CN104450597A - 一种石油降解菌固体菌剂的制备方法及由其制备的固体菌剂修复石油污染的土壤的方法 - Google Patents

一种石油降解菌固体菌剂的制备方法及由其制备的固体菌剂修复石油污染的土壤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，具体步骤如下：A、石油降解菌的筛选、驯化、B、制备种子培养液、C、固体菌剂的发酵、D、堆制产品干燥、粉化、计量、包装。本发明的有益效果是:本发明以非离子表面活性剂聚山梨酯-80(土温80)作为增溶剂，能够提高石油的溶解效果。本发明专利所用固体发酵原料易得、工艺较简单，固体菌剂含有大量碳素及营养元素，为细菌生长提供更合适的基质，对微生物亲和力强，固定化效率高。提高所投加微生物与土著微生物的竞争力和降解效率。固体菌剂便于运输和农业操作，适用于石油污染土壤的大规模原位生物修复。

Description

一种石油降解菌固体菌剂的制备方法及由其制备的固体菌剂修复石油污染的土壤的方法
技术领域
本发明涉及石油污染土壤微生物修复技术领域，特别涉及一种石油降解菌固体菌剂的制备方法及由其制备的固体菌剂修复石油污染的土壤的方法。
背景技术
随着经济的迅速发展，人类引发的土壤环境问题日益严重。土壤作为人类不可再生的资源，是人类赖以生存的基础。工农业排放的有毒有害物质与日俱增，对土壤所造成的有机污染呈增长趋势。其中，在石油的开发、运输、加工及储运等过程中排放的石油对土壤环境的危害尤为严重。石油是由多种化学物质组成的混合物，这些物质化学性质不同，主要包括芳香烃、饱和烃、树脂类、沥青等。土壤中过量的石油烃可能会在植物体内过量残留与积累，通过食物链的富集作用使人类的身心健康受到损害。另外，石油中某些污染物成分会随降水渗透到土壤浅层地下水，污染地下水水质，最终危害人体健康。其中对人体危害较大的是多环芳烃(PAHs)类物质，多环芳烃具有致畸性、致癌性和致突变性等作用，而低沸点的润滑油类及燃料油能引起人体的化学性肺炎、皮炎、麻醉和窒息等危害。
目前，我国石油污染土壤修复法包括三种：物理修复法、化学修复法和生物修复法。与物理、化学修复法相比，生物修复方法具有低成本、无二次污染和处理功效较好等优点。生物法主要包括微生物修复、植物修复及植物-微生物联合修复三种。微生物修复技术是利用土壤中的土著微生物或向污染环境补充经驯化的高效微生物，在优化的环境条件下，加速分解污染物，修复被污染的土壤。植物修复是以太阳能为动力，利用植物修复土壤中石油等有机污染物的一项绿色技术(易筱筠,党志,石林,等.有机污染物污染土壤的植物修复[J].农业环境保护,2002,21(5):477-479)，具有处理成本低、生物量大、美化环境等优点，成为人们去除污染物的首选技术(宋玉芳,许华夏,任丽萍,等.两种植物条件下土壤中矿物油和多环芳烃(PAHs)的生物修复研究[J].应用生态学报,2001,12(1):108-112.)。植物-微生物联合修复技术作为一项新兴技术，发挥了植物修复技术的优势，同时弥补了单纯微生物修复具有生物量小、去污能力弱、处理费用高的不足。植物-微生物联合修复技术是迄今为止处理石油污染土壤比较好的一种方法，其具有广阔市场和发展前景。
微生物修复技术在早期便有研究，已衍生出就地处理、原位处理和生物反应器三种微生物修复方式，该类技术已广泛应用于石油污染土壤的修复(沈铁孟,黄国强,李凌,等.石油污染土壤生物通风修复及其强化技术[J].环境污染治理技术与设备,2002,3(7):67-69)。李培军利用生物堆制法对不同类型石油污染土壤进行修复，60d后石油总烃去除率为38.37％～56.74％，处理费用相对较低(李培军,郭书海,孙铁布.不同类型原油污染土壤生物修复技术研究[J].应用生态学报,2002,13(11):1455-1458.)。国内在植物修复方面的研究尚处在起步阶段，在植物与微生物联合修复方面的研究更是少有报道，而我国丰富的植物资源为研究工作提供充足的素材，因此，应充分利用这方面的优势，探究植物和微生物对石油污染土壤的联合修复作用。
植物—微生物联合修复效果主要取决于植物—微生物***对有机污染物的吸收和代谢能力，土壤中有机污染物通过植物及其根际微生物共存体系得到净化。植物—微生物联合体系对有机污染物具有良好的降解作用。其基本原理为：1)植物根区分泌物对细菌的转化具有刺激作用；2)植物为微生物提供生存场所并可转移氧气使根区的好氧转化作用能够正常进行，这也是植物促进根区微生物矿化作用的机制(Anderson T.A.,Guthrie E.A.,Walton B.T..Bioremediation in therhizophere,plant roots and associated microbes clean contaminatedsoil[J].Environ.Sci.Technol.,1993(27):2630-2636.)。
19世纪已经出现生产酵母菌体的工业发酵过程，并采用了通气和补料的技术；20世纪70年代出现了微生物单细胞蛋白的生产。发酵是微生物在人工培养环境中生长并形成代谢产物的过程，也是微生物菌剂生产的常用方法。目前微生物活菌制剂类产品主要有固态发酵和液态发酵两种方式。固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。微生物修复石油污染土壤技术的大面积推广就需要大量的微生物菌剂，国内对石油降解菌剂的研究只开展了实验室小规模培养，没有实现工业化生产。
现已有报道关于以石油烃为唯一碳源筛选石油降解菌的方法，但大多是以单一石油烃或几种石油烃及其中间产物为碳源进行筛选，其培养环境与石油污染土壤中石油烃种类繁多的实际情况相差甚远，因此该条件下筛选的菌种在实际石油污染土壤中的生存能力、降解效率不够理想，将其用于石油污染土壤的治理工程中的实际效果得不到保障。
