CN105911195A

CN105911195A - 一种含有辣椒碱类化合物的食用油标准物质制备方法

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Publication number: CN105911195A
Application number: CN201610210049.9A
Authority: CN
Inventors: 国振; 李秀琴; 张庆合; 李红梅
Original assignee: National Institute of Metrology
Current assignee: National Institute of Metrology
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2016-08-31

Abstract

本发明公开了一种含有辣椒碱类残留的食用油标准物质的制备方法。通过逐步稀释混匀的方法，均匀添加辣椒碱类化合物至大豆油中，获得含有痕量辣椒碱类残留的食用油基体标准物质。以液相色谱同位素稀释质谱法的高准确度测量进行均匀性检验和稳定性监测，以及标准物质的赋值。该标准物质具有良好的均匀性和稳定性，可用于食用油中辣椒碱类化合物的检测，以及地沟油初步筛查鉴别工作，作为标准物质可用于校准计量器具和评价测量方法。

Description

一种含有辣椒碱类化合物的食用油标准物质制备方法

技术领域

本发明涉及食用油中掺假鉴别技术领域，特别涉及一种含有辣椒碱类化合物的食用油标准物质的制备方法。

背景技术

辣椒中的辛辣成分是由一系列同类物质组成，它们的结构和性质非常相近，称为辣椒素类物质，又名辣椒碱类物质(Capsaicinoids)，均是由香草基胺和含有8～13个C组成的支链脂肪酸(酰基部分)构成的化合物。在目前已知的大约19种辣椒素类物质中辣椒素(Capsaicins)、二氢辣椒素(Dihydrocapsaicins)和降二氢辣椒素(Nordihydrocapsaicin)是辣椒中含量最高的三种化合物，是辣椒中的主要活性成分，也是辣椒中辣味的主要来源。此外，壬酸香草酰胺，又名合成辣椒素(N-Vanillylnonanamide，Nonylic acidvanillylamide)，虽然在天然辣椒中含量很低，但是由于经人工合成后作为常用的辣味调料深受国内外用户的采用和好评，也是重要的辣椒素类物质。图1为一般常见辣椒碱类化合物的分子结构图。

正常食用油中基本不含辣椒碱，而作为地沟油主要来源的泔水油，如果在烹饪的过程中接触了辣味调料，则不可避免的含有辣椒碱成分。由于辣椒碱本身的亲脂性、稳定性和高沸点，很难从地沟油中清除干净，因此可以作为鉴别地沟油的特异性指标。目前，针对地沟油中辣椒碱成分含量的液相色谱-质谱检测方法已有报道，王龙星等采用固相萃取-液相色谱-串联质谱技术，以二苯胺作为进样内标，建立了食用油中3种微量辣椒碱(辣椒素、二氢辣椒素及壬酸香草酰胺)的检测方法。张忠等建立了地沟油中辣椒碱类化合物(包括辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素)及丁香酚的液-液萃取-液相色谱-串联质谱检测方法。吴惠勤等同样建立了液-液萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定地沟油中辣椒素、二氢辣椒素及胡椒碱3种难挥发性微量杂质成分的方法。目前文献报道的关于地沟油中辣椒碱类物质的鉴别限为2.0μg/kg，其残留水平属于痕量残留，检测结果的准确性需要得到保障。然而，目前关于食用油中痕量辣椒素的检测，没有国家标准方法，没有标准物质，检测结果的准确性无法保障。

标准物质在保证分析方法的准确性及可溯源性方面具有重要作用。分析基体的差异使得在分析过程中不能简单地采用传统的高纯度溶液标准物质来校准或进行质量控制，需要采用相应基体的标准物质以提高检测结果的准确度。与传统的高纯度溶液标准物质相比，含有辣椒碱类物质的大豆油标准物质具有量值溯源性，对仪器的校准、检测实验室的质量控制、食用油中辣椒碱类的检测方法的开发等具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种含有辣椒碱类化合物的食用油标准物质制备方法，用以解决食用油掺假鉴别中对标准物质的需求。

一种含有辣椒碱类化合物的食用油标准物质制备方法包括：

标物原料筛查：采用LC-MS/MS方法，对市售的各品牌食用植物油中的辣椒碱类物质等进行筛查，选取不含辣椒碱类物质的空白大豆油作为标准物质研制原材料；

标准物质添加制备：采用逐步添加法，具体包括：

1)称取辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素3种标准物质适量，加入约1200g大豆油中，旋转混匀24小时，得到各辣椒碱组分浓度为4μg/kg的大豆油；

