CN102174403B

CN102174403B - 垃圾堆肥复合菌剂在提高草坪草抗旱性方面的应用

Info

Publication number: CN102174403B
Application number: CN2011100370289A
Authority: CN
Inventors: 多立安; 赵树兰; 王晶晶
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2011-02-14
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-02-14
Also published as: CN102174403A

Abstract

本发明公开了城市生活垃圾堆肥复合菌剂在提高草坪植物抗旱性方面的应用；所述的堆肥复合菌剂它是由体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1的3菌种稀释100-200倍的液体组成。结果表明，接种稀释后的城市生活垃圾堆肥复合微生物菌剂，植物能够通过自身的保护酶活性和渗透调节物质含量来减轻干旱伤害，维持植物体的正常生理代谢功能，从而有效缓解干旱胁迫对草坪植物的伤害，提高草坪植物的抗旱性，为干旱环境草坪植物的建植提供依据。

Description

垃圾堆肥复合菌剂在提高草坪草抗旱性方面的应用

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种为原料，配制高效堆肥复合菌剂。更具体的说是复合菌剂在制备提高草坪植物抗旱性方面的应用。

背景技术

堆肥化(composting)是利用自然界广泛存在的微生物(细菌、放线菌、真菌等)或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质〔humicsubstance，HS)转化的生物化学过程。这一过程也是地球表面生态过程的一部分，它参与地球表面的物质和能量循环。

在人为控制条件下，通过堆肥化可以将固体废物中的有机物转化成为有机肥料一堆肥(compost)，这种有机肥料作为堆肥化的最终产物，不仅性能稳定，并且对环境的危害甚小。因此，堆肥化是固体废物，尤其是城市生活垃圾无害化、稳定化和资源化的有效途径之一。堆肥化发展至今，已经历了漫长的历史，对其产生和发展的历史过程进行回顾和分析，可为今后开发新的堆肥工艺技术提供理论和实践上的借鉴和帮助。

陈世和等（1989）采用垃圾培养基，在城市生活垃圾堆肥处理过程中，温度达45℃和55℃时，对堆肥菌株进行分离，发现在45℃时：曲霉菌[ Aspergillus]、芽孢杆菌属[Bacillus]、假单孢菌属[Pseudomonas]和芽孢乳杆菌属[Sporolactobacillus]等是堆肥中的优势菌群。而到55℃时则有所不同，除了芽孢杆菌属[Bacillus]和假单孢菌属[Pseudomonas]仍然为优势菌群外，乳酸杆菌属[Lactobacillus]、链球菌属[Streptococcus]和小单孢菌[Micromonospora]属则成为新的优势菌群，替代了其它种微生物，表明在堆肥化过程中，微生物种群处在一个不断变化的动态平衡之中。

从城市生活垃圾中分离出大量参与高温好氧堆肥的微生物，经鉴定分别为芽孢杆菌属、假单孢菌属，乳酸杆菌属、葡萄球菌属、埃希氏菌属等5属细菌；曲霉属，毛霉属、红曲霉属，青霉属、地霉属、霉属、脉孢苗属、头孢霉属等8属霉菌；链霉菌属1属放线菌；酵母菌属，裂殖酵母菌等2属酵母菌。该研究结果有力地促进了对垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen（2001）对城市垃圾堆肥过程诶生物变化的调查发现，分解有机物产生的高温引起微生物群落的重要变化，使致病菌、酵母菌及中温菌大量减少，而产芽孢的杆菌大量存在，在堆肥过程中，高温阶段初期和中文阶段细菌均占主要地位。马文漪等也报道了嗜热真菌，嗜热褐色放线菌等参与垃圾堆肥的微生物种群。

从城市生活垃圾中有机物的组成来看，而被微生物所分解利用。但各种微生物对各种物质的分解能力和分解速度是不尽相同的，不同温度下（中温、高温）堆肥过程中出现的微生物种群和数量上亦截然不同。

