CN109696547B

CN109696547B - 一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用

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Publication number: CN109696547B
Application number: CN201710999399.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡剑平; 李瑾
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2037-10-23
Also published as: CN109696547A

Abstract

本发明涉及一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用，属于医学生物技术和医学检验技术领域。MutT相关蛋白作为结直肠癌患者预后的生物标志物的应用。本发明的MutT相关蛋白可以有效区分结直肠癌病人术后生存期，从而为结直肠癌预后诊断提供了新途径，为临床医生对于结直肠癌病情分析提供了参考依据。

Description

一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用，属于医学生物技术和医学检验技术领域。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是由于结肠粘膜上皮在环境和遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性癌变，是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界范围内，发病率居于恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位，每年约有120万新发病例，严重威胁人类健康。结直肠癌在亚洲发病率较高，尤其是中国，主要与年龄、家族史、不健康的饮食及生活***，提高存活率，是当前研究的热点和难点。

MTH1(MutT homolog 1)又称为NUDT1(nudix hydrolase 1)，MTH2(MutT homolog2)又称为NUDT15(nudix hydrolase 15)，MTH3(MutT homolog 3)又称为NUDT18 (nudixhydrolase 18)，NUDT5(nudix hydrolase 5)，这四种蛋白均属于哺乳动物Nudix水解酶超家族。这些蛋白与大肠杆菌MutT蛋白具有结构和功能上相似性，又被称为MutT相关蛋白。

在本发明中，我们检测结直肠癌组织(CRC)和癌旁组织中MutT相关蛋白 ——MTH1，MTH2，MTH3，NUDT5的表达，分析这几种蛋白表达量与临床病理资料 (如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性，探究这些蛋白对结直肠癌根治术后患者的总体生存预后判断价值。

发明内容

本发明是基于本发明人的以下发现作出的：

无论在正常代谢活动中还是在外源性刺激下，细胞会产生大量的ROS，可以损伤DNA，RNA和游离核苷酸。鸟嘌呤因具有最低氧化电势，其氧化产物8-oxoG 是细胞内含量最丰富的氧化碱基。含有8-oxoG的核苷酸可以掺入DNA或RNA中，由于8-oxoG以同等效率与A和C配对，故引起复制水平和转录水平错配。

在大肠杆菌(E.coli)中发现的MutT蛋白具有水解8-oxodGTP和8-oxoGTP 为单磷酸的能力。哺乳动物细胞中拥有更为精密的参与核苷酸前体池中氧化核苷酸的清除机制，在哺乳动物细胞中发现的MTH1，MTH2，NUDT5和MTH3等均为MutT 的同源蛋白。这些蛋白的底物特异性存在差异，MTH1可以降解8-oxodGTP和 8-oxoGTP，但是不能作用于8-oxodGDP和8-oxoGDP；MTH2可以降解8-oxodGTP， 8-oxoGTP，8-oxodGDP和8-oxoGDP，但是活性很弱；MTH3可以降解8-oxodGDP和 8-oxoGDP，但是不能作用于8-oxodGTP和8-oxoGTP；NUDT5除了具有水解 8-oxo-dGDP的活性以外，还拥有更广的底物特异性，它还能水解8-oxo-dADP、 2-oxo-dADP、5-CHO-dUDP。

我们首次发现MTH2，MTH3和NUDT5蛋白在CRC组织中表达量增高，并与CRC 进展和预后有关。

MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白表达量与结直肠癌AJCC分期和***转移有关。MTH1，MTH2，NUDT5高表达组的CRC患者进行手术治疗后总的生存率更低，这四种蛋白均高表达的患者术后生存率最差。因此，MutT相关蛋白可以作为判断结直肠癌患者预后的新型标志物。同时，多因素分析表明NUDT5蛋白是影响CRC 患者预后的独立因素。

本发明的一个方面，提供MutT相关蛋白作为结直肠癌患者预后的生物标志物的应用。

所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白，MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。

优选的，所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白，MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。