现有石油降解菌的筛选技术大部分以实验室研究为主，以某种单组份石油烃为底物进行菌种筛选，再以该石油烃为底物评价所筛选菌种的降解效果，也仅仅是实验室小试规模的菌种培养。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种石油降解菌固体菌剂的制备方法及由其制备的固体菌剂修复石油污染的土壤的方法。
本发明采用如下技术方案：
一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，具体步骤如下：
A、石油降解菌的筛选、驯化
1)菌源的采集
取炼油厂常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源。
2)石油降解土著菌的初筛
(1)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样品，加入盛有无菌水的锥形瓶中，置于振荡培养箱中室温振荡0.5～2h，振荡频率为200rpm；
(2)从步骤(1)的锥形瓶中取上清液，接入富集培养基，在温度30℃、转速175rpm摇床上振荡培养48h。取培养后的富集液涂布到筛选培养基平板上，30℃恒温培养48h。
3)驯化
用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化，具体步骤为：先用接种环挑取初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL驯化培养基A中，培养一个周期(在温度30℃、转速175rpm恒温振荡下培养7d为一个周期)，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基B中，培养一个周期。再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基C中，培养一个周期。从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基D中，培养一个周期。从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基E中，培养一个周期，从驯化培养基A到驯化培养基E，石油浓度梯度逐级升高。
4)菌种的纯化
(1)取驯化后的培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d；
(2)从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24h；
(3)由LB斜面再次接种含油平板；
(4)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
(5)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。
B、制备种子培养液
将纯化得到的石油降解菌株分别单独接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；液体种子的菌体密度达到1*107cfu；其中：一级种子采用固态培养基斜面培养，培养条件为30℃，培养24小时；二级种子为液态培养基摇床培养，培养条件为30℃，转速175rpm，培养10-12小时；种子罐培养条件为液体培养基搅拌培养，培养条件为30℃恒温，转速80rpm，通气量1:1。
C、固体菌剂的发酵
将经空气干燥后的废弃物生物质原料，粉碎或辗碎成1-5mm的颗粒状；将生物质颗粒及其他配料装在耐高温的塑料袋中，110℃灭菌1小时待用；
将种子罐中的种子培养液按照重量比10:1的固液比喷洒到堆料表面，将发酵种子培养液与固体发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到固体发酵床上在28-30℃条件下进行增殖培养3-5天，则制得微生物固定化材料；
将步骤B中的一级种子液按比例1:10(v/w)接入处理好的固定化载体中，保持水分50-55％，在28-30℃条件下吸附、固定、增值3-5天；按上述方法增值3次，即得固定化菌剂。
D、堆制产品干燥、粉化、计量、包装
将固定化菌剂在温度为40～60℃条件下干燥，至含水量为6～10％，将菌剂粉碎，过5mm筛。
在上述方案的基础上，步骤A和B中所使用的培养基中均含有石油和聚山梨酯-80的增溶液。
在上述方案的基础上，所述石油和聚山梨酯-80的增溶液中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。
在上述方案的基础上，所述富集培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0.5g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO30.24g，KH2PO40.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述筛选培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，琼脂20g，NaCl0.5g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO30.24g，KH2PO40.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基A为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基B为：
含石油0.050g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基C为：
