CN109696499B - 一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其特征在于：包括如下步骤：水样在经过样品前处理后，采用色谱柱分离，高分辨质谱全扫描模式检测，内标法定量，所述样品前处理包括固相萃取富集和氮吹定量浓缩。本发明方法对于不同物质的检测限(LOD)为0.05～0.5ng/L，定量限(LOQ)为0.1～1.0ng/L，远低于目前世界各国的限量水平，线性范围为0.2～500μg/L，相关系数(R²)为0.9943～0.9997。

Description

一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法

技术领域

本发明涉及化学物质的测定方法，特别是涉及一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵 敏测定方法。

背景技术

亚硝胺是一类具有-N-N＝O结构的污染物，迄今为止已发现的300多种亚硝胺中约有90％ 具有致癌作用。近年来其在啤酒、熏肉制品、化妆品、烟草和乳胶制品中均被检出。亚硝胺 被媒体称为“水中的PM 2.5”，在河水、地下水、污水和饮用水中均发现了亚硝胺的存在，研 究表明，包括二氧化氯，臭氧及氯在内的消毒过程结合紫外线等可能导致亚硝胺含量增加。 饮用水中亚硝胺的安全问题逐渐受到重视，国际癌症研究署(IARC)将N-亚硝基二甲胺 (NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA)列为2A类致癌物，将N-亚硝基二丙胺(NDPA)、 N-亚硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基吡咯(NPYR)、N-亚硝 基哌啶(NPIP)和N-亚硝基二丁胺(NDBA)列为2B类致癌物。美国环境保护署(EPA) 规定NDEA、NDMA、NDBA和NPYR水体中的最高容许浓度(致癌风险达到10^-5时)分别 为2、7、60和200ng/L；加利福尼亚州规定饮用水中NDMA、NDEA和NDPA的限量为10ng/L； 德国规定NDMA和NMOR的最大残留限量为10ng/L；加拿大国家标准中规定NDMA限值 为40ng/L。我国也亟待出台饮用水中亚硝胺的限量标准。

由于水中亚硝胺的限量和含量极低，因此预富集浓缩的前处理步骤必不可少。已报道的 液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等前处理技术中，SPE可对大体积水样进行萃取，具有重现性好、浓缩倍数高等特点，适用于各种类型水体中亚硝胺的萃取， 还可根据水样类型选择合适的填料，是水中亚硝胺萃取的主要手段。目前水中亚硝胺的检测 方法有液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(HPLC-MS)、气相色谱(GC)和气相色谱-质谱 (GC-MS)等，如我国行标HJ 809-2016采用气相色谱法测定水中的4种亚硝胺。研究发现采用单纯色谱或者低分辨质谱检测的选择性较差，易与干扰化合物重叠，产生假阳性；其中电子轰击电离源(EI源)GC-MS易产生无差别的离子碎片，给甄别干扰物和目标物带来困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法。

本发明将SPE结合气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱，建立饮用水中16种痕量亚硝胺 的检测方法。首先对色谱质谱条件进行优化以提高仪器检测的灵敏度，通过设计正交试验来 优化SPE萃取条件，接下来对方法的定量限、线性、回收率、精密度等进行评价，最后应用 于实际水样测定。

一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，包括如下步骤：水样在经过样品前 处理后，采用色谱柱分离，高分辨质谱全扫描模式检测，内标法定量，所述样品前处理包括 固相萃取富集和氮吹定量浓缩。

本发明所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其中，所述样品前处理 过程具体包括如下步骤：在1L水样中加入50μL的0.5mg/L内标溶液后混匀静置，Chromabond HR-P固相萃取柱依次用5mL甲醇活化，5mL水平衡，然后将水样以3mL/min 左右流速过柱，上样完成后，抽干1min，用10mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，加入无水 硫酸钠进行脱水，最后将上清液氮吹定量浓缩至0.5mL，供上机测定。

