CN103235141A

CN103235141A - Atf3用于预测膀胱癌转移和判断预后的应用

Info

Publication number: CN103235141A
Application number: CN2013101518390A
Authority: CN
Inventors: 沈立松; 许大康; 袁向亮
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明涉及ATF3蛋白在制备用于检测或判断膀胱癌转移以及膀胱癌预后判断的试剂盒中的应用。本发明还提供一种用于检测或判断膀胱癌转移以及膀胱癌预后判断的试剂盒。本发明优点在于：本发明提供一种新的用于预测膀胱癌患者转移以及判断预后的蛋白标志物，通过免疫组化检测方法，可用于检测或判断膀胱癌侵袭和转移程度以及判断预后；提供一种新的用于预测膀胱癌患者转移以及判断预后的试剂盒；提供ATF3蛋白的用于抑制膀胱癌转移和提高膀胱癌患者的预后生存期的新用途。

Description

ATF3用于预测膀胱癌转移和判断预后的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和诊断领域，具体地说，是ATF3用于预测膀胱癌转移和判断预后的应用。

背景技术

膀胱癌是人类泌尿生殖***常见的恶性肿瘤(Siegel et al., 2013)，在中国，膀胱癌发病率有增高趋势，位居男性泌尿生殖***肿瘤的首位。侵袭和转移是导致***患者治疗失败和死亡的最主要原因。但目前膀胱癌转移的确切机制尚未明确，临床上缺少判断膀胱癌转移的蛋白标志物。

转录激活因子3（ATF3）是一个应激反应诱导基因，该基因位于染色体lq32.3，编码181个氨基酸的DNA结合蛋白(Liang et al., 1996)。ATF3基因含4个外显子A、B、C、E，为含亮氨酸拉链结构的转录因子。ATF3参与细胞适应内外环境变化的应激反应。ATF3可根据靶基因和细胞环境的不同，激活或抑制相关基因表达，具有广泛的转录调节作用，同时还参与机体稳态维持、创伤愈合、细胞黏附、凋亡以及信号传导等生理和病理过程(Thompson et al., 2009)。

ATF3在肿瘤的发生发展和侵袭转移过程中也具有重要作用。ATF3在不同的细胞类型或同一细胞的不同状态下可能发挥不同甚至相反的作用。它既可以作为致癌基因，也可以作为抑癌基因发挥作用。已有研究显示，在乳腺癌、***癌、鳞状上皮细胞癌等肿瘤细胞中，ATF3的高表达可促进肿瘤细胞的生长和侵袭(Yin et al., 2008; Yin et al., 2010)。而在***以及结肠癌等肿瘤细胞中ATF3低表达，诱导其过表达后可抑制肿瘤细胞的生长和体内成瘤能力(Hackl et al., 2010)。ATF3在膀胱癌中的表达和功能研究尚未知。

目前膀胱癌的诊断主要依靠膀胱镜，尿液等检查方法，然而这些检测方法均具有一定的局限性。例如因取材有限而有较高的假阴性率，并且无法判断肿瘤的转移情况以及预后情况。寻找有效的判断癌症转移等严重程度的检测方法一直是研究的重点。然而，目前现有的针对癌症检测尚缺乏令人满意的蛋白标志物，更缺乏可用于检测或判断膀胱癌转移情况的标志物。

因此，本领域迫切需要开发可用于检测或判断膀胱癌转移以及判断预后的相对特异蛋白标志物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供ATF3蛋白在制备用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒中的应用。

本发明的第二个的目的是，提供ATF3蛋白在制备用于膀胱癌预后判断的试剂盒中的应用。

本发明的第三个的目的是，提供一种用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒。

本发明的第四个的目的是，提供一种用于膀胱癌预后判断的试剂盒。

本发明的第五个的目的是，提供一种ATF3蛋白在制备抑制膀胱癌转移的药物中的应用。

本发明的第六个的目的是，提供一种ATF3蛋白在制备提高膀胱癌患者的预后生存期的药物中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：ATF3蛋白在制备用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒中的应用。

所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况，所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌的侵润转移程度呈负相关。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：ATF3蛋白在制备用于膀胱癌预后判断的试剂盒中的应用。

所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况，所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌患者的预后生存期呈正相关。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况。

所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌的侵润转移程度呈负相关。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于膀胱癌预后判断的试剂盒，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况。

所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌患者的预后生存期呈正相关。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：ATF3蛋白在制备抑制膀胱癌转移的药物中的应用。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：ATF3蛋白在制备提高膀胱癌患者的预后生存期的药物中的应用。

本发明优点在于：

1.本发明提供一种新的用于预测膀胱癌患者转移以及判断预后的蛋白标志物，通过免疫组化检测方法，可用于检测或判断膀胱癌侵袭和转移程度以及判断预后；

2、提供一种新的用于预测膀胱癌患者转移以及判断预后的试剂盒；

3、提供ATF3蛋白的用于抑制膀胱癌转移和提高膀胱癌患者的预后生存期的新用途。

附图说明

图1 显示了ATF3在正常膀胱基层和粘膜表面细胞相对高表达，而膀胱癌组织呈全层相对低表达（A），统计数据显示进展期膀胱癌的表达强度低于原位癌和良性膀胱疾病（B）。

图2 显示WB证实同一病例中膀胱癌组织中ATF3蛋白和基因表达水平均显著低于癌旁组织（A）。Real-time PCR结果也证实ATF3在膀胱癌组织中相对低表达（B）。