含石油0.075g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基D为：
含石油0.100g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基E为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述含油平板用培养基为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
LB斜面用培养基为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
微量元素溶液：MnSO439.9mg，ZnSO4·7H2O 42.8mg，FeCl2·4H2O15.73mg，CuSO440mg，蒸馏水1000mL。
菌种保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
上述方法制备的石油降解菌固体菌剂用于修复石油污染的土壤。具体的方法为：将所制备的石油降解菌固体菌剂按照10-100公斤/亩土地投加于石油污染土壤中，同时辅助施加化肥和有机肥，翻耕0-30cm表土混匀，同时种植玉米、黄豆和苜蓿三种作物中的一种。
本发明的有益效果是:
(1)本发明以非离子表面活性剂聚山梨酯-80(土温80)作为增溶剂，先制备石油聚山梨酯-80增溶液，再将一定量的石油聚山梨酯-80增溶液加入到培养基中，能够提高石油的溶解效果，解决石油在培养基中溶解难的问题。
(2)真正做到以石油为唯一碳源，在石油降解菌的初筛、驯化、纯化、种子液的制备及固体菌剂的发酵等过程中培养基均以石油聚山梨酯-80增溶液为碳源。在菌株驯化过程中驯化培养基中的石油浓度梯度逐渐升高，菌株逐渐驯化而适应含油培养基，因此该条件下筛选的菌种在实际土壤中的生存能力、降解效率得到提高，将其用于石油污染土壤治理工程中的实际效果得到保障。
(3)本发明专利中石油降解菌的筛选包括初筛、驯化、复筛及纯化等过程，菌株在石油浓度梯度逐渐升高的驯化培养基中，逐渐被驯化，适应以石油为单一碳源的生长繁殖，提高其对石油的耐受力及其降解效率。
(4)本发明专利所用固体发酵原料易得、工艺较简单，固体菌剂含有大量碳素及营养元素，为细菌生长提供更合适的基质，对微生物亲和力强，固定化效率高。提高所投加微生物与土著微生物的竞争力和降解效率。固体菌剂便于运输和农业操作，适用于石油污染土壤的大规模原位生物修复。
(5)本发明通过紫花苜蓿和石油高效降解混合菌剂联合作用来强化修复石油污染土壤。该方法投资较少，工程量小，技术要求较低，作为一种绿色原位修复不造成二次污染，同时不会破坏土壤生态环境，还有助于改善土壤退化和生产力下降等问题。
附图说明：
图1为驯化后各菌株的菌体生长量和石油降解率；
图2为土壤中不同时期总菌群数；
图3为土壤中不同时期总石油烃的去除率。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
高效石油降解菌菌株的筛选
1、石油降解土著菌菌源的采集
取山东省胜利油田炼油厂储油罐附近常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源。采样方法：用小铁锹取厚度为10cm的土壤样品，多点采样后混合均匀，取土样3kg带回实验室备用。
2、石油聚山梨酯-80增溶液制备
表面活性剂在水溶液中达到临界胶束浓度(critical micelleconcentration,CMC)后，一些水不溶性或微溶性物质在胶束溶液中的溶解度可显著增加，形成透明胶体溶液，这种作用称为增溶(solubilization)。聚山梨酯-80(聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸脂)为水溶性非离子表面活性剂，由于非离子表面活性剂不受电解质和pH值影响，不具有杀菌性能，且其HLB值(亲水亲油平衡值，hydrophile-lipophile balance,HLB)为15.0适合做增溶剂，适合做水包油(O/W)型乳化液。聚山梨酯-80可提高石油在水体中的溶解度，使其在石油聚山梨酯-80增溶液中分散更均匀，本发明以石油梨酯-80增溶液为唯一碳源制备各种微生物培养基。原油浓度和聚山梨酯-80浓度对增溶液乳化效果的影响如表1、表2所示。
表1 原油浓度对增溶剂乳化效果的影响
表2 聚山梨酯-80浓度对增溶剂乳化效果的影响
由表1和表2中可以看出，在石油聚山梨酯-80增溶液制备过程中，当原油浓度小于3％时，且聚山梨酯-80/原油比例大于2时，原油在水中乳化较好；当聚山梨酯-80/原油比例小于2时，原油在水中不乳化，只形成球状油滴。当原油浓度等于3％时，当聚山梨酯-80/原油比例小于1.67时，原油在水中不乳化，只形成球状油滴；当聚山梨酯-80/原油比例大于2.00时，原油在水中乳化较好，但停止搅拌油水分层严重。当原油浓度大于3％时，原油在水中不乳化，只形成球状油滴。
3、石油降解土著菌的筛选；
(1)土壤样品取回后，经碎散、除杂、混匀、风干后密封储存。取石油降解土著菌菌源土壤样品5g，加入盛有100mL无菌水的锥形瓶，并置于振荡培养箱中室温振荡2h，振荡频率为200rpm；
(2)从无菌水的锥形瓶中取5mL上清液，接入250mL富集培养基，温度30℃、转速175rpm摇床振荡培养48h。取0.2mL富集液涂布到平板筛选培养基，30℃恒温培养48h。
4、驯化
用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化。
