除发病率和辣椒病情指数外，接种AMF与PSA处理存在互作(表4)。

表4接种AMF和PSA对辣椒和茄灰霉病的影响

Andrade等观测到弗兰克氏菌(Frankia sp.)能增加AMF明球囊霉(Glomusclarum)和球状巨孢囊霉(Gigaspora margarita)孢子数量，但不影响AMF的侵染率；而本发明试验则发现Fm和PSA能相互促进对方的侵染与定殖，Gv与PSA则表现一定程度是相互抑制。

本试验结果表明，接种AMF和/或PSA具有促进茄科蔬菜生长、抑制病原真菌和降低发病和提高防效的作用。这些功能在一定条件下又具有互补性和选择性，因此只有适当的AMF和PSA相互组合，才能达到理想的促生防病效果，本试验得出Fm+Sg和Fm+Sc分别是辣椒和茄子促生防病的最佳组合。这与放线菌中的链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌(Nocardia)分泌的一些化学物质对AMF的孢子萌发和菌丝生长有促进作用；以及AMF分泌的某些物质又能提高有益微生物的活性并为其提供了良好的生态位不无关系。这些效应为又为它们协同促生防病奠定了重要的生物学基础。

结果表明，Fm与PSA能相互促进侵染定殖，而Gv与PSA则相互抑制。与不接种对照相比，接种AMF、PSA和AMF+PSA各处理均能不同程度提高辣椒和茄植株的光合性能、根系活力和生长量；接种病原真菌条件下，接种AMF和PSA处理显著降低植株的病情指数，其中Fm+Sg组合对辣椒的促生防病效果最好，对灰霉病的防效达69.1％；Fm+Sc对茄促生防病效果最佳，对灰霉病的防效达75.5％。结论认为，摩西斗管囊霉+浑圆链霉菌和摩西斗管囊霉+Streptomyces coralusSC分别是辣椒和茄子促生防病的高效组合，有待进一步开展田间试验。

单接种AMF或单施放线菌制剂能促进辣椒和茄的生长，抑制病菌，降低病害。本试验则将这两种植物共生微生物进行组合，获得了具有促生防病效应的高效组合，就作者所知，这是国内外鲜有报道的。因此，本试验针对茄科蔬菜所筛选获得的优良AMF+PSA组合菌剂，具备促生防病的药肥双重作用，不仅可为微生物制剂功能与应用提供新思路和途径，对于当代生态农业发展也具有重要意义。然而，本试验供试的AMF和PSA菌种资源有限，不同组合的相互作用特点尚需***、全面和深入的试验。其次，一定AMF与PSA组合相互促进侵染定殖、并能协同发挥生理生态作用的分子机制，有待开展深入研究。同时，有必要开展大田条件下促生防病AMF+PSA组合的筛选试验，以期获得稳定、高效的AMF+PSA组合菌剂，为蔬菜可持续绿色安全生产提供技术。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用，其特征在于：摩西斗管囊霉+浑圆链霉菌组成的组合菌剂是用于辣椒的优选生防制剂。

2.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用，其特征在于：所述组合菌剂中摩西斗管囊霉的孢子密度为20个/ml；所述浑圆链霉菌的浓度为4×10⁶CFU·ml^-1。

3.丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用，其特征在于：摩西斗管囊霉+ Streptomyces coralus组成的组合菌剂是用于茄子的优选生防制剂。

4.根据权利要求3所述的丛枝菌根真菌和/或植物共生放线菌在制备用于辣椒和茄科蔬菜的生防制剂中的应用，其特征在于：所述组合菌剂中摩西斗管囊霉的孢子密度为20个/ml；Streptomyces coralus的浓度为4×10⁶CFU·ml^-1。

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