近期的相关文献及实际生产表明：目前如何提高城市生活垃圾堆肥处理的技术水平、提高处理效率、改善产品质量，一直是相关科研人员所重点关注的研究内容；在堆肥物料中针对特定物质有目的的添加一些人工微生物制剂，已经被很多研究所证实是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考虑到在很多研究和生产实践中，合理配比的复合菌剂往往较单一菌株更具好的效果，于是如何将堆肥中提取和筛选出来的各种功能菌株结合起来开发高效堆肥复合菌剂，从根本上优化和合理配制使用城市垃圾堆肥基质便成了相关科研人员研究的热点问题。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界广泛存在的微生物（细菌、放线菌、真菌等）或商业菌株，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定腐殖质转化的生物化学过程，是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。

研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆肥化进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用。Ros和Pérez-Piqueres 等人研究了接种外源微生物复合菌剂对堆肥化过程中微生物的影响，有利于了解堆肥过程的生物化学过程及加入微生物制剂对堆肥的影响。近年来国内外学者对堆肥过程中的微生物现象进行了一系列理论和实践研究，Vaz-Moreira等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。但在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及将堆肥微生物菌剂应用于正常条件下对植物生长的影响方面，相关研究也鲜为报道。而有关堆肥内部微生物种类的鉴定和分类，堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性，以及从城市生活垃圾堆肥中提取筛选和配制堆肥复合有益微生物菌剂，对草坪植物生长、生理特性的影响方面的研究还未见报道。

干旱胁迫是制约干旱半干旱地区植物生长和发育的重要环境因子。通过接种外源基因和人工合成菌剂来提高植物在干旱环境中的适应能力，是近年来国内外研究的一个热点领域。微生物能够与80%以上的植物建立共生关系，而共生关系的建立往往可以提高植物的抗逆性，促进植物生长；对此，已有学者展开相关研究工作。贺学礼等人研究了水分胁迫条件下AM真菌对柠条锦鸡儿生长和抗旱性的影响。宋瑞勇等人利用人工合成微生物菌剂来提高作物抗逆性，证明了干旱胁迫条件下，微生物诱导剂可促进玉米根系的生长发育，提高根系的干物质积累，从而提高玉米的抗干旱能力。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤中提取。从城市生活垃圾堆肥中提取和制备微生物菌剂，并应用于植物抗旱性的研究还未见报道。

城市生活垃圾堆肥是由群落结构演替非常迅速的多种微生物群体共同作用而实现有机废弃物资源化、无害化的动态过程。堆肥中微生物数量及种群分布与堆肥有机物质成分和含量、微生物间的相互作用等多种因素密切相关。顾文杰等人研究接种外源菌剂对堆肥中微生物数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供依据。Ivone等人对堆肥中细菌的群落多样性进行分析，以期深入认识堆肥过程的本质，为堆肥技术和工艺研究提供理论基础。但无论如何，在复合微生物菌剂研究过程中，有关堆肥微生物菌剂对植物生长和生理特性的影响等相关研究还未见报道。

发明内容

本发明以堆肥微生物菌种作为接种剂，筛选出合适的有益微生物菌株，配制成不同浓度的复合微生物菌剂接种到草坪建植体系中。试验在中度干旱胁迫处理下进行，通过研究不同浓度的复合微生物菌剂对黑麦草和高羊茅生理生态特性的影响，目的是为筛选优良抗旱堆肥复合微生物菌剂，提高草坪植物抗旱性，促进干旱环境草坪植物的建植提供依据。

为实现上述目的本发明提供了如下的技术方案：

高效堆肥复合菌剂在提高草坪植物抗旱性方面的应用；所述的堆肥复合菌剂由体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1的3菌种稀释100-200倍的液体组成。

本发明所述的应用，其中3菌种的菌落数在2.44×10⁹-2.47×10⁹/ml之间；草芽孢杆菌的OD₆₀₀值为0.567，酵母菌的OD值为0.545。其中草坪植物抗旱性指的是: 丙二醛含量，超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性。其中的草坪植物为黑麦草和高羊茅。

