CN105949284A - 一种纯化西那普肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用反相高效液相色谱法纯化西那普肽的方法，主要解决合成西那普肽副产物较多，纯化困难的技术问题。本发明包括如下步骤：1）将固相合成所得的粗肽用乙醇水溶液加热溶解；2）使用两个色谱柱串联的方法，其一固定相为八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，其二固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱；3）流动相为两相，其中硫酸铵‑磷酸缓冲液为A相，色谱纯乙腈为B相，进行波折线性梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；3）将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，留浓缩液备用；4）利用阴离子交换树脂交换转成醋酸盐；5）将最终的高纯度醋酸肽溶液再次减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得白色粉末状成品。本发明可用于获得高纯度的西那普肽。
Description
技术领域
本发明属于反相HPLC技术领域，尤其是涉及一种可以分离得到高纯度的西那普肽的方法。
背景技术
西那普肽是一种人工合成的21肽，英文名Sinapultide ，分子量为2469.40，氨基酸序列为：
Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys
于2012年3月被美国FDA批准上市，临床用于治疗新生儿呼吸窘迫综合症。
新生儿呼吸窘迫综合症又称新生儿肺透明膜病，指新生儿出生后不久即出现进行性呼吸困难和呼吸衰竭等症状，主要是由于缺乏肺泡表面活性物质所引起的，导致肺泡进行性萎缩，患儿于出生后4-12小时内出现进行性呼吸困难，呻吟，发绀，吸气三凹症，严重者发生呼吸衰竭。发病率与胎龄有关，胎龄越小，发病率越高，体重越轻病死率越高。据悉，我国每年约有1600万新生儿，新生儿呼吸窘迫综合症的发病率大约是0.5%，而在美国，每年约有2万-3万新生儿患有此病，占妊娠数的1%。
现有关于西那普肽的合成方法国内外均有报道，美国在针对西那普肽的生产方面主要使用的是基因重组的技术方法，中国目前有几项关于化学合成西那普肽的技术方法，由于西那普肽序列疏水的原因，不管用任何的合成方法，副产物都比较多，粗产品的杂质也很多，这样对后续分离纯化得到高纯度的成品造成很大的困难。另外目前针对西那普肽的分离纯化方法报道的寥寥无几，有些公开的专利上仅仅提笔带过了对西那普肽的分离纯化。由于西那普肽的氨基酸序列是一个疏水性的多肽，对于疏水性的多肽仅仅常规的溶解方法与分离方法很难能得到高纯度的产品，并且放大到工业化的生产也是相当的困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适于分离得到高纯度西那普肽的方法，主要解决合成西那普肽副产物较多，纯化困难的技术问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种纯化西那普肽的方法，包括如下步骤：
1）将固相合成所得粗肽用质量百分浓度70%的乙醇水溶液加热50-60℃溶解；
2）使用两个色谱柱串联的方法，其一固定相为八烷基键合硅胶的反相硅胶柱；
3）其二固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱；
4）流动相为两相，硫酸铵-磷酸缓冲液为A相，色谱纯乙腈为B相，进行波折线性梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
5）将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，留浓缩液备用；
6) 将减压旋蒸浓缩后的肽溶液采用阴离子交换树脂交换转成醋酸盐；
7）将最终的高纯度醋酸肽溶液再次减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品。
优选的方案是：所述八烷基键合硅胶，粒径为15um，孔径为300A，加柱温箱50-60℃。
优选的方案是：所述十八烷基键合硅胶，粒径为10um，孔径为170A。
优选的方案是：所述A相硫酸铵-磷酸缓冲液的pH为5.0-6.5；更为优选的方案是：所述A相硫酸铵-磷酸缓冲液的pH为5.3-6.2。
优选的方案是：所述色谱纯乙腈即流动相B的质量百分浓度为15-60%～25-55%，检测波长为210nm；更为优选的方案是：所述色谱纯乙腈即流动相B的质量百分浓度为18-58%～30-45%。
本发明的有益效果是：针对西那普肽疏水性的缺陷以及目前市场上对高纯度产品的需求，提出一种针对性分离纯化西那普肽的技术方法，西那普肽的性质就是难溶，常规的溶解方法不能充分溶解，即使强极性溶剂可以溶解，但是在色谱柱的分离中不易挂在柱子中，大大降低了收率。选择使用质量百分浓度70%的乙醇水溶液加热溶解多肽，根据多肽的性质，该条多肽在60度的温度下，可以充分溶解，并且多肽不发生任何的化学变化。再使用串联色谱柱波折线性梯度分离纯化，第一根柱子增加柱温箱温度60℃就是为了保证加热溶解好的多肽溶液可以在柱子中达到一定的分离效果，同时不因为温度降低样品析出。一次分离的样品溶液直接二次进柱达到更优更高的分离效果，可以得到HPLC纯度大于99.5%的精肽，解决现在技术对纯化分离得到高纯度的西那普肽技术上面的缺陷，并为西那普肽投放工业化的规模化的生产增添新技术。以便得到高纯度的西那普肽。
