CN110785427B - 一种长链多肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长链多肽的纯化方法,其包括步骤1),即纯化步骤:采用两根色谱柱串联进行粗品的分离,其中,上游色谱柱中填料的粒径比下游色谱柱填料粒径大;可选地,还包括作为转盐的步骤2):采用步骤1)中的上游色谱柱进行转盐,将步骤1)得到的目标峰产物进行上样;以95%‑85%的A2和5%‑15%的B冲洗15‑30min进行脱盐,其中,A2相为体积比0.05%‑0.2%的醋酸水溶液,B相为有机相乙腈,检测波长为230nm。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及一种长链多肽药物的纯化方法。
背景技术
Ularitide(乌拉立肽)是一种是由Cardiorentis(AG)开发的促尿钠***环肽,它由32个氨基酸残基,最初是在1988年由Schulz-Knappe等从尿液中分离得到的一种属于心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide,ANP)家族的肾利钠肽,主要用于治疗急性心力衰竭。
分子式如下:
流行病学资料显示,目前全球心衰患者的数量已高达2250万,并且仍以每年200万的速度递增。且5年存活率与恶性肿瘤相仿,20%的心衰患者出院将在30天内再住院,花费了大量医疗费用。我国成年人心衰的患病率为0.9%,其中男性为0.7%,女性为1.0%,目前35~74岁成年人中仍约有400万的心衰患者,并呈逐年上升趋势。常见病因包括冠心病、高血压、心肌病和(或)瓣膜病、糖尿病等,其中冠脉疾病是心力衰竭的重要原因。据统计,全球每年花费在心衰上的资金为1080亿美元,2003年一项大型流行病学调查显示,中国内地成年人心衰患病率已达0.9%,约有心衰患者450万人。心衰分急性心衰和慢性心衰,美国过去10年中,因急性心衰而急诊就医者达1千万例次。急性心衰患者中约15~20%为首诊心衰,大部分则为原有的心衰加重,所有引起慢性心衰的疾病都可导致急性心衰。随慢性心衰患者数量逐渐增加,慢性心功能失代偿和急性心衰发作,也已成为心衰患者住院的主因,每年心衰的总发病率为0.23%~0.27%。急性心衰预后很差,住院病死率为3%,60d病死率为9.6%,3年和5年病死率分别高达30%和60%。急性心肌梗死所致的急性心衰病死率更高。急性肺水肿患者的院内病死率为12%,1年病死率达30%,所以乌拉立肽市场前景广阔。
现有多肽纯化,主要是采用高效液相制备***制备,有机相为乙腈、甲醇等,使用量较大,废液排放量也较大。废液回收难处理,危险性也较大,随着肽序的延长,废液排放量将会更庞大,纯化周期也相应变长,企业成本也较大。环保、安全和成本问题已经制约着制药企业的发展,急需要一种降低企业成本和废液排放量的纯化方法,最大限度的降低有机废液储存中的危险性。
乌拉立肽主要用于急性心衰,所以质量显得尤为重要。乌拉立肽肽序较长,中间还要经过一步氧化,杂质更多,为了提高药物的安全性,现有多肽药物纯度要求也越高越好,大多要求纯度大于99%,并需对单杂进行控制,要求单杂小于0.10%,传统纯化过程达到此标准,一般需要经过两步纯化,一步转盐,收率将会特别低;人力成本、环境成本以及产品成本都将较大。
对于多肽的纯化主要是通过反相色谱纯化,采用的固定相一般包括C18,C8,C4,C1等等,另外就是最近有些项目采用聚合物填料进行纯化甚至其它反相填料,但无论采用何种类型的填料,纯化的过程基本无变化,基本过程有2种,一种通过高压填装同种填料制备柱,柱长一般25cm左右,粒径大多为10μm,然后通过不同的色谱条件进行纯化,然后对不合格部分进行回收,最终获得合格的产品,另一种为高压填装不同类型填料的制备柱,通过柱长为25cm左右,粒径一般为10μm,然后通过不同的色谱条件进行纯化,然后对不合格部分进行回收纯化,最终获得合格的产品,对于肽序较短的多肽,以上两种方式一般经过一步纯化即可完成,而对于肽序大于25个氨基酸的多肽产品,基本需要两步纯化,加上脱盐或转盐,共需要三步才可以完成,两种方式的缺点就是规模放大后,周期较长,另不合格中间体需要经过多次回收才能得到合格产品,因为需要回收纯化,周期延长,有机溶剂使用量变大,废液排放也变多,最终产品的成本变高,质量风险和有机溶剂危险系数也变大。
发明内容
本发明提供了一种新的纯化方法,可以提高产品的纯度,纯度大于99%,单杂小于0.10%,并可以大大降低成本和环保压力。
本发明提供了一种新纯化方法,区别于传统纯化方法,可以弥补传统纯化多次回收成本增加,周期较长,废液排放量大缺点,大大提高收率,并且易于放大生产。
本发明一个方面提供一种长链多肽的纯化方法,其包括如下步骤:
1)纯化步骤:采用两根色谱柱串联进行粗品的分离;