本发明进一步公开了高效堆肥复合菌剂，其中3菌种的筛选方法如下:

(1) 富集：将采集的堆肥样品称取10 g置于无菌三角瓶中，加入100 ml无菌水和玻璃珠振荡均匀后，取10ml悬浮液于盛有100 ml富集培养基的三角瓶中，分别在适合的温度下摇床振荡培养3天；

(2)初筛：将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛；

(3)复筛：将初筛得到的菌株接种到相应摇瓶培养基中，在适合的温度和摇床速度的条件下培养，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线；

(4)合微生物菌剂的制备: 将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上，具体步骤为：

①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；

②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃、180r／min培养12h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 ℃、220 r／min培养48 h得到种子液；

③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48h得到发酵液。按体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1 配制复合微生物菌液。

本发明所述的草坪植物为黑麦草和高羊茅。其中按体积比枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1 配制。其中采用的复合菌剂为稀释200倍的液体。

本发明更加详细的制备方法如下:

特别加以说明的是: 枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCCM207094)、放线菌(保藏号CPCC260118)、酵母菌(保藏号CGMCCNO.1147)均由市售,但根据需要也可以采用下述的方法制备得到3个菌株。其得到的3个菌株的生化特性与市售的相同。

研制材料与方法

菌株的筛选

①富集：将采集的城市生活垃圾堆肥样品称取10g置于无菌三角瓶中，加入100mL无菌水和玻璃珠振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的三角瓶中，在28℃，220 r／min下振荡培养3—5d。②初筛：将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛。③生长曲线的绘制：将初筛得到的枯草芽孢杆菌和酵母菌接种到相应摇瓶培养基中，分别在37℃和28℃，220 r／min的条件下培养，并分别以波长600 nm和560 nm下的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线。

城市生活垃圾堆肥复合微生物菌剂制备

菌种培养：将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上扩大培养，具体步骤：①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃，180r／min培养12 h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 ℃，220 r／min培养48h得到种子液；③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48h得到发酵液，复合微生物菌液按以下处理进行配制。

复合微生物菌剂应用

采用单因素随机区组实验设计，受限因素分别为：①干旱胁迫，测得土壤田间最大持水量为43.54%。本试验采用中度干旱胁迫，胁迫程度为55%—65%田间最大持水量（MFC）；②不同浓度的复合微生物菌剂应用，在此干旱胁迫条件下设定处理方式：处理1为对照，不接种菌剂（CK）；处理2加入原菌液（CM₁）；处理3加入100倍稀释液的菌剂（CM₂）；处理4加入200倍稀释液的菌剂（CM₃）；处理5加入300倍稀释液菌剂（CM₄）；处理6加入400倍稀释液菌剂（CM₅）

1.4 草坪建植

选用我国北方比较常见的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和高羊茅(Festuca arundinacea L.)为试验材料。供试草坪植物种子籽粒饱满、大小均匀。所用土壤为天津师范大学院内园土，其理化性质为：pH 7.44,饱和含水量0.58mL/g,有机质4.68%,全氮0.21%,有效磷22.03 mg/kg,全钾45.61g/kg。采集后，剔除植物残根和石砾等杂物，过2mm筛，在121℃下灭菌30 min，备用。实验采用盆栽的方法，每培养容器内放置灭菌土壤200g，将0.4g草坪种子播种其上。每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致。当植株生长高度达到6—7cm时，加入不同浓度的堆肥复合微生物菌剂，接种CM 3d后，再进行干旱胁迫。各处理3次重复，实验在温室植物培养台上进行，温度为20—25℃，相对湿度为30%—60%，光照为透入室内的自然光。处理40d后进行植物各指标的测定。

测定指标　

采集新鲜的植物叶片，进行以下各指标的测定。脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮比色法；丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法；POD活性测定采用愈创木酚法；SOD活性测定采用NBT法；CAT活性测定采用紫外分光光度法；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定。

[0021] 离体叶片持水力的测定如下：将准确称过鲜重的植物叶片，放入25℃—30℃的干燥器中，在黑暗条件下干燥2—6 h，再称量失水后叶片的重量，按下式计算失水率：