驯化培养基分别为A、B、C、D、E，其中的石油浓度梯度逐渐升高，驯化培养基用250mL的三角瓶盛装，温度30℃、转速175rpm恒温振荡培养7d为一个周期。同时以不接入菌株的驯化培养基作为空白对照。驯化时，先用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL新鲜的驯化培养基A中，培养一个周期，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基B中，培养一个周期。再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基C中，培养一个周期。从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基D中，培养一个周期。从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基E中，培养一个周期。如此反复5个周期，经过驯化培养后，观察每个菌株在驯化培养基E中的石油降解情况。
5、菌种的纯化
(1)取一环最后一个周期的驯化培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d；
(2)从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24h；
(3)由LB斜面再次接种含油平板；
(4)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
(5)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。
所用培养基配制：
所述富集培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 0.5g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO30.24g，KH2PO40.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述筛选培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，琼脂20g，NaCl0.5g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO30.24g，KH2PO40.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基A为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基B为：
含石油0.050g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基C为：
含石油0.075g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基D为：
含石油0.100g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基E为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述含油平板用培养基为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl20.2g，微量元素溶液1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
LB斜面用培养基为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
微量元素溶液：MnSO439.9mg，ZnSO4·7H2O 42.8mg，FeCl2·4H2O15.73mg，CuSO440mg，蒸馏水1000mL。
菌种保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
5、石油降解菌的培养、筛选和形态鉴定结果
通过富集培养以及石油浓度梯度升高的方法进行驯化、筛选，经平板反复划线分离，纯化初筛得到7个单一菌株，如表3所示。
表3 菌落及菌体形态观察结果
通过在30℃，175rpm的恒温摇床上摇床震荡培养5d后，观察这7个单一菌株及混合菌株1和混合菌株2在驯化培养基E中的生长特征并测定这7个单一菌株和2个平行混合菌株的菌体生长量及其石油降解率，其中混合菌株1为7种单一菌株的均匀混合，混合菌株2为菌株X-2和X-6均匀混合。各菌株的生长特征如表4所示，
表4 各菌株的生长特征
从表4和图1综合分析可以看出，石油的乳化程度越完全，菌株的菌体生长量越大，菌株的石油降解率越高。菌体生长量同石油降解率成正相关关系。X-2和X-6菌株的石油乳化程度较完全，菌体生长量较大，石油降解率较高，因此是降解石油的优势菌株。试验结果也表明，不同菌株对石油的降解效果不同，混合菌株2比混合菌株1的降油效果更好，因此以混合菌株2为菌种制备石油降解菌剂。
实施例2
石油降解菌剂液体发酵生产
1、一级种子培养
无菌条件下取实施例1纯化的石油降解菌混合菌株2接种在试管斜面培养基中。培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉20g，pH值为7，121℃，灭菌20分钟。培养条件为：30℃，培养24小时，作为一级种子。
2、二级种子培养
无菌条件下取两环一级种子接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中。摇瓶培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值为7，121℃，灭菌20分钟。培养条件为30℃，转速80rpm,培养9小时，作为二级种子。