步骤1)色谱柱填料选自C18硅胶填料、C8硅胶填料、C4硅胶填料和聚合物填料;上游色谱柱的长度为8-20cm;下游色谱柱的长度8-20cm;
步骤1)流动相:A1相为缓冲盐溶液,其pH值为2-3,优选地,所述缓冲盐溶液为硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或几种;B相为有机相,所述的有机相为乙腈、甲醇、异丙醇和乙醇;缓冲盐物质的量浓度为20mM-150mM检测波长:230nm;
步骤1)包括以梯度洗脱:A1%:95%-55%,B%:5%—45%,洗脱时间为30-120分钟;在洗脱过程中,当上游色谱柱的流出峰为杂质峰时弃去相应的流动相,当上游色谱柱的流出峰为目标峰时启动在上下游色谱柱中间设置的三通混合器所连接的色谱泵,输入10%纯化水,降低流动相中有机相比例,进行在线稀释,在线稀释后进入下游色谱柱;
可选地,还包含作为转盐的步骤2):
步骤2)采用步骤1)中的上游色谱柱进行转盐,A2相为体积比0.05%-0.2%的醋酸水溶液;B相为有机相,所述的有机相为乙腈、甲醇、异丙醇和乙醇;检测波长:230nm;
步骤2)包括:将步骤1)得到的目标峰产物进行上样;以95%A2和5%的B冲洗15-30min进行脱盐;
然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:95%-55%,B%:5%-45%,洗脱10-30min,收集目标产物。
在本发明的技术方案中,所述的长链多肽选自35个氨基酸以上的长链多肽,优选为乌拉立肽、利拉鲁肽、萨摩鲁肽、胸腺法新、阿巴帕肽、利西拉肽等。
在本发明的技术方案中,步骤1)中上游色谱柱填料为10μm的C18硅胶填料,长度为10-15cm,第二色谱柱为5μm的C18硅胶填料,长度为10-15cm。
在本发明的技术方案中,步骤1)包括以梯度洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—55%,洗脱时间为50-70分钟。
在本发明的技术方案中,A1相pH值为2.2-2.8。
在本发明的技术方案中,A2相为体积比0.1%-0.4%的醋酸铵溶液。
在本发明的技术方案中,步骤2)以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。
在本发明的技术方案中,步骤2)以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱10-30min,收集目标产物。
在本发明的技术方案中,所述的在线稀释为目标峰进入下游色谱柱前,经过第三泵输入10%纯化水,降低有机相比例。
一种新的纯化方法,同时装两根不同类型的色谱柱,第一制备柱为10μm C18,第二制备柱为5μm C18,考虑柱压、柱效以及填料综合成本,柱长均为10-15cm,然后串联,对于乌拉立肽纯化,粒径较大者在前,粒径较小者在后,然后将乌拉立肽氧化液上样纯化,经过纯化转盐后的得到乌拉立肽精肽。
一种新的乌拉立肽的纯化方法,采用两种不同类型的填料填装两根制备柱,然后串联,分一步纯化和一步转盐,第一步以一定浓度、一定pH缓冲盐溶液为A1相,以乙腈为B相,第二步以一定浓度醋酸为A2相,以乙腈为B相,梯度洗脱的HPLC方法转盐,收集溶液冻干即得到醋酸乌拉立肽。
乌拉立肽肽链较长,合成产生杂质较多,并且含有如Ser等合成过程中易异构化的氨基酸而导致粗肽中具有异构体杂质。本发明通过新的纯化方法,可以将两种不同类型填料进行串联纯化,利用两种不同类型填料、不同的分离能力的特点,第一制备柱进行纯化后,目标峰不流出制备***,进入下游色谱柱前,经过第三泵输入10%纯化水,降低有机相比例,然后接进入第二制备柱进行二次分离,原先需要两步纯化的过程,一步纯化完成,还减少了中间体处理过程、中间体存储引起的析出、变性等其它影响产品质量风险,省时省力,本纯化方法可以将粗肽中的异构体杂质和其它难分离杂质很好的分离而去除,然后利用反相HPLC方法转成醋酸盐,最终提高了产品的收率和纯度,同时解决传统纯化方法费时费力污染重的缺点,操作简便,有利于实现规模化的制备,并提供了一种新思路的纯化方法。
作为优选,本发明所述HPLC方法的流动相A1中缓冲盐物质的量浓度为20mM—150mM,流动相A2中醋酸的体积比为0.05%-0.2%。
作为优选,本发明所述HPLC方法的流动相A1中pH的范围为2.2-2.8。
其中,作为优选,所述缓冲盐为硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或几种。
作为优选,本发明所述纯化HPLC方法的流动相B的乙腈。
作为优选,本发明所述纯化HPLC方法的固定相为十八烷基,粒径为5μm和10μm。
有益效果