本发明所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其中，所述亚硝胺为N- 亚硝基二甲胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二异丙胺、N-亚硝基二丙 胺、N-亚硝基-N-甲基苯胺、N-亚硝基二异丁胺、N-亚硝基-N-乙基苯胺、N-亚硝基吡咯烷、 N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基二苯胺、N-亚硝基二环己基胺、 N-亚硝基-N.N(3.5.5-三甲基己基)胺和N-亚硝基二苄基胺。

本发明所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其中，色谱条件如下： DB-35MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；载气高纯氦气，99.999％；进样体积1μL；脉冲 不分流进样，脉冲压力200kPa，脉冲时间1min；载气流速2.0mL/min；进样口温度250℃，传输线温度250℃；程序升温：初始温度为40℃，保持1min后以15℃/min速率升至270℃， 保持5min。

本发明所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其中，质谱条件如下： 分辨率60000FWHM，200m/z；EI电离源，离子源温度280℃；溶剂延迟3min；全扫描模式，扫描范围40～300m/z。

本发明所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其中：

16种亚硝胺及2种内标的定性和定量离子见表1：

表1 16种亚硝胺物质和两种内标物的保留时间、定量和定性离子

^a表示以NDMA-d₆为内标进行定量；^b表示以NDPA-d₁₄为内标进行定量；NA^c表示数据未提供。

本发明基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法与现有技术不同之处在于：本发 明主要是采用了气相色谱-高分辨率质谱(分辨率最高可达12万)测定水中痕量的16种亚硝 胺，从而可以得到每个物质的精确质量数，精确到小数点后第五位(常规质谱为低分辨率只 能测到小数点后一位)。优点1是高灵敏度，从文中表6对比可以看出来检测限低于ng/L级 别，优于现有国内外技术。优点2是对物质检测更加准确(比如提取102.02931离子后的峰 肯定比提取102离子后的峰更干净，也即选择性更高)，质量误差≤1.839ppm，因此对目标 物质具有很高的选择性和准确性，显著减少常规低分辨率质谱假阳性的检测结果。高灵敏度 高准确性这正是采用高分辨率质谱所特有的优点。

实验水样在经固相萃取富集、氮吹定量浓缩后，DB-35MS色谱柱分离，高分辨质谱全扫 描模式检测，内标法定量。对方法的色谱分离条件、质谱离子源温度、色谱载气流速、进样 方式以及脉冲压力等进行优化，得到最优条件为离子源温度280℃、载气流速2.0mL/min、 脉冲不分流且脉冲压力为200kPa。通过四因素三水平正交实验得到最佳的固相萃取条件为 Chromabond HR-P萃取柱、10mL乙酸乙酯洗脱。结果表明，方法对于不同物质的检测限 (LOD)为0.05～0.5ng/L，定量限(LOQ)为0.1～1.0ng/L，远低于目前世界各国的限量水平， 线性范围为0.2～500μg/L，相关系数(R²)为0.9943～0.9997。4个不同水平的加标回收率在 72.4％～114.8％，相对标准偏差(RSD，n＝6)0.8％～9.5％。最后对北京地区采集的12个实际 水样进行测定，有5种亚硝胺被检出，含量在0.9～20.4ng/L。该法灵敏度、选择性和准确度 均较高，适用于水中痕量亚硝胺的确证检测。

下面结合附图对本发明的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法作进一步说 明。

附图说明

图1为本发明中16种亚硝胺经不同色谱柱分离后的总离子流色谱图；其中，各物质编号 与表1中一致，A：HP-5MS，B：DB-35MS，C：DB-624，D：DB-WAX；

图2为本发明中18种亚硝胺物质(含两种内标)的提取离子流色谱图；

图3为本发明色谱和质谱参数优化对比图；A：离子源温度，B：载气流速，C：脉冲压力。

具体实施方式

一、实验部分

1.仪器与试剂

Q Exactive GC Orbitrap型气相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱仪，配有TriPlus RSH自动 进样器(美国Thermo Fisher公司)；7890N-5977B型气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司)； TurboVap II型自动氮吹浓缩仪(美国Biotage公司)；固相萃取装置(美国Supelco公司)； Chromabond Easy、Chromabond HR-P萃取柱(500mg，6mL，德国MN公司)；Supelclean ENVI-Chrom P萃取柱(250mg，6mL，美国Supelco公司)。