失水率（%）＝（鲜重－失水后重）/ 鲜重×100%

失水率高，说明叶片干燥后失水较多，即叶片含水量高，则离体叶片持水力高。

数据分析

采用Microsoft Excel 2003和 SPSS 11.5软件进行处理。

研制结果分析

2.1 菌种筛选

初筛：通过平板分离筛选，得到透明圈/菌落直径比值较大且生长较快的菌落。将所得的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌分别进行划线分离、编号并保藏于固体斜面培养基上。

复筛：通过测定枯草芽孢杆菌和酵母菌的生长曲线（图1和图2），分析菌种生长活性最高和繁殖能力最好时期为对数期，将此期的菌种提取出来，稀释成不同浓度，用于草坪植物接种。由表1可以看出，所得微生物菌剂中富含枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母菌，三菌种的菌落数在2.44×10⁹—2.47×10⁹之间，枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀值为0.545，酵母菌的OD₅₆₀值为0.567。

表1微生物菌剂所富含的菌落数

2.2 CM对干旱胁迫下草坪植物叶片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

干旱胁迫下复合微生物菌剂处理两种草坪植物叶片脯氨酸含量均显著低于未接种的对照植株（图3）。在200倍稀释液复合菌剂处理下，高羊茅脯氨酸含量降低最多，比对照降低了30.1%。在100倍稀释液菌剂处理下，黑麦草脯氨酸含量比对照降低了27.3%。而其它稀释浓度下的处理组，草坪植物叶片脯氨酸含量和对照相比都有显著差异（P<0.05）。

由图4可见，不同浓度复合微生物菌剂明显降低了两种草坪植物叶片细胞内可溶性蛋白含量。在干旱胁迫下，高羊茅细胞内可溶性蛋白含量在200倍稀释液处理下为最低，与对照相比，降低了78.6%；而黑麦草在100倍稀释液处理下最少，比对照低66.2%，说明接种菌剂后，植物细胞体内的渗透作用能力增强，草坪植物抗旱能力提高。

CM对干旱胁迫下草坪植物叶片MDA含量的影响

不同浓度堆肥复合微生物菌剂对干旱胁迫下两种草坪植物叶片MDA含量的影响见图5。和对照相比，干旱胁迫下，接种堆肥复合微生物菌剂显著降低了两种草坪植物叶片的MDA含量。在高浓度下，高羊茅MDA含量随堆肥微生物菌剂浓度的降低而下降，在200倍稀释液处理下含量为最低，和对照相比，下降了24.3%；然后随微生物菌剂浓度的降低， MDA含量又表现出增加的趋势。对于黑麦草而言，也表现出相同的趋势，所不同的是，在100倍稀释液下黑麦草MDA含量下降最多，比对照减少了42.4CM对干旱胁迫下草坪植物叶片保护酶活性的影响，接种堆肥复合微生物菌剂显著提高了干旱胁迫下两草坪植物叶片SOD、POD和CAT活性（表2）。在高浓度下，随着微生物菌剂浓度的降低，3种保护酶活性显著地增加，在200倍稀释液时，高羊茅叶片SOD、POD和CAT活性达到最高，分别是对照的8.13、1.53和2.46倍；复合菌剂稀释液倍数为100时，黑麦草叶片POD和CAT活性为最高，分别比对照高出64.4%和56.1%，SOD活性为对照的6.50倍；然后，随着稀释倍数的增加，保护酶活性又开始下降。

CM对干旱胁迫下草坪植物离体叶片持水力的影响

接种不同浓度堆肥微生物菌剂对干旱胁迫下两种草坪植物离体叶片持水力的影响见图6。接种微生物菌剂处理离体叶片持水力均高于未接种的对照，高羊茅和黑麦草分别在200和100稀释倍数时达到峰值，然后又开始下降，这和其它指标的测定结果相吻合。黑麦草在接种100稀释液后，离体叶片的持水力比对照提高了7.00%。说明接种堆肥微生物菌剂使植物保持较高的离体叶片持水力，有利于植物提高自身的抗旱能力。