串联制备柱纯化是利用两种不同分离能力的填料进行纯化,在原有柱长度的情况下,实现两次分离,减少了回收次数,减少了周期,减少了有机相的使用量,并且操作简单,易于放大,最主要的是省时省力,节约成本,特别对于肽链长度大于35的多肽,因需要多步纯化并回收,效果将会更突出,主要是因为肽链越长,其疏水性增强,洗脱时有机相使用量增大,加上多次回收,所以废液量特别大。
实施例如下:
纯化规模包括以下规格色谱柱:5cm×25cm(柱子直径×长度)、10cm×25cm、15cm×25cm。
附图说明
图1为线性粗肽质谱结果。
图2为精肽质谱结果。
图3为实施例1纯品的HPLC结果。
图4为实施例2纯品的HPLC结果。
图5为实施例3纯品的HPLC结果。
图6为实施例4纯品的HPLC结果。
图7为实施例5纯品的HPLC结果。
图8为实施例6纯品的HPLC结果。
图9为实施例7纯品的HPLC结果。
图10为实施例8纯品的HPLC结果。
图11为实施例9纯品的HPLC结果。
具体实施方式
实施例1:乌拉立肽粗肽纯化
将乌拉立肽线性粗肽2.0g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:5cm×10cm。以C18硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:5cm×15cm。
第一步:流动相:A1相:50mmol/L的磷酸二氢钾溶液用磷酸调pH至2.2;B相:色谱纯乙腈。流速:60-80ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通混合器连接的第三泵在线稀释后进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为5-20ml/min。
第一步循环纯化后,符合质量要求的目标产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:60-80ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱20min,收集目的峰。将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽0.92g。纯度99.28%,单个杂质均小于0.15%。纯化收率68%(以粗品中乌拉立肽含量计算),总收率46%,纯化过程中,不需要对中间体进行回收纯化,经过计算,相对于实施例4-5,由于第一步循环次数降低,纯化单位质量的乌拉力肽粗肽的废液排放减少约30%。
实施例2:乌拉立肽粗肽纯化
将乌拉立肽粗肽15g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:10cm×15cm。以C18硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:10cm×10cm。
第一步:流动相:A1相:150mmol/L的磷酸二氢钾溶液用磷酸调pH至2.5;B相:色谱纯乙腈。流速:200-220ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%-35%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通混合器连接的第三泵在线稀释后进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为20-50ml/min。
第一步循环纯化后,符合质量标准的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:200-220ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,20min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽7.1g。纯度99.30%,单个杂质均小于0.10%。纯化收率73.9%(以粗品中乌拉立肽含量计算),总收率47.3%,经过计算,相对于实施例4-5,由于第一步循环次数降低,纯化单位质量的乌拉力肽粗肽的废液排放减少约35%。
实施例3:乌拉立肽粗肽纯化
将乌拉立肽粗肽25g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:15cm×15cm。以C18硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:15cm×10cm。
第一步:流动相:A1相:100mmol/L的硫酸铵溶液用磷酸调pH至2.8;B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通混合器连接的第三泵在线稀释后进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为45-100ml/min。