2)称取步骤1)中大豆油适量，缓慢加入2000g空白大豆油，加入空白大豆油过程中保持不断搅拌，旋转混匀24小时，得到各辣椒碱组分浓度为1.1μg/kg的大豆油；

标准物质分装：氮气保护条件下分装于40mL棕色样品瓶中，每瓶约20mL，不透明包装袋真空密封包装；充氮保护时，氮气流量为10psi。

所述方法还包括：标准物质保存：0-4℃条件下避光保存。

本发明实施例中，通过逐步稀释混匀的方法，均匀添加辣椒碱类化合物至大豆油中，获得含有痕量辣椒碱类残留的食用油基体标准物质。以液相色谱同位素稀释质谱法的高准确度测量进行均匀性检验和稳定性监测，以及标准物质的赋值。该标准物质具有良好的均匀性和稳定性，可用于食用油中辣椒碱类化合物的检测，以及地沟油初步筛查鉴别工作，作为标准物质可用于校准计量器具和评价测量方法。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、说明书附图、权利要求书中所特别指出的结构来实现和获得。

下面结合附图，通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为辣椒碱类化合物的分子结构图；

图2为辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素3种辣椒碱类化合物及其同位素的LC-MS/MS的MRM谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

正常食用油中基本不含辣椒碱，而作为地沟油主要来源的泔水油，如果在烹饪的过程中接触了辣味调料，则不可避免的含有辣椒碱成分。目前，餐饮业中广泛使用的辣味调料主要有两种，一种是天然辣椒，其主要辣味成分为辣椒素和二氢辣椒素，两者含量占辣椒中辣椒碱成分的90％以上，另一种为人工合成的壬酸香草酰胺(合成辣椒素)。由于辣椒碱本身的亲脂性、稳定性和高沸点，很难从地沟油中清除干净，因此可以作为鉴别地沟油的特异性指标。

本实施例选择辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素鉴别地沟油的特异性指标，研制大豆油中辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素基体标准物质，用于保障地沟油筛查结果的准确可靠。

标物原料筛查：采用LC-MS/MS方法，对市售的各品牌食用植物油中的辣椒碱类物质等进行筛查，选取不含辣椒碱类物质的空白大豆油作为标准物质研制原材料。

标准物质添加制备：采用逐步添加法，具体包括：

所述方法还包括：标准物质保存：0-4℃条件下避光保存。

(一)均匀性检验。

均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。

均匀性的检测方法：

工作曲线用标准溶液配制：分别准确称取4种辣椒碱标准品和2种同位素内标(精确至0.01mg)适量，甲醇-水(1∶1，v/v)溶解，配制成含量约为1000μg/kg的标准储备液，置于-20℃冰箱中保存。使用时甲醇-水(1∶1，v/v)稀释配制成相应浓度的标准溶液。

前处理用同位素标记物标准溶液配制：分别称取2种同位素内标(精确至0.01mg)适量，乙酸乙酯溶解，配制成含量约为1000μg/kg的标准储备液，置于-20℃冰箱中保存。使用时乙酸乙酯稀释配制成相应浓度的标准溶液。

样品预处理

取0.5g食用油样品于10mL Peek管中，加入相应量乙酸乙酯溶解稀释的同位素内标(根据初步实验确定用量，使油样中辣椒碱含量与标记物含量比接近1∶1)，涡旋混匀并静置20min以上，加入600μL二氯甲烷，再加入3mL 20g/L氢氧化钠，涡旋提取10min，以8000r/min离心5min，取上层水相；残留油相再用3mL 20g/L氢氧化钠重复提取一次，合并水相，用硫酸-水(1∶15，v/v)调节pH在2～3之间后进行固相萃取(SPE)操作。C18固相萃取小柱预先用9mL甲醇及6mL纯水淋洗进行活化；然后将调完pH值的水相提取液加入，调节SPE装置的流速至1.5mL/min，待全部溶液通过SPE小柱后，以6mL超纯水淋洗，弃去流出液；最终以6mL甲醇洗脱目标化合物。用氮吹装置于45℃缓缓吹干后，1mL溶剂(甲醇∶水＝1∶1)溶解残渣，再转入样品瓶中进行LC-MS/MS测定。