研制结论

在干旱胁迫下，接种垃圾堆肥复合微生物菌剂，能明显提高草坪植物叶片保护酶活性，抑制MDA的合成，并保持较高的离体叶片持水力，从而缓解了干旱胁迫带来的伤害，提高了植株的抗旱性。所以，针对不同草坪植物和生长环境，筛选和培养优势堆肥微生物菌种进行人工接种，是提高草坪植物抗旱性的关键，这对于堆肥高效菌剂的研制和应用至关重要。

附图说明：

图1为枯草芽孢杆菌的生长曲线；

图2为酵母菌的生长曲线；

图3为 CM对干旱胁迫草坪植物叶片脯氨酸含量的影响；同草种数据中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；下同；

图4为CM对干旱胁迫下草坪植物叶片可溶性蛋白的影响；

图5为CM对干旱胁迫草坪植物叶片MDA含量的影响；

图6为CM对干旱胁迫下草坪植物离体叶片持水力的影响。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌均由市售。也可参考实施例1的方法制备。

实施例1

(1)菌株的筛选方法

富集：将采集的堆肥样品称取10g置于无菌三角瓶中，加入100ml无菌水和玻璃珠振荡均匀后，取10ml悬浮液于盛有100ml富集培养基的三角瓶中，分别在适合的温度下摇床振荡培养3天。

(2)初筛：将富集后的培养液进行浓度梯度稀释后，涂布于分离筛选培养基上，倒置恒温培养，观察透明圈的大小，选取透明圈/菌落直径比值较大菌落的菌株进行复筛。

(3)复筛：将初筛得到的菌株接种到相应摇瓶培养基中，在适合的温度和摇床速度的条件下培养，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线。

合微生物菌剂的制备:

菌种培养：将筛选的枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌在相应的培养基上，具体步骤为：

②接种斜面培养物于种子瓶，枯草芽孢杆菌在30℃、180r／min培养12h得到种子液，放线菌和酵母菌在28 ℃、220 r／min培养48 h得到种子液；并分别以波长600 nm和560 nm下的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线。

③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液。按体积比为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1 配制复合微生物菌液,加入量为10 mL。

实施例2

选用我国北方比较常见的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和高羊茅(Festuca arundinacea L.)为试验材料。供试草坪植物种子籽粒饱满、大小均匀。所用土壤为天津师范大学院内园土，其理化性质为：pH 7.44,饱和含水量0.58mL/g,有机质4.68%,全氮0.21%,有效磷22.03 mg/kg,全钾45.61g/kg。采集后，剔除植物残根和石砾等杂物，过2mm筛，在121℃下灭菌30 min，备用。实验采用盆栽的方法，每培养容器内放置灭菌土壤200g，将0.4g草坪种子播种其上。每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致。当植株生长高度达到7 cm时，加入不同浓度的堆肥复合微生物菌剂,枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1(10 mL) (稀释100-200倍)，接种CM 3d后，再进行干旱胁迫。各处理3次重复，实验在温室植物培养台上进行，温度为25℃，相对湿度为30%%，光照为透入室内的自然光。处理40d后进行植物各指标的测定。

Claims

1.城市生活垃圾堆肥复合菌剂在提高黑麦草和高羊茅抗旱性方面的应用；所述的堆肥复合菌剂由体积比例为枯草芽孢杆菌CCTC CM 207094：放线菌CPCC 260118：酵母菌CGMCC NO. 1147=1：1：1的3菌种稀释100-200倍的液体组成；其中复合菌剂的具体制备过程如下:

③浓度10％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养48 h得到发酵液；按体积比例为枯草芽孢杆菌：放线菌：酵母菌=1：1：1 混合,稀释100-200倍配制复合菌剂。

2.权利要求1所述的应用，其中3菌种的菌落数在2.44×10⁹-2.47×10⁹/ml之间；枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀值为0.567，酵母菌的OD₅₆₀值为0.545。