3、种子罐培养
按体积10％的接种量将二级种子接入50L发酵罐中。在50L发酵罐中加入40L培养基并接入二级种子液4L。培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值为7，121℃，灭菌30分钟。培养条件为搅拌转速80rpm，通气量1:1，温度30℃，培养8小时后，经细菌计数器检测菌体密度为1.2×107cfu，培养结束。
4、固体菌剂发酵增值
将经空气干燥后的废弃物生物质原料，粉碎或辗碎成2mm的颗粒状；将生物质颗粒及其他配料装在耐高温的塑料袋中，110℃灭菌1小时待用。将步骤(3)制备的培养液按照重量比10:1的固液比喷洒到堆料表面，均匀混合；将接种后的物料放到固体发酵床上在30℃条件下进行增殖培养3天，则制得微生物固定化材料。固体发酵培养基配方包括以下重量百分比的原料：麦麸30～35％、玉米秸秆粉末25～45％、花生壳粉末20～25％、葡萄糖0.5～1％、硫酸铵3～5％、K2HPO40.3～0.5％、MgSO4·7H2O 0.1～0.3％，水料重量比为1:1～4:1；控制含水率约50-55％，调节pH 7.2，将上述一级种子液按比例1:10(v/w)接入处理好的固定化载体中，保持水分50-55％，在30℃条件下吸附、固定、增值3天；按上述方法增值3次，即得固定化混合菌剂。
5、堆制产品干燥、粉化、计量、包装
固体发酵过程结束后，堆体干燥温度为45℃，至堆体含水量为6％，将堆料粉碎，过5mm筛，检测后备用，其有效活菌数为8亿/g，水份为4％，pH为7.0；利用包装设备进行计量、封包，即制成石油降解固体复合菌剂。
实施例3
石油降解固体复合菌剂与植物联合修复石油污染土壤
1、实验基地选取和处理
本试验选取东营市某采油厂提油机附近的土地，此土地地处提油机附近，受石油污染，石油总烃含量为4g/Kg，其土壤基本理化性质如表5所示。本发明采取紫花苜蓿-微生物联合修复石油污染土壤，种植密度大约为8000株/亩，将所制备的石油降解菌固体菌剂按照10-100公斤/亩土地投加于石油污染土壤中，翻耕0-30cm表土混匀。在紫花苜蓿种植时，用薄膜对土壤进行覆盖，保持水分，并施加控释肥，确保植物正常生长所需的养分。在生长的苗期，分别铺装滴灌袋，采用滴灌的方式，对其进行浇灌。
表5 土样基础性质
2、土壤样品采集
土壤样品为用土壤取样器所取地下20cm左右的土壤。本试验一共取样四次，分别为种植期、苗期、壮年期和收获期。土壤样品取回后，经风干、碎散、除杂、混匀后过60目筛子，然后密封储存。
3、土壤中细菌的分离、计数
(1)制备土壤液：称取土样10g，放入盛90mL无菌水的三角烧瓶中，摇床振摇30min，使土样与水充分混合，将菌分散。
(2)制备空白平板：将已灭菌的培养基加热熔化待冷至55～60℃，混合均匀后分别倒平板，每个培养基倒三个平板，并用记号笔标明培养基的名称、土样编号和实验日期。
(3)涂布：将每个培养基的平板底面分别用记号笔写上稀释浓度，然后用无菌移液管分别吸取相应浓度土壤稀释液各0.1mL，小心地滴加在对应平板表面中央位置。用无菌玻璃涂棒将菌悬液沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀，室温下静置10min，使菌液浸入培养基。
(4)培养：将琼脂平板翻转，使皿底朝上，倒置于培养箱37℃下培养。
(5)计数：选取清楚的菌落用记号笔在平板反面对菌落进行计数。
4、总石油烃的测定
波长的选择：配制浓度为100mg/L石油溶液,在紫外分光光度计上进行扫描,得到最大吸收峰处原油的波长为228nm。
标准曲线的绘制：取干净的50mI比色管6支，依次加入含油0.2，0.5，1.0，1.2，1.5，2.0mg的油标准溶液，用石油醚稀释至刻度线，摇匀后，以石油醚为参比液，在波长228nm处测其吸光度(A)，得出原油标准溶液的标准曲线。
土样分析：准确称取干燥试样10.00g置于50mL比色管中，加入20mL三氯甲烷，将比色管放入超声波器水浴中超声提取15min，静止过滤。将提取液收集于50mL干净烧杯中，用20mL三氯甲烷再提取一次。合并两次提取液，于(65±5)℃恒温水浴中蒸发至干，然后用石油醚溶解残渣，在50mL比色管中定容，于228nm处测其吸光度，然后由标准曲线方程计算出样品中油的含量。
5、土壤修复结果分析
经过紫花苜蓿约100天的生长期，分别在种植期、苗期、壮年期和收获期采样四次，其土壤中微生物总量变化如图2所示，其土壤中总石油烃的含量变化如图3所示。

Claims (7)

1.一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
A、石油降解菌的筛选、驯化
1)菌源的采集
取炼油厂常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源。
2)石油降解土著菌的初筛
(1)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样品，加入盛有无菌水的锥形瓶中，置于振荡培养箱中室温振荡0.5～2h，振荡频率为200rpm；
(2)从步骤(1)的锥形瓶中取上清液，接入富集培养基，在温度30℃、转速175rpm摇床上振荡培养48h。取培养后的富集液涂布到筛选培养基平板上，30℃恒温培养48h。
3)驯化