仪器条件

自动固相萃取仪条件

本实验固相萃取部分采用商品化的全自动固相萃取仪完成，具体参数如下：

仪器：Reeko Fotector-06C全自动固相萃取仪

固相萃取小柱：Waters Sep-Pak Vac 6cc(500mg)C18 Cartridges

液相色谱条件

色谱柱为BEH C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm；美国Waters公司)；流动相A：0.1％甲酸水溶液，B：乙腈。梯度洗脱程序：0～3.5min，40％B；3.5～4.5min，40％B～60％B；4.5～5.5min，60％B～100％B；5.5～7.5min，100％B；7.5～10min，40％B。流速为0.3mL/min；进样体积为5μL；柱温30℃。

质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描方式；多反应监测(MRM)模式；源温度150℃，毛细管电压3.5kV，干燥气温度500℃，干燥气(氮气)流速900L/h，碰撞气(氩气)流速0.16mL/min。其它多反应监测质谱参数及保留时间见表1。

表1 辣椒碱及同位素内标的多反应监测质谱参数及保留时间

表1中，每种化合物选择3个碎片离子，其中1个用于定量(带*)，另外2个用于定性。降二氢辣椒素和合成辣椒素没有同位素内标，但是其结构以及在色谱中的保留时间与辣椒素相似，所以采用辣椒素的同位素作为内标。

从标准物质的100个包装中随机抽取10个包装，每个包装取3个子样做瓶间和瓶内均匀性检验。最小取样量为0.5g，按照上述的样品前处理方法和液相色谱-同位素稀释质谱法进行测试。将均匀性方差分析结果(sbb)与该特性值标准不确定度的预期目标进行比较，若不显著，则标准物质视为均匀。应计算待测特性值的不均匀性引入的不确定度分量，并计入标准物质总的不确定度中。

具体均匀性检测结果见表2～表4。

表2 样品中辣椒素均匀性检验结果

瓶间标准偏差的估计值用下式计算：

重复性标准偏差s_r可以用s₂ ²计算：

结果发现s_bb＜s_r，采用以下公式计算瓶间标准偏差的估计值，以反映重复性标准偏差相对较大的情况：

估计得到的瓶间标准偏差s_bb大于重复性标准偏差s_r对s′_bb的影响，故瓶间均匀性标准偏差s_bb＝u_bb＝0.0075μg/kg。

表3 样品中二氢辣椒素均匀性检验结果

瓶间标准偏差的估计值用下式计算：

重复性标准偏差s_r可以用s₂ ²计算：

估计得到的瓶间标准偏差s_bb小于重复性标准偏差s_r对s′_bb的影响，故瓶间均匀性标准偏差s′_bb＝u_bb＝0.0037μg/kg。

表4 样品中合成辣椒素均匀性检验结果

瓶间标准偏差的估计值用下式计算：

重复性标准偏差s_r可以用s₂ ²计算：

估计得到的瓶间标准偏差s_bb小于重复性标准偏差s_r对s′_bb的影响，故瓶间均匀性标准偏差s′_bb＝u_bb＝0.0081μg/kg。

(二)稳定性监测

稳定性是标准物质特性量值随时间变化的度量，主要与被分析物理化特性、基体特性以及保存条件等因素有关。稳定性要求与确定的目标不确定度、用途等因素有关。对于本质控样品，在规定保存条件(4-10℃)下，按先密后疏的原则，分别在第1、3、6个月进行稳定性检测。检验方法为液相色谱-串联质谱法，每次取5个包装，每个包装取一个子样，把5个包装的测量结果平均值作为检测结果。根据规范《标准物质定值的通用原则及统计学原理的要求》(JJG 1343-2012)采用方差分析法对标准物质的稳定性监测数据进行计算，并评价稳定性引入的不确定度，以结果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。具体见表5～表7。

表5 食用油中辣椒素的稳定性监测结果(μg/kg)

监测时间	2014年3月	2014年4月	2014年6月	2014年9月
					#1	1.074	1.077	1.070	1.074
#2	1.097	1.103	1.096	1.099
					#3	1.079	1.096	1.093	1.080
#4	1.095	1.076	1.061	1.093
					#5	1.102	1.049	1.068	1.083
平均值	1.090	1.080	1.077	1.086
					标准偏差	0.012	0.021	0.016	0.010

由于没有物理或化学模型能够真实地描述食用油中辣椒素的降解机理，故可选用线性模型作为该候选标准物质的经验模型。

直线斜率b₁可用下式计算：

截距b₀可由下式计算：

直线上每点的标准偏差可用下式计算：取平方根，得s＝0.01527μg/kg

与斜率相关的不确定度为：

在自由度为n-2＝2，置信水平p＝0.95(95％的显著水平)条件下，t-检验的临界值等于4.30。由于|b₁|＜t_0.95，n-2·s(b₁)＝0.0064，故斜率并不显著，因此，没有观察到不稳定性变化趋势。