16种亚硝胺及2种内标NDMA-d₆和NDPA-d₁₄的标准品购自TCI、Sigma、Dr.Ehrenstorfer、 Manhage、TRC等供应商，纯度均大于95％；正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇(色谱纯，美 国J.T.Baker公司)；无水硫酸钠(分析纯，北京化学试剂有限公司)；实验用水为经Milli-Q 净化***(美国Millipore公司)制备的超纯水。

2.标准溶液配制

分别称取50mg标准品，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，得到1000mg/L的单 标储备液。用乙酸乙酯配置成10mg/L的16种N-亚硝胺的混合储备液以及2种内标混合储备 液，进一步配置0.5mg/L的内标工作溶液，-18℃避光保存。使用时根据需要用乙酸乙酯稀释 至0.01μg/L～500μg/L的混合工作溶液，其中内标NDMA-d₆和NDPA-d₁₄的浓度均为50μg/L。

3.标准曲线绘制

将10mg/L的混合储备液用乙酸乙酯逐级稀释，配制0.2～500.0μg/L系列的标准溶液，内 标物浓度为50μg/L，分别进行测定，将待测物的定量离子峰面积与相应内标的定量离子峰面 积的比值作为纵坐标(y)，待测物的上机浓度作为横坐标(x)，绘制标准曲线。

4.样品前处理

在1L水样中加入50μL的0.5mg/L内标溶液后混匀静置。Chromabond HR-P固相萃取柱依次用5mL甲醇活化，5mL水平衡，然后将水样以3mL/min左右流速过柱，上样完成后， 抽干1min。用10mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，加入无水硫酸钠进行脱水，最后将上清 液氮吹定量浓缩至0.5mL，供上机测定。

5.检测条件

色谱条件：DB-35MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气高纯氦气(99.999％)；进样体积1μL；脉冲不分流进样，脉冲压力200kPa，脉冲时间1min；载气流速2.0mL/min； 进样口温度250℃，传输线温度250℃；程序升温：初始温度为40℃，保持1min后以15℃/min 速率升至270℃，保持5min。

质谱条件：分辨率60000FWHM(200m/z)；EI电离源，离子源温度280℃；溶剂延迟3min；全扫描模式(Full-Scan)，扫描范围40～300m/z。16种亚硝胺及2种内标的定性和定量离子见表1。

表1 18种亚硝胺物质(含2种内标物)的保留时间、定量和定性离子

^a表示以NDMA-d₆为内标进行定量；^b表示以NDPA-d₁₄为内标进行定量；NA^c表示数据未提供。

二、结果与分析

1.色谱-质谱条件优化

利用常规的低分辨气质，考察了4种色谱柱，弱极性的HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)、 中等极性的DB-35MS(30m×0.25mm×0.25μm)和DB-624(30m×0.25mm×1.4μm)、强极性 的DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)对16种亚硝胺的分离情况。结果如图1所示，色谱柱DB-624和DB-WAX具有较好的分离效果，然而DB-624对于物质3/14/15/16的响应低，检测过程中发现会明显影响其灵敏度；DB-WAX不能分离6/8两个物质，但此两个物质具有相同的监测离子106.065，若不分离则难以分别检测；HP-5MS分离效果最差，且物质1/14/15响应低；DB-35MS对各物质的响应均较好，对于共流出色谱峰能够通过提取特征离子将其有效分离，不影响定性和定量，且色谱柱热稳定性较好(340℃)。因此选用DB-35MS色谱柱进行后续研究。