用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化，具体步骤为：先用接种环挑取初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL驯化培养基A中，培养一个周期(在温度30℃、转速175rpm恒温振荡下培养7d为一个周期)，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基B中，培养一个周期。再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基C中，培养一个周期。从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基D中，培养一个周期。从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基E中，培养一个周期，从驯化培养基A到驯化培养基E，石油浓度梯度逐级升高。
4)菌种的纯化
(1)取驯化后的培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d；
(2)从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24h；
(3)由LB斜面再次接种含油平板；
(4)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
(5)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。
B、制备种子培养液
将纯化得到的石油降解菌株分别单独接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；液体种子的菌体密度达到1*107cfu；其中：一级种子采用固态培养基斜面培养，培养条件为30℃，培养24小时；二级种子为液态培养基摇床培养，培养条件为30℃，转速175rpm，培养10-12小时；种子罐培养条件为液体培养基搅拌培养，培养条件为30℃恒温，转速80rpm，通气量1:1。
C、固体菌剂的发酵
将经空气干燥后的废弃物生物质原料，粉碎或辗碎成1-5mm的颗粒状；将生物质颗粒及其他配料装在耐高温的塑料袋中，110℃灭菌1小时待用；
将种子罐中的种子培养液按照重量比10:1的固液比喷洒到堆料表面，将发酵种子培养液与固体发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到固体发酵床上在28-30℃条件下进行增殖培养3-5天，则制得微生物固定化材料；
将步骤B中的一级种子液按比例1:10(v/w)接入处理好的固定化载体中，保持水分50-55％，在28-30℃条件下吸附、固定、增值3-5天；按上述方法增值3次，即得固定化菌剂。
D、堆制产品干燥、粉化、计量、包装
将固定化菌剂在温度为40～60℃条件下干燥，至含水量为6～10％，将菌剂粉碎，过5mm筛。
2.根据权利要求1所述的一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，其特征在于：步骤A和B中所使用的培养基中均含有石油和聚山梨酯-80的增溶液。
3.根据权利要求2所述的一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，其特征在于：所述石油和聚山梨酯-80的增溶液中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，其特征在于：
所述富集培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述筛选培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，琼脂20g，NaCl0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基A为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基B为：
含石油0.050g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基C为：
含石油0.075g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基D为：
含石油0.100g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基E为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述含油平板用培养基为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO31g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
LB斜面用培养基为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
微量元素溶液：MnSO4 39.9mg，ZnSO4·7H2O 42.8mg，FeCl2·4H2O15.73mg，CuSO4 40mg，蒸馏水1000mL。
菌种保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
5.权利要求1-4任一项制备的石油降解菌固体菌剂用于修复石油污染的土壤。
6.根据权利要求5所述的石油降解菌固体菌剂用于修复石油污染的土壤，其特征在于：具体的方法为：将所制备的石油降解菌固体菌剂按照10-100公斤/亩土地投加于石油污染土壤中，同时辅助施加化肥和有机肥，翻耕0-30cm表土混匀，同时种植玉米、黄豆和苜蓿三种作物中的一种。
7.根据权利要求6所述的石油降解菌固体菌剂用于修复石油污染的土壤，其特征在于：所述苜蓿为紫花苜蓿。
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