图3 显示侵润程度高（侵润全层或发生远处转移）的临床膀胱癌病例ATF3表达水平较低或缺失表达，而没有发生侵润转移膀胱癌（限于表层）ATF3表达相对较高，ATF3随膀胱癌的侵袭程度增强呈低表达（A）。统计数据显示ATF3表达与侵润转移程度呈负相关（B）。

图4 利用不同转移潜能的膀胱癌细胞株进行功能研究，在低转移性膀胱癌细胞株（T24）中沉默表达ATF3后，划痕实验显示可明显加快膀胱癌细胞的愈合时间（A）。Transwell侵袭实验证实ATF3沉默表达可增强膀胱癌细胞的迁移能力（B）。体内动物转移模型进一步证实，降低ATF3表达后，膀胱癌细胞肺转移的发生率和转移结节数均显著增高（C）。

图5 患者生存曲线显示低表达ATF3的膀胱癌病例生存期相对缩短。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1.标本：临床膀胱癌患者新鲜切除组织样本

2.抗体：Anti-ATF3抗体（HPA001562），兔抗人多克隆抗体，购自Sigma Aldrich（美国）。

3.免疫组化方法：

临床膀胱癌患者新鲜切除的组织样本制备石蜡切片，石蜡切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡至水，PBS洗涤。每张切片加入50 μl 0.3% H₂O₂，阻断内源性过氧化物酶活性。切片放入抗原修复液中（Tris-EDTA, pH9.0），微波30 min。切片平衡至室温后加入50 μl封闭血清，10 min后吸去多余血清，再加入50 μl兔抗人ATF3抗体，或PBS代替一抗排除假阳性，4 oC过夜后加入生物素标记的抗兔二抗，室温10 min。PBS洗涤后加入50 μl链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温10 min。DAB显色，显微镜下观察3～10 min。自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，中性树胶封片。与膀胱癌相邻的连续组织切片用来进行苏木素-伊红（HE）染色。

4.免疫组化结果判定及分级标准

免疫组化观察结果采用双盲法。用已知的阳性片作为阳性对照，每组均用PBS代替一抗作阴性对照。标本中阳性细胞百分比及染色强度进行综合评分，阳性细胞百分比为5个高倍镜（10 × 40）随机视野的阳性细胞百分比：着色强度以多数细胞的染色情况记分，以半定量评分。ATF3蛋白阳性着色定位于细胞质和细胞核，为棕黄色或棕褐色。先按染色强度打分：0分为无色、1分为弱（浅黄色）、2分为中（棕黄色），3分为强（棕褐色）。再按阳性细胞百分比（%）打分：0分为阴性，1分为阳性细胞 ≤ 10%，2分为阳性细胞11%～50%，3分为阳性细胞51%～80%，4分为阳性细胞 > 80%（见表1）。最后按标本中阳性细胞百份比及染色强度进行综合评分，每张切片分别从上下左右及中间观察5个不连续的高倍视野，均值为该切片的积分值。每例最后得分为染色强度与阳性细胞百分比的乘积（A × B）：0分为（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。结果判断在双盲下进行，每张切片由两名高年资病理科医生分别计数。

表1. 免疫组化判定分级标准

5.统计学分析

应用Graphpad Prism软件制作数据统计分析。对各组数据首先进行正态性检验，正态分布数据以Mean±SD表示，组间各变量的差别用单参数方差分析和t检验。P < 0.05 为显著性界限。

6.结论

请参照附图1-5，本发明经过广泛而深入的研究，首次发现ATF3是一种新的膀胱癌转移抑制基因。ATF3在正常膀胱上皮细胞中高表达而在膀胱癌组织中下调表达，与膀胱癌的侵润转移程度呈负相关。体内体外功能研究表明ATF3的表达对膀胱癌细胞增殖无影响，但可明显抑制膀胱癌的转移。显示ATF3蛋白可作为抑制膀胱癌转移提高膀胱癌患者的预后生存期的药物。此外，患者生存曲线显示，低表达ATF3的病例生存期明显缩短。因此，ATF3低表达可以作为检测膀胱癌转移和膀胱癌预后的判断标志物。

实施例2

一种用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况。检测方法参照实施例1。所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌的侵润转移程度呈负相关。即，低表达ATF3的膀胱癌患者转移可能性大。

实施例3

一种用于膀胱癌预后判断的试剂盒，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况。检测方法参照实施例1。所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌患者的预后生存期呈正相关。即，ATF3低表达膀胱癌患者预后生存期相对短于高表达ATF3的膀胱癌患者。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.ATF3蛋白在制备用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况，所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌的侵润转移程度呈负相关。

3.ATF3蛋白在制备用于膀胱癌预后判断的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况，所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌患者的预后生存期呈正相关。

5.一种用于检测或判断膀胱癌转移的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌的侵润转移程度呈负相关。

7.一种用于膀胱癌预后判断的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是通过免疫组化技术检测膀胱癌患者的手术切除组织切片，检测ATF3蛋白的表达情况。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的ATF3蛋白的表达与膀胱癌患者的预后生存期呈正相关。

9.ATF3蛋白在制备抑制膀胱癌转移的药物中的应用。

10.ATF3蛋白在制备提高膀胱癌患者的预后生存期的药物中的应用。