上述任一种蛋白的表达量均能用于检测结直肠癌的存在，优选测定多种蛋白的表达量。

本发明的第二个方面，提供MutT相关蛋白在制备检测、预测或诊断结直肠癌的进展和/或预后产品中的应用。

所述的产品是指诊断或预测结直肠癌转移、结直肠癌临床分期、结直肠癌患者预后的产品。所述产品包括但不限于化学试剂、生物试剂、诊断试剂盒、胶体金试纸、蛋白质芯片、单克隆抗体、多克隆抗体等。

所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白，MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。

作为检验主体的“个体”可以是任何的人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、伴侣动物(例如犬、猫)和圈养野生动物(例如鹿)。

优选地，哺乳动物是人。

本发明的检测产品以及使用这些产品的检测方法，可以对任何适合的生物样品进行。为此目的，样品可是是生物材料的任何样品，其源自动物，如但不限于细胞材料、生物流体(例如血液)、粪便、组织活组织检查标本、手术标本或已经导入动物身体中并且随后取出的流体(例如，从灌肠洗液抽回的溶液)。根据本发明方法检验的样品可以直接进行检验或可能在检验之前需要某种形式的处理。例如，活组织检查样品或手术样品可能在检验之前需要匀浆或它可能需要切片用于原位检验各个基因的定性表达水平。另外，如果生物样品不处于液体形式，可能需要添加试剂，如缓冲液，以便使样品移动。

本发明的第三个方面，提供了一种人结肠癌新型生物标志物MutT相关蛋白用于制备诊断、预测、检测或筛查人结直肠癌的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人结直肠癌的试剂盒。本发明的人结肠癌蛋白质标志物MutT相关蛋白还可以用于制备诊断、预测、检测或筛查人结直肠癌癌细胞扩散、*** 转移、临床分期、患者预后的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人结直肠癌癌细胞扩散、结直肠癌淋已结转移、结直肠癌临床分期、结直肠癌患者预后的诊断试剂。

一种检测结直肠癌的进展/和或预后的试剂盒，所述的试剂盒中含有检测 MutT相关蛋白表达量的试剂。

所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白、MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或多种。其中任意一种蛋白的表达量均可以用于诊断结直肠癌的存在。

所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白和NUDT5蛋白。该组蛋白的表达量可用于预测结直肠癌的预后。

所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白、MTH3蛋白和NUDT5。该组蛋白的表达量可用于预测结直肠癌的预后。

所述试剂为抗体，为单克隆抗体和/或多克隆抗体。所述蛋白抗体可以是商业来源的抗体或依照本领域常规操作制备得到的相应蛋白的抗体。

有益效果：本发明的MutT相关蛋白可以有效区分结直肠癌病人术后生存期，从而为结直肠癌预后诊断提供了新途径，为临床医生对于结直肠癌病情分析提供了参考依据。本发明产品和使用该产品的检测方法可以用于疾病风险的诊断、预后、分类、预测、检测疾病复发、选择疗法和疗程监测。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细说明，以使本发明公开的各个方面及其优势显而易见，从而更容易被理解，并非对本发明的限制。凡依照本公开内容进行的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为结直肠癌组织和配对癌旁组织中MutT相关蛋白的表达，图1A是6对结直肠癌组织和配对癌旁组织中4种MutT相关蛋白表达的代表性Western blotting条带，图1B-1E是分别为20对结直肠癌组织和配对癌旁组织中MTH1、 MTH2、MTH3和NUDT5蛋白表达的定量结果，统计方法为Student’s t-test。

图2为结直肠癌组织和配对癌旁组织中MutT相关蛋白免疫组化代表图；图 2A-2D分别代表正常癌旁组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5蛋白的表达，图2E-2H 分别代表结直肠癌组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5蛋白的低表达，图2I-2L分别代表结直肠癌组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5蛋白的高表达。

图3为Kaplan-Meier生存曲线；图3A是MTH1蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线，图3B是MTH2蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线，图3C是MTH3蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线，图3D是NUDT5蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线，图3E是联合四种蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线。

具体实施方式

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

一.材料与方法

1.实验材料

(1)44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织(佳木斯大学附属第一医院提供)

(2)结肠癌组织芯片——87例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在结直肠癌根治术前未经过放疗和化疗