附图说明
图1为本发明实施例2产品色谱图。
图2为本发明实施例4产品色谱图。
具体实施方式
实施例1
1．样品处理：将合成所得的西那普肽用质量百分浓度70%的乙醇水溶液加热60℃溶解（溶解浓度约为100mg/ml），充分溶解之后的液体选择布氏漏斗进行过滤，留过滤液待用；
2．纯化
纯化条件：色谱柱：其一八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，粒径为15um，孔径为300A，柱子直径和长度为：5cm×30cm，加柱温箱60℃；其二十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，色谱柱粒径为10um，孔径为170A，柱子直径和长度为：10cm×50cm，两柱串联使用。流动相：A相：硫酸铵水溶液用磷酸溶液调pH至5.2；B相：色谱纯乙腈。流速：50-80ml/min。检测波长：210nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：15-60%-20-60%，梯度处理时间30-50-80min。进样量为8.05g；
纯化过程：将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
3．将纯化后收集的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩温度不超过40℃，主要是降低肽溶液中有机溶剂（主要是乙腈）的浓度，留浓缩液备用；
4．转盐：取100g阴离子交换树脂Lewatit MP60置于大小合适的转盐玻璃柱中，用超纯水，乙醇，碱洗，酸洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用，将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中，通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的，同时收集转盐后的肽溶液；
5．将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至10g/200ml，浓缩温度不超过40℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.5%的西那普肽，纯化收率可得72.4%以上。
实施例2
1．样品处理：将合成所得的西那普肽用质量百分浓度70%的乙醇水溶液加热55℃溶解（溶解浓度约为100mg/ml），充分溶解之后的液体选择布氏漏斗进行过滤，留过滤液待用；
2．纯化
纯化条件：色谱柱：色谱柱：其一八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，粒径为15um，孔径为300A，柱子直径和长度为：5cm×30cm，加柱温箱55℃；其二十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，色谱柱粒径10um，孔径170A，柱子直径和长度为：10cm×50cm，两柱串联使用。流动相：A相：硫酸铵水溶液用磷酸溶液调pH至6.3，B相：色谱纯乙腈。流速：50-80ml/min。检测波长：210nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：15-60%-25-55%，梯度处理时间30-50-80min。进样量为10.10g；
纯化过程：将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
3．将纯化后收集的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩温度不超过40℃，主要是降低肽溶液中有机溶剂（主要是乙腈）的浓度，留浓缩液备用；
4．转盐：取100g阴离子交换树脂Lewatit MP60置于大小合适的转盐玻璃柱中，用超纯水，乙醇，碱洗，酸洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用，将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中，通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的，同时收集转盐后的肽溶液；
5．将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至10g/200ml，浓缩温度不超过40℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.5%的西那普肽，纯化收率可得75.6%以上。（产品色谱见图1）。
实施例3
1．样品处理：将合成所得的西那普肽用质量百分浓度70%的乙醇水溶液加热50℃溶解（溶解浓度约为100mg/ml），充分溶解之后的液体选择布氏漏斗进行过滤，留过滤液待用；
2．纯化
纯化条件：色谱柱：其一八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，粒径为15um，孔径为300A，柱子直径和长度为：10cm×50cm，加柱温箱50℃；其二十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，色谱柱粒径10um，孔径170A，柱子直径和长度为：10cm×100cm，两柱串联使用。流动相：A相：硫酸铵水溶液用磷酸溶液调节pH值为5.5；B相：色谱纯乙腈。流速：80-100ml/min。检测波长：210nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：18-58%-30-55%，梯度处理时间40-70-100min。进样量为15.53g；