第一步循环纯化后符合质量要求的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱20min,收集目的峰。将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽12.1g。纯度99.26%,单个杂质均小于0.10%。纯化收率67%(以粗品中乌拉立肽含量计算),48.4%,经过计算,相对于实施例4-5,由于第一步循环次数降低,纯化单位质量的乌拉力肽粗肽的废液排放减少约40%。
实施例4:乌拉立肽粗肽纯化对照例
将乌拉立肽粗肽25g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:15cm×25cm。
第一步:流动相:A1相:100mmol/L的硫酸铵溶液用磷酸调pH至2.8;B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。
第一步循环后符合质量标准的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱20min,收集目的峰。将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽8.1g。纯度99.30%,单个杂质均小于0.10%。纯化收率64%(以粗品中乌拉立肽含量计算),总收率32.4%,经过计算,25克粗肽纯化时,不合格馏分需要至少3次回收纯化后才与实施例1所得的结果相同,车间放大后,不合格馏分回收次数至少增加30%~40%,乙腈用量多20~30%,废液排放多约40%,周期多30%。
实施例5:乌拉立肽粗肽纯化对照例
将乌拉立肽粗肽25g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱1:以C18硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱,柱子直径和长度为:15cm×25cm。
第一步:流动相:A1相:100mmol/L的硫酸铵溶液用磷酸调pH至2.8;B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。
第一步循环后符合质量标准的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱20min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽8.3g。纯度99.30%,单个杂质均小于0.10%。纯化收率64%(以粗品中乌拉立肽含量计算),总收率33.2%,经过计算,乙腈用量多15%,废液排放多约35%,周期多20%,但制备过程中,馏分储存过程中析出,溶解难度较大,并且制备时,柱压较高,接近制备***的上限,不建议使用5μm的反相填料进行制备,填料成本也较高。
实施例6:乌拉立肽粗肽纯化对照例
将乌拉立肽粗肽25g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:15cm×15cm。以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:15cm×10cm。
第一步:流动相:A1相:100mmol/L的硫酸铵溶液用磷酸调pH至2.8;B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通混合器连接的第三泵在线稀释进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为45-100ml/min。
第一步循环纯化后符合质量要求的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱20min,收集目的峰。将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽8.52g。纯度99.24%,单个杂质均小于0.10%。纯化收率64%(以粗品中乌拉立肽含量计算),34.1%,经过计算,相对于实施例4,由于第一步循环降低10%左右,纯化单位质量的乌拉力肽粗肽的废液排放减少约5%。粒径较大时,串联同种色谱填料优势不明显。
实施例7:乌拉立肽粗肽纯化对照例
将乌拉立肽粗肽25g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:15cm×15cm。以C18硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:15cm×10cm。
