CN105891477A - 基于微球的杯式时间分辨荧光mpo分析方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒；包括在检测反应杯内表面包被MPO单抗或多抗；将时间分辨荧光微球与MPO单抗或多抗共价键交联制备得到荧光标记抗体；将待测MPO样品加入包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号；将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。本发明可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有效的提高了检测灵敏度。

Description

基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及MPO检测技术领域，具体涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒。

背景技术

心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。2009年8月拜耳医药在欧洲心脏病学会年会上报道指出2005年全球约有1750万人死于心血管疾病，预计2015年这一数字将攀升到2000万人，大约有一半病例发生在亚太地区。生活条件的改善和生活方式的转变，使中国人发生心血管疾病的风险迅速赶超美国等发达国家。

我国1990年城市居民心血管疾病死亡率为92/10万人，2000年为106/10万人，平均每年死亡增长率为1.3％。2008年死亡率已达到121/10万人，相比2000年时，平均死亡增长率为1.4％，其中急性心肌梗塞的死亡率占到其中的三分之一，说明心肌梗塞死亡率仍呈不断增长趋势。随着中国人口老龄化趋势，按平均死亡增长率为1.5％计算，到2015年，血管疾病死亡率将达到141/10万人，急性心肌梗塞的死亡率将达到47/10万人。

中国***2008年公布的急性心肌梗塞的死亡率为39.72/10万人，每年急性心肌梗塞的发病人数超过500万人，至少有超过200万的人群去医院就医进行心肌梗塞疾病的相关检测，这并不包含每年因胸痛怀疑为心肌梗塞的病人人数，实际医院每年检测人数已达千万人次。

心肌梗塞的典型临床症状是胸痛，心律失常，心力衰竭等。但实际临床上胸痛的症状表现复杂多样，危险性差异也较大，还有心梗病人无典型症状。医学上将急性心肌梗死发病后6小时以内作为抢救的“黄金时间”，超过这个时间段，治疗效果就会大打折扣，甚至产生严重后果危及生命。中华医学检验分会2006年制定的“冠状动脉疾病和心力衰竭时心脏标志物临床检测应用建议”指出，适用于临床的心脏标记物应具有较好的诊断、危险分层和预后估计的价值，分析检测方法应特异、灵敏、快速，而且心脏标志物的检测周转时间＜60min。

髓过氧化物酶(MPO)与冠状动脉疾病密切相关。冠心病是心血管***中最常见的疾病，而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。AS发病过程中通常出现氧化低密度脂蛋白，进而巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞，泡沫细胞的形成在AS的发生机制中起关键作用。协和洛克研究发现MPO有促进AS病变形成的作用，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速AS进展，进而引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。

MPO促进ACS病变形成，并影响粥样斑块的稳定性，通过增大氧化应激而引起ACS。研究表明，MPO是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子，特别是在肌钙蛋白T(TnT)水平较低的患者，MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者。

传统上MPO多用化学发光法及胶体金免疫层析法或者荧光免疫层析法等方法测定。化学发光法对技术要求高，操作步骤相对比较繁琐，需要多步试剂添加过程。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样品中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅甚至无显色，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。荧光免疫层析法虽然灵敏度比胶体金免疫层析法要高，但是其检测精密度并不理想，灵敏度与大型化学发光或者电化学发光仪器仍有差距。

时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。

目前市面上采用时间分辨荧光检测的试剂均采用解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)，它采用具有双功能基团结构的螯合物，使其一段与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应后形成免疫复合物，由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，需要加入一种解离增强剂，使得铕离子从复合物上解离下来，并与增强剂中的另一种螯合剂形成胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有荧光免疫层析法测定MPO检测精密度不理想以及时间分辨荧光检测法需要解离增强过程，检测步骤繁杂、时间长、精度差等不足，提供一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒。该方法基于时间分辨荧光微球可高灵敏度定量检测MPO。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，所述方法包括如下步骤：

S1、在检测反应杯内表面包被针对MPO特定抗原识别位点的一个或多个抗体(所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体，或者多个抗体的组合形式；即，包被MPO单抗或者多抗)；

S2、将时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记抗体；

S3、将待测MPO样品加入步骤S1包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；

S4、清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号；

S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。

优选的，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。

优选的，所述镧系元素螯合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen(其中TTA为噻吩甲酰三氟丙酮(Thenoyltrifluoroacetone)，TOPO为三辛基氧化膦，Phen为邻菲咯啉)。