(3)抗-MTH1抗体(Abcam)、抗-MTH3抗体(Abcam)、抗-NUDT5抗体 (Abcam)，抗-MTH2抗体(Abclonal)、抗-GAPDH抗体(Abcam)

2.实验方法

(1)通过Western Blotting检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量，分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性。具体步骤如下：

①液氮研磨组织后加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，其中RIPA 裂解液中含有1X PMSF(索莱宝)和1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂(CST， USA)，冰上放置30min，4℃12000g离心20min，取上清转移到新的 1.5mlEP管中。

②BCA法(Thermo fisher，USA)测定总蛋白浓度。

③12％SDS-PAGE电泳，检测GAPDH表达的上样量为10ug，检测MTH1 和NUDT5表达的上样量为20ug，检测MTH2和MTH3表达的上样量为 40ug。

④转膜，将PAGE中的蛋白电转移到PVDF膜上(Millipore，USA)。

⑤免疫封闭，使用5％脱脂牛奶封闭2h。

⑥一抗孵育，抗-MTH1抗体、抗-MTH3抗体、抗-NUDT5抗体和抗-MTH2 抗体的稀释比例为1∶1000，抗-GAPDH抗体稀释比例为1∶2000，4℃ 过夜，TBST洗5次，每次5min。

⑦二抗孵育，山羊抗兔IgG-HRP(碧云天生物技术有限公司，1∶2000)或山羊抗鼠IgG-HRP(碧云天，1∶2000)，室温孵育2h，TBST洗5次，每次 5min。

⑧曝光，将显示液(Millipore，USA)1∶1混合后均匀滴加到条带上，进行曝光显色。

⑨使用Image J对结果进行定量，使用Student’s t-test对结直肠癌组织和癌旁组织中这四种蛋白的表达进行统计学分析。

(2)通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中 MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量，根据染色的程度和染色面积，将癌组织分为高表达组和低表达组，分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性，探究这些蛋白对结直肠癌根治术后患者的总体生存预后判断价值。具体步骤如下：

①组织芯片使用二甲苯脱蜡2d，100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化各 2min，PBS水化10min。

②抗原修复(pH6.0柠檬酸修复液)微波修复30min，冷却至室温。

③山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。

④一抗孵育，抗-MTH1抗体、抗-MTH2抗体、抗-MTH3抗体和抗-NUDT5 抗体的稀释比例分别为1∶300、1∶100、1∶500和1∶1000，4℃过夜， PBS洗5min X 3次。

⑤二抗孵育，使用PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物或PV-6002山羊抗鼠 IgG/HRP聚合物(中衫金桥)，室温孵育20分钟，PBS洗5min X 3次。

⑥DAB(中衫金桥)显色

⑦苏木素复染、梯度脱水、透明封片。

3.组织芯片中MutT相关蛋白表达高低评分标准：

(1)染色强度：0(无)；1(弱)；2(中)；3(强)

(2)染色面积：0(0％)；1(1-25％)；2(26-50％)；3(51-75％)；4(76-100％)；

(3)最终得分是染色强度X染色面积：低表达(0-6)；高表达(7-12)

4.统计方法

软件SPSS statistics version 19.

(1)Student’s t-test比较两组均值；

(2)Pearson’X2或者Fisher’s exact test比较MutT相关蛋白与CRC临床病理资料相关性；

(3)Kaplan-Meier analysis计算总的生存率(OS)，the log-rank test比较两组OS；

(4)Cox proportional hazards models明确CRC临床病理参数和MutT相关蛋白表达对CRC病人生存率和预后的影响，所有参数先进行单因素分析，具有显著意义的参数再进行多因素分析。

二.实验结果

1.结直肠癌组织中MutT相关蛋白表达量增加

(1)我们首先进行Western blotting检测20对人结直肠癌组织和配对癌旁正常组织中MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白表达，结果表明癌组织中这四种蛋白表达均显著高于正常组织(Student’st-test，P＜0.001，图1)。

(2)我们然后进行免疫组化检测组织芯片(87对人结直肠癌组织和配对癌旁组织)中MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白表达，再次证明癌组织中这四种蛋白表达上调(图2)。癌旁正常组织这四种蛋白免疫染色很弱，癌组织这四种蛋白染色程度不同，有弱，中，强。根据癌组织免疫染色的强度和范围，87个癌组织中MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白高表达分别有54，49，45和42 个。