第一步:流动相:A1相:100mmol/L的硫酸铵溶液用磷酸调pH至2.8;B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将乌拉立肽线性粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通混合器连接的第三泵在线稀释后进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为45-100ml/min。
第一步循环纯化后符合质量要求的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样步骤1得到的产品,以95%A2和5%B冲洗15-30min进行脱盐。然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱20min,收集目的峰。将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准的乌拉立肽。
冻干后得白色粉末状固体精肽8.9g。纯度99.24%,单个杂质均小于0.10%。纯化收率66%(以粗品中乌拉立肽含量计算),35.6%,经过计算,相对于实施例5,由于采用相同的小粒径后,有些杂质去除效果变好,有些杂质去除反而变弱,总体折算,第一步循环次数降低20%左右,纯化单位质量的乌拉力肽粗肽的废液排放减少约15%。但是填料成本升高30%,总体折算,优势不明显。
实施例8:萨摩鲁肽粗肽纯化
将萨摩鲁肽粗肽15g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C8硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:15cm×10cm。以C4硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:15cm×10cm。
第一步:流动相:流动相:A1相:100mmol/L碳酸氢铵溶液用四甲基氢氧化铵调pH至8.0;B相:色谱纯乙腈:异丙醇(9:1)。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将萨摩鲁肽粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:85%-65%,B%:15%—35%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通混合器连接的第三泵在线稀释后进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为50-70ml/min。
第一步循环纯化后符合质量要求的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-7.0,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1将色谱柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样,用含5%乙腈的0.1-0.4%的醋酸铵溶液(pH为6.5-7.0)冲洗15-30min,最后用梯度洗脱,乙腈梯度:B%:40%—60%,40min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约15-50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准萨摩鲁泰。。
冻干后得白色粉末状固体精肽4.1g。纯度99.32%,单个杂质均小于0.15%。纯化收率57%(以粗品中萨摩鲁泰含量计算),总收率27.3%。经过串联后,废液排放减少35%,周期减少25%。
实施例9:利拉鲁肽粗肽纯化
将利拉鲁肽粗肽15g溶解过滤,收集滤液备用。
1、纯化条件:色谱柱:以C18硅胶填料10μm粒径的固定相色谱柱为制备柱1,柱子直径和长度为:15cm×15cm。以C4硅胶填料5μm粒径的固定相色谱柱为制备柱2,柱子直径和长度为:15cm×15cm。
第一步:流动相:流动相:A1相:100mmol/L碳酸氢铵溶液用氨水调pH至8.0;B相:色谱纯乙腈:异丙醇(9:2)。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将利拉鲁肽粗肽溶液上样,并以以下梯度进行洗脱:A1%:70%-55%,B%:30%—45%,共洗脱50-70min。洗脱过程中经过色谱柱1分离时,杂质峰废液处理,在目标产物出峰时经过三通连接的第三泵在线稀释后进入柱2,进行二次分离。
在线稀释的流动相为纯化水,流速为50-100ml/min。
第一步循环纯化后符合质量要求的产物,进入第二步。
第二步:流动相:A2相:0.1-0.4%的醋酸铵溶液,pH值为6.5-6.8,B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。