Q Exactive-GC质谱仪在60000分辨率下全扫描能达到每秒7张谱图以上的采集速率，使 数据获得足够多的扫描点数；同时质量误差在1ppm以内，保证了数据的稳定性和可靠性。 欧盟EC/657/2002关于质谱定性要求必须达到4个确证点(Identification point，IP)，高分辨 质谱对精确质量数进行全扫描测定，每个离子被定义为2个确证点，一个定量离子和一个辅 助定性离子的确证点即可达到4，从而实现同时定量和定性确证。16种亚硝胺及2种内标物 的定量和辅助定性离子见表1，各个物质的提取离子流图见图2。

为了得到较高的灵敏度，对于质谱离子源温度、色谱载气流速、进样方式以及脉冲压力 进行了优化。由图3A可见，各物质峰面积随离子源温度的升高而增大，280℃之后保持相对 稳定，较高的温度有利于提高离子化效率及适当改善峰拖尾现象。图3B表明，较大的载气 流速有助于提高物质的出峰时间，进而得到较为尖锐的峰型减少峰拖尾现象，载气流速2.0 mL/min时大多数物质响应值较高。从图3C可看出脉冲不分流的效果要优于不脉冲，这是由 于脉冲进样方式在进样口施以较高压力，使物质能快速进入色谱柱，减少在进样口的分解及 损失，同时有利于得到尖锐对称的峰型。通过对脉冲压力进行优化，发现在200kPa时达到 最高点，并在之后趋于稳定，因此选择脉冲不分流且脉冲压力为200kPa。

2、固相萃取条件优化

选取填料为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的三种SPE柱用于正交试验，分别是Chromabond HR-P、Supelclean ENVI-Chrom P和Chromabond Easy。16种N-亚硝胺的正辛醇-水分配系数 (lgkow)范围为-0.57～3.90，从水溶性到油溶性均有分布，因此选取了3种不同lgkow值的 洗脱溶剂，分别是正己烷、乙酸乙酯和丙酮，其中正己烷(3.29)为亲油性，乙酸乙酯(0.86) 为亲油性同时有一定的亲水性，丙酮(-0.24)为亲水性。

选用四因素三水平正交表(L9(34))对固相萃取条件进行优化，实验设计见表2，考察 各实验条件下萃取亚硝胺含量1μg/L的100mL水溶液(换算成待测溶液浓度为200μg/L)的回收率情况。结果见表3，采用乙酸乙酯作洗脱溶剂时，各亚硝胺的回收率较好，可能因为乙酸乙酯对水溶性和油溶性的目标物质均能较好地溶解并洗脱。而正己烷的亲油性较强， 对亲水性的亚硝胺如NDMA溶解性较差，导致该物质的回收率极差。在9个正交实验中，实 验2(A1B2C2)的回收率相对较好；对实验结果进行极差分析，得到各分析物的最佳固相萃 取条件，除了NDBA，其它亚硝胺的最佳固相萃取条件都比较一致，只有洗脱量分布在两个 水平上，即8mL和10mL。之后进行验证实验采用Chromabond HR-P柱，8mL和10mL乙 酸乙酯，结果显示10mL乙酸乙酯的回收率更好，各物质均达到88％以上。由此，选定的固 相萃取条件为Chromabond HR-P萃取柱、10mL乙酸乙酯洗脱。

表2固相萃取正交试验因素水平表

表3固相萃取正交试验结果

3、方法学考察

3.1线性范围、检出限及定量下限

将不同浓度的混合标准溶液(含相同浓度的内标)，由低浓度到高浓度依次进样，绘制标 准曲线。以3倍信噪比(S/N≥3)确定16种亚硝胺物质的检出限，采用内标法进行定量，以 S/N≥10得到方法的定量限，结果如表4所示。结果表明，各物质在线性范围0.2～500μg/L 内相关系数R²≥0.9943，LOD为0.05～0.5ng/L，LOQ为0.1～1.0ng/L。