纯化过程：将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
3．将纯化后收集的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩温度不超过40℃，主要是降低肽溶液中有机溶剂（主要是乙腈）的浓度，留浓缩液备用；
4．转盐：取200g阴离子交换树脂Lewatit MP60置于大小合适的转盐玻璃柱中，用超纯水，乙醇，碱洗，酸洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用，将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中，通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的，同时收集转盐后的肽溶液；
5．将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至15g/300ml，浓缩温度不超过40℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.5%的西那普肽，纯化收率可得81.6%以上。
实施例4
1．样品处理：将合成所得的西那普肽用质量百分浓度70%的乙醇水溶液加热60℃溶解（溶解浓度约为100mg/ml），充分溶解之后的液体选择布氏漏斗进行过滤，留过滤液待用；
2．纯化
纯化条件：色谱柱：其一八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，粒径为15um，孔径为300A，柱子直径和长度为：10cm×50cm，加柱温箱60℃；其二十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱，色谱柱粒径10um，孔径170A，柱子直径和长度为：10cm×100cm，两柱串联使用。流动相：A相：硫酸铵水溶液用磷酸溶液条件pH为6.0；B相：色谱纯乙腈。流速：80-100ml/min。检测波长：210nm。梯度：流动相B的质量百分浓度：18-58%-30-45%，梯度处理时间40-70-100min。进样量为16.18g；
纯化过程：将色谱柱用质量百分浓度90%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用；
3．将纯化后收集的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩温度不超过40℃，主要是降低肽溶液中有机溶剂（主要是乙腈）的浓度，留浓缩液备用；
4．转盐：取200g阴离子交换树脂Lewatit MP60置于大小合适的转盐玻璃柱中，用超纯水，乙醇，碱洗，酸洗等一系列步骤冲洗至中性后再上样使用，将浓缩后的肽溶液倒入转盐玻璃柱中，通过控制液体样品的流速来达到转盐的目的，同时收集转盐后的肽溶液；
5．将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至15g/300ml，浓缩温度不超过40℃，然后冷冻干燥得纯度大于99.5%的西那普肽，纯化收率可得84.6%以上。（产品色谱见图2）。
Claims (8)
1.一种纯化西那普肽的方法，其特征是包括如下步骤：
1）将固相合成所得粗肽用乙醇水溶液加热50-60℃溶解；
2）使用两个色谱柱串联的方法，其一固定相为八烷基键合硅胶的反相硅胶柱；
3）其二固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱；
4）流动相为两相，硫酸铵-磷酸缓冲液为A相，色谱纯乙腈为B相，进行波折线性梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
5）将所得到的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，留浓缩液备用；
6) 将减压旋蒸浓缩后的肽溶液采用阴离子交换树脂交换转成醋酸盐；
7）将最终的高纯度醋酸肽溶液再次减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品。
2.根据权利要求1所述的一种纯化西那普肽的方法，其特征是：乙醇水溶液质量百分浓度为70%。
3.根据权利要求1所述的一种纯化西那普肽的方法，其特征是：所述八烷基键合硅胶，粒径为15um，孔径为300A，加柱温箱50-60℃。
4.根据权利要求1所述的一种纯化西那普肽的方法，其特征是：所述十八烷基键合硅胶，粒径为10um，孔径为170A。
5.根据权利要求1所述的一种纯化西那普肽的方法，其特征是：所述A相硫酸铵-磷酸缓冲液的pH为5.0-6.5。
6.根据权利要求4所述的一种纯化西那普肽的方法，其特征是：所述A相硫酸铵-磷酸缓冲液的pH为5.3-6.2。
7.根据权利要求1所述一种纯化西那普肽的方法，其特征是：所述B相色谱纯乙腈的质量百分浓度为15-60%～25-55%，检测波长为210nm。
8.根据权利要求7所述的一种纯化西那普肽的方法，其特征是：所述B相色谱纯乙腈的质量百分浓度为18-58%～30-45%。
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