优选的，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100～1000nm。

优选的，所述时间分辨荧光微球为前处理后的羧基时间分辨荧光微球；所述前处理包括：加入MES、EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15～60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10～100ul 50mM氨基己酸。

更优选的，所述初次活化处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加60ul500mM MES(2-(N-***啉)乙磺酸)缓冲液pH5.0～7.0，加0.02～0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15～30min；所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加1mL100mM MES pH6.0，15000rpm离心清洗10～25min，弃去上清；加400ul 100mM MESpH5.0～7.0，超声分离，加0.02～0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0.01～0.1mgEDC，室温混匀10～20min；加1mL 100mM MES pH5.0～7.0缓冲液，15000rpm离心清洗10～25min，弃去上清；100mM MES pH5.0～7.0缓冲液恢复到1ml。

优选的，步骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后用反应缓冲液稀释到终浓度到50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤；所述每1L反应缓冲液中含有50～200mM PB，1～5％酪蛋白，0.9～3％NaCl，0.5～2％PEG，0.02～2.0％tween 20，pH6.0～9.0。更优选含有50mM PB，1％酪蛋白，0.9％NaCl，1％PEG，0.5％tween 20，pH7.2。

优选的，所述清洗采用的清洗液每1L含5～100mM PB，0.9～3％NaCl，0.02～1.0％Tween 20，pH6～9。更优选含5mM PB，0.9％NaCl，0.05％Tween 20，pH7.8。

优选的，所述标准曲线为系列浓度的MPO校准品的MPO浓度与对应的荧光信号的关系曲线；该荧光信号为采用所述基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法测得的荧光信号。

第二方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析试剂盒，所述试剂盒包括检测反应杯、荧光标记抗体和清洗液；

所述检测反应杯内表面包被MPO单抗或者多抗；

所述荧光标记抗体是由时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备而得；

所述清洗液每1L含5～100mM PB，0.9～3％NaCl，0.02～1.0％Tween 20，pH6～9。

更优选含5mM PB，0.9％NaCl，0.05％Tween 20，pH7.2。

该试剂盒的检测基础是双抗体夹心的免疫反应。

所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素化合物；较优的，该镧系元素螯合物为铕螯合物；最优的，该铕螯合物可为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。

优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100～1000nm。

第三方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)检测反应杯的制备

采用MPO单抗或者多抗采用物理吸附的方式结合在反应杯内表面；

(2)荧光标记抗体的制备

采用MPO的单抗或者多抗采用共价交联的方式与荧光微球偶联；

(3)清洗液配制

优选的，所述偶联具体为：每1ml前处理后的羧基时间分辨荧光微球中加入0.1mgMPO的单抗或者多抗，室温混匀20～40min进行偶联(即，共价键交联)。

优选的，所述前处理包括：加入MES、NHS和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15～60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10～100ul 50mM氨基己酸。

更优选的，所述初次活化处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加60ul500mM MES(2-(N-***啉)乙磺酸)缓冲液pH5.0～7.0，加0.02～0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加0.3～0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺，加纯化水至终体积300μL，室温混匀15～30min；所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加1mL 100mM MES pH6.0，15000rpm离心清洗10～25min，弃去上清；加400ul 100mM MES pH6.0，超声分离，加0.02～0.2mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0.01～0.1mgEDC，室温混匀10～20min。

优选的，所述前处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加入60ul500mMpH6.0的MES、0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，加纯化水至终体积300μL，室温混匀活化10～20min。

优选的，步骤(2)中偶联之后还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后用反应缓冲液稀释到终浓度到50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤；所述每1L反应缓冲液中含有50mM PB，1％酪蛋白，0.9％NaCl，1％PEG，0.5％tween 20，pH7.2。

第四方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析试剂盒的使用方法，包括将待测MPO样品加入检测反应杯中，然后加入荧光标记抗体，37℃温育，用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试反应杯中荧光信号，检测波长为600～630nm。