表4 16种亚硝胺物质的线性范围、相关系数、检出限及定量限

3.2方法回收率及精密度

通过在空白水样中添加4个不同浓度的亚硝胺混标，做6次平行。由表5结果可知，方 法对于不同物质的回收率在72.4％～114.8％之间，相对标准偏差(RSD，n＝6)在0.8％～9.5％ 之间。

与已报道的水中亚硝胺的检测方法相比(表6)，本文建立的方法涵盖亚硝胺物质数量多 (16种)、检出限低(0.05～0.5ng/L)、回收率较好，更为关键的是通过采用高分辨质谱检测， 各物质定性和定量离子质量误差均小于1.839ppm，保证了数据的稳定性和可靠性，且达到欧 盟EC/657/2002规定的4个确证点，因此在进行痕量亚硝胺检测时，方法能够有效排除基质 干扰，兼具较高的准确度和灵敏度。

表5 16种亚硝胺的回收率及精密度

表6与现有水中亚硝胺检测文献对比

3.3实际水样检测

应用本方法，对北京市内东城、海淀、朝阳、石景山、通州、大兴等不同地区的12个自 来水样进行测定(见表7)。结果检出了NMPhA、NEPhA、NMOR、NDPhA、NDBzA 5种亚 硝胺，其中NMOR只在S1(sample 1)中有检出，为0.9ng/L，低于德国限量10ng/L；而对 于检出的其它亚硝胺，目前国内外尚无限量要求，需要对其进行关注。

表7实际水样检测结果

本发明方法建立了饮用水中16种痕量亚硝胺的固相萃取-气相色谱高分辨质谱检测方法。 在优化的仪器检测条件及固相萃取条件下，16种物质的检出限(LOD)仅为0.05～0.50ng/L， 远低于目前各国的限量水平，同时高分辨质谱拥有超高的质量精度，各物质监测离子的质量 数精确至0.00001，质量误差≤1.839ppm，因此方法具有非常高的选择性和准确度，适用于 水中痕量亚硝胺的确证检测，同时也为其它痕量物质的检测提供了借鉴。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一种基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其特征在于：包括如下步骤：水样在经过样品前处理后，采用色谱柱分离，高分辨质谱全扫描模式检测，内标法定量；

所述样品前处理具体包括如下步骤：在1L水样中加入50μL的0.5mg/L内标溶液后混匀静置，Chromabond HR-P固相萃取柱依次用5mL甲醇活化，5mL水平衡，然后将水样以3mL/min左右流速过柱，上样完成后，抽干1min，用10mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，加入无水硫酸钠进行脱水，最后将上清液氮吹定量浓缩至0.5mL，供上机测定；

色谱条件如下：DB-35MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；载气高纯氦气，99.999％；进样体积1μL；脉冲不分流进样，脉冲压力200kPa，脉冲时间1min；载气流速2.0mL/min；进样口温度250℃，传输线温度250℃；程序升温：初始温度为40℃，保持1min后以15℃/min速率升至270℃，保持5min；

所述亚硝胺为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二异丙胺、N-亚硝基二丙胺、N-亚硝基-N-甲基苯胺、N-亚硝基二异丁胺、N-亚硝基-N-乙基苯胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基二苯胺、N-亚硝基二环己基胺、N-亚硝基-N.N(3.5.5-三甲基己基)胺和N-亚硝基二苄基胺。

2.根据权利要求1所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其特征在于：质谱条件如下：分辨率60000FWHM，200m/z；EI电离源，离子源温度280℃；溶剂延迟3min；全扫描模式，扫描范围40～300m/z。

3.根据权利要求2所述的基于高分辨率质谱的水中亚硝胺高灵敏测定方法，其特征在于：16种亚硝胺及2种内标的定性和定量离子见表1：

表1 16种亚硝胺物质和两种内标物的保留时间、定量和定性离子

^a表示以NDMA-d₆为内标进行定量；^b表示以NDPA-d₁₄为内标进行定量；NA^c表示数据未提供。

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