有效期t＝6个月的稳定性引起的不确定度贡献可用下式计算：

u_s＝s_(b1)·X＝0.001490×6＝0.0090μg/kg。

表6 食用油中二氢辣椒素的稳定性监测结果(μg/kg)

监测时间	2014年3月	2014年4月	2014年6月	2014年9月
					#1	1.128	1.125	1.141	1.121
#2	1.136	1.131	1.126	1.120
					#3	1.134	1.107	1.136	1.123
#4	1.129	1.115	1.117	1.130
					#5	1.115	1.134	1.135	1.123
平均值	1.128	1.122	1.131	1.123
					标准偏差	0.008	0.011	0.010	0.004

直线斜率b₁可用下式计算：

截距b₀可由下式计算：

直线上每点的标准偏差可用下式计算：取平方根，得s＝0.00894μg/kg

与斜率相关的不确定度为：

在自由度为n-2＝2，置信水平p＝0.95(95％的显著水平)条件下，t-检验的临界值等于4.30。由于|b₁|＜t_0.95，n-2·s(b₁)＝0.0037，故斜率并不显著，因此，没有观察到不稳定性变化趋势。

u_s＝s_(b1)·X＝0.000872×6＝0.0053μg/kg。

表7 食用油中合成辣椒素的稳定性监测结果(μg/kg)

监测时间	2014年3月	2014年4月	2014年6月	2014年9月
					#1	1.167	1.169	1.177	1.122
#2	1.182	1.174	1.184	1.185
					#3	1.114	1.181	1.176	1.127
#4	1.152	1.107	1.175	1.179
					#5	1.115	1.112	1.151	1.175
平均值	1.146	1.148	1.172	1.158
					标准偏差	0.031	0.036	0.013	0.030

直线斜率b₁可用下式计算：

截距b₀可由下式计算：

直线上每点的标准偏差可用下式计算：取平方根，得s＝0.02873μg/kg

与斜率相关的不确定度为：

在自由度为n-2＝2，置信水平p＝0.95(95％的显著水平)条件下，t-检验的临界值等于4.30。由于|b₁|＜t_0.95，n-2·s(b₁)＝0.0121，故斜率并不显著，因此，没有观察到不稳定性变化趋势。

u_s＝s_(b1)·X＝0.002804×6＝0.0168μg/kg。

(三)标准物质的定值

采用液相色谱同位素稀释质谱法进行定值。具体定值结果见表8～表10。

表8 样品中辣椒素定值结果

经夏皮罗-威尔克法检验测定数据符合正态分布，经狄克逊(Dixon)法和格拉布斯(Grubbs)法检验均无可疑值。

故总平均值即为标准值：1.083μg/kg。

总平均值的标准不确定度等于总平均值的标准偏差，即不确定度的A类分量：uA＝0.0050μg/kg。

表9 样品中二氢辣椒素定值结果

故总平均值即为标准值：1.127μg/kg。

总平均值的标准不确定度等于总平均值的标准偏差，即不确定度的A类分量：uA＝0.0023μg/kg。

表10 样品中合成辣椒素定值结果

故总平均值即为标准值：1.156μg/kg。

总平均值的标准不确定度等于总平均值的标准偏差，即不确定度的A类分量：uA＝0.0084μg/kg。

大豆油中辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素基体标准物质的标准值与不确定度见表11。

表11 样品中标准值与不确定度

综上所述，本发明实施例中，通过逐步稀释混匀的方法，均匀添加辣椒碱类化合物至大豆油中，获得含有痕量辣椒碱类残留的食用油基体标准物质。以液相色谱同位素稀释质谱法的高准确度测量进行均匀性检验和稳定性监测，以及标准物质的赋值。该标准物质具有良好的均匀性和稳定性，可用于食用油中辣椒碱类化合物的检测，以及地沟油初步筛查鉴别工作，作为标准物质可用于校准计量器具和评价测量方法。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种含有辣椒碱类化合物的食用油标准物质制备方法，其特征在于，包括：

标物原料筛查：对市售的各品牌食用植物油中的辣椒碱类物质等进行筛查，选取不含辣椒碱类物质的空白大豆油作为标准物质研制原材料；

标准物质添加制备：采用逐步添加法，具体包括：

3)标准物质分装：氮气保护条件下分装于40mL棕色样品瓶中，每瓶约20mL，不透明包装袋真空密封包装。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

标准物质保存：0-4℃条件下避光保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

所述样品充氮保护时，氮气流量为10psi。