2.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性

(1)根据MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白免疫组化染色结果，分别将组织芯片中87个人结直肠癌组织分为高表达组和低表达组，应用Pearson’X2 or Fisher’s exact test分析这些蛋白表达与年龄，性别，位置，肿瘤大小，AJCC分期，T分期，N分期，M分期，分化程度，脉管转移的相关性，结果表明这些蛋白表达量与AJCC分期和N分期(***转移)显著相关(P＜0.05，表1)。

表1.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(免疫组化，n＝87)

^aChi-square test

^bFisher′s exact test

^*P＜0.05

(2)Western blotting检测44例人结直肠组织中MTH1，MTH2，MTH3和 NUDT5蛋白的相对表达，应用Student’s t-test分析这些蛋白表达与CRC临床病理相关性，结果表明这些蛋白表达量与AJCC分期，T分期(肿瘤浸润程度)和 N分期(***转移)显著相关(P＜0.05，表2)。

表2.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(Western Blotting，n＝44)

^*P＜0.05

3.MutT相关蛋白表达对结直肠癌患者预后影响

(1)根据MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白免疫组化染色结果，分别将组织芯片中87个人结直肠癌组织分为高表达组和低表达组，应用Kaplan-Meier analysis计算CRC患者进行手术治疗后总的生存率(OS)，同时使用log-rank test 比较高表达组和低表达组的OS，结果表明MTH1、MTH2、NUDT5高表达组生存率更低(P＝0.005，0.021，0.003)，MTH3高表达组和低表达组生存率无显著性差异(P＝0.089)。另外，考虑到癌组织中这四种蛋白共表达，将87个癌组织分为三组：第一组，四种蛋白均低表达；第二组，一种或二种或三种蛋白高表达；第三组，四种蛋白均高表达。第三组生存率最低，其次是第二组(P＝0.005)。(图 3)

(2)如表3所示，应用Cox proportional hazards model对CRC临床病理资料和MTH1，MTH2，MTH3和NUDT5蛋白水平进行单因素分析，结果表明以下因素影响CRC病人的生存率：AJCC分期(P＜0.001)，N分期(P＝0.001)， M分期(P＝0.006)，分化程度(P＝0.003)，MTH1表达量(P＝0.008)，MTH2 表达量(P＝0.026)，NUDT5表达量(P＝0.005)。然后，进行多因素分析发现NUDT5 表达量是影响CRC患者预后的独立因素(HR 2.282；95％CI 1.152-4.517， P＝0.018)。

表3.Cox单因素分析和多因素分析

^*P＜0.05

三.结论

本研究，我们首次发现MTH2，MTH3和NUDT5蛋白在CRC组织中表达量增高，并与CRC进展和预后有关。

实施例2.检测结直肠癌进展和预后的试剂盒

一.试剂盒组成

1.抗-MTH1抗体(Abcam)

2.抗-MTH2抗体(Abclonal)

3.抗-MTH3抗体(Abcam)

4.抗-NUDT5抗体(Abcam)

二.使用方法

参见实施例1“通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量”或“通过Western Blotting 检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5 的表达量”。

实施例3.检测结直肠癌预后的试剂盒

一.试剂盒组成

1.抗-MTH1抗体(Abcam)

2.抗-MTH2抗体(Abclonal)

3.抗-NUDT5抗体(Abcam)

二.使用方法

Claims

1.MutT相关蛋白在制备检测、预测或诊断结直肠癌的产品中的应用，所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白，MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的产品为诊断或预测结直肠癌转移、结直肠癌临床分期、结直肠癌患者预后的产品；所述产品为化学试剂、生物试剂、诊断试剂盒、胶体金试纸或蛋白质芯片。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物试剂为单克隆抗体或多克隆抗体。

4.一种检测结直肠癌预后和/或进展的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中含有检测MutT相关蛋白表达量的试剂，所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白、MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或多种；或所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白和NUDT5蛋白；或所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白、MTH3蛋白和NUDT5蛋白。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂为抗体，为单克隆抗体和/或多克隆抗体。