将制备柱1将色谱柱用50%以上的乙腈溶液冲洗干净后上样,用含5%乙腈的0.1-0.4%的醋酸铵溶液冲洗15-30min,最后用梯度洗脱,乙腈梯度:B%:40%—60%,30min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.0%的符合标准利拉鲁肽。。
冻干后得白色粉末状固体精肽3.8g。纯度99.32%,单个杂质均小于0.15%。纯化收率52%(以粗品中利拉鲁肽含量计算),总收率25.3%。经过串联后,废液排放减少30%,周期减少25%左右。
Claims (8)
1.一种长链多肽的纯化方法,其包括如下步骤:
1)纯化步骤:采用两根色谱柱串联进行粗品的分离;
步骤 1)中上游色谱柱填料为 粒径10μm 的 C18 硅胶填料,下游色谱柱为 粒径5μm的C18 硅胶填料;
步骤 1)流动相:A1 相为缓冲盐溶液,其 pH 值为 2-3,所述缓冲盐溶液为硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或几种;B 相为有机相,所述的有机相为乙腈、甲醇、异丙醇和乙醇;缓冲盐物质的量浓度为 20mM-150mM,检测波长:230 nm;
步骤 1)包括以梯度洗脱:A1%:95%-55%,B%: 5%—45%,洗脱时间为30-120 分钟;在洗脱过程中,当上游色谱柱的流出峰为杂质峰时弃去相应的流动相,当上游色谱柱的流出峰为目标峰时启动在上下游色谱柱中间设置的三通混合器所连接的色谱泵,输入纯化水,进行在线稀释,在线稀释后目标峰进入下游色谱柱;
所述纯化方法还包含作为转盐的步骤 2):
步骤 2)采用步骤 1)中的上游色谱柱进行转盐,A2 相为体积比0.05%-0.2%的醋酸水溶液;B 相为有机相,所述的有机相为乙腈;检测波长:230 nm;
步骤 2)包括:将步骤 1)得到的目标峰产物进行上样;以 95% A2 和 5%的B 冲洗 15-30min 进行脱盐;
然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:95%-55%,B%: 5%-45%,洗脱 10-30min, 收集目标产物;
所述的在线稀释为目标峰进入下游色谱柱前,经过第三泵输入 10%纯化水,降低有机相比例;
所述的长链多肽为乌拉立肽。
2.一种长链多肽的纯化方法,其包括如下步骤:
1)纯化步骤:采用两根色谱柱串联进行粗品的分离;
步骤 1)中上游色谱柱填料为 粒径10μm 的 C18 硅胶填料,下游色谱柱为 粒径5μm的C18 硅胶填料;
步骤 1)流动相:A1 相为缓冲盐溶液,其 pH 值为 8,所述缓冲盐溶液为碳酸氢铵;B相为有机相,所述的有机相为乙腈、甲醇、异丙醇和乙醇;缓冲盐物质的量浓度为 20mM-150mM,检测波长:230 nm;
步骤 1)包括以梯度洗脱:A1%:95%-55%,B%: 5%—45%,洗脱时间为30-120 分钟;在洗脱过程中,当上游色谱柱的流出峰为杂质峰时弃去相应的流动相,当上游色谱柱的流出峰为目标峰时启动在上下游色谱柱中间设置的三通混合器所连接的色谱泵,输入纯化水,进行在线稀释,在线稀释后目标峰进入下游色谱柱;
所述纯化方法还包含作为转盐的步骤 2):
步骤 2)采用步骤 1)中的上游色谱柱进行转盐,A2 相为体积比0.05%-0.2%的醋酸水溶液;B 相为有机相,所述的有机相为乙腈;检测波长:230 nm;
步骤 2)包括:将步骤 1)得到的目标峰产物进行上样;以 95% A2 和 5%的B 冲洗 15-30min 进行脱盐;
然后以梯度洗脱进行转盐,A2%:95%-55%,B%: 5%-45%,洗脱 10-30min, 收集目标产物;
所述的在线稀释为目标峰进入下游色谱柱前,经过第三泵输入 10%纯化水,降低有机相比例;
所述的长链多肽为萨摩鲁肽或利拉鲁肽。
3.根据权利要求 1 或 2 所述的纯化方法,步骤 1)中上游色谱柱填长度为10-15cm,下游色谱柱长度为 10-15cm。
4.根据权利要求 1 或 2 所述的纯化方法,步骤 1)包括以梯度洗脱:A1%:85%-65%,B%: 15%—55%,洗脱时间为 50-70 分钟。
5.根据权利要求 1 所述的纯化方法,A1 相 pH 值为 2.2-2.8。
6.根据权利要求 1 或 2 所述的纯化方法,A2 相为体积比 0.1%-0.4%的醋酸铵溶液。
7.根据权利要求 1 或 2 所述的纯化方法,步骤 2)以 95% A2 和 5% B 冲洗15-30min 进行脱盐。
8.根据权利要求 1 或 2 所述的纯化方法,步骤 2)以梯度洗脱进行转盐,A2%:85%-65%,B%:15%-35%,洗脱 10-30min,收集目标产物。
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