本发明的方法将待测样品中的抗原抗体反应信息转化成了另一种更为直观的光信号信息(荧光信号)，利用该方法，经过一系列的研究工作，可以获得光子信号(荧光信号)与待测抗原之间的对应关系，进而制作标准曲线，再通过对光子信号与标准曲线的比对或者与阴阳性参考光子信号的比较检测最终获得待测抗原的定量或者定性检测结果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)荧光标记物为时间分辨荧光乳胶微球，每个微球中填充了几万到几十万个稀土元素离子螯合物，检测过程中并不需要解离增强过程，便可发出很强的荧光，简化了时间分辨荧光检测步骤，解离增强时间分辨荧光检测往往需要1个小时左右时间才能得到检测结果，而采用时间分辨荧光微球作为标记物，由于每个微球中填充了大量的镧系元素螯合物，荧光信号放大数千倍以上，因此可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有效的提高了检测灵敏度。

2)荧光微粒活化过程中添加氨基己酸作为手臂，使得抗体与微球之间的距离增加，有效的降低了空间位阻效应，提高了检测***灵敏度。

3)荧光免疫层析法，其特点检测时间短，但其精密度不理想，受环境温度影响较大，且要手工操作，本发明采用基于微球的杯式时间分辨荧光分析，由于其超高的灵敏度，其检测时间并不比层析长，一方面易于实现自动化操作，另一方面反应温度均一，不受环境因素影响，准确性更好，精密度也优于层析试剂。

附图说明

图1为本发明的原理示意图；

图2为MPO检测标准曲线；

其中，1为荧光标记抗体，2为MPO抗原，3为包被抗体，4为反应杯固相表面，5为发光免疫复合物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

本发明的原理示意图如图1所示，包被抗体3结合在反应杯固相表面4上，在反应杯中添加一定量的样品使得样品中的MPO抗原2与反应杯固相表面结合的抗体3结合，再加入荧光标记抗体1，温育形成发光免疫复合物5，采用清洗液清洗反应杯后去除未结合的抗原及荧光标记抗体，检测反应杯中的荧光信号，与标准曲线进行对比，得到待测样本中MPO抗原浓度。

实施例1

1、检测反应杯的制备

(1)检测反应杯包被

将MPO抗体1703(Medix公司)用0.2M磷酸缓冲液(pH7.8)稀释成10μg/ml，200μL/孔，37℃包被2小时，洗板。

(2)检测反应杯封闭

用封闭缓冲液按300μL/孔加入反应杯，37℃封闭2小时，弃去包被反应杯中的封闭液，拍干。

(3)检测反应杯干燥

将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30％的37℃干燥箱中烘干4小时，密封干燥保存。

2、荧光标记抗体的制备

(1)荧光微粒前处理

取1mg羧基时间分辨荧光微球(300nm，0.1ml，10mg/mL，Bangslab公司)，加60ul 500mM MES(2-(N-***啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15min。加100ul 50mM氨基己酸，室温混匀30min。加1mL 100mM MES pH6.0，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清。加400ul 100mM MES pH6.0，超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0.1mgEDC，室温混匀15min。加1mL 100mMMES pH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清。100mM MES pH6.0缓冲液恢复到1ml。

(2)抗体交联

加0.1mg MPO单克隆抗体1701(Medix公司)，室温25℃混匀30min。

(3)封闭

加BSA封闭液，至终浓度10mg/mL BSA，室温25℃混匀过夜。

(4)清洗

加3mL交联缓冲液(100mM MES pH6.0)，25000rpm离心清洗30min，弃去上清。加500ul交联缓冲液(100mM MES pH6.0)，超声分离，终浓度2mg/ml。

(5)工作用荧光标记抗体配制

配制反应缓冲液：缓冲液1L中含有50mM PB，1％酪蛋白，0.9％NaCl，1％PEG，0.5％tween 20，pH7.2。

用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体。

3、清洗液的配制

配制清洗缓冲液，含5mM PB，0.9％NaCl，0.05％Tween 20，pH7.8。

4、MPO检测

(1)标准曲线制备

采用上述方法制备的试剂组合成MPO时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准品，每个浓度重复10次。

每个检测中加入校准品10μL，荧光标记抗体50μL，37℃温育20min，然后清洗检测杯，在PerkinElmer公司的Victor X4荧光读数仪上进行读数，标准曲线数据如表1所示，标准曲线如图2所示。

由图2的标准曲线我们可以看到，该标准曲线线性良好，可以通过该标准曲线对样本中所含的MPO浓度进行定量分析。

通过表1结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密度均小于10％(除0值以外)，且试剂灵敏度良好，在0.1ng/ml水平与0值校准品有显著区分。

表1 MPO定量检测标准曲线数据

(2)样本测试

采用上述方法制备的试剂组合成MPO时间分辨荧光定量试剂盒，测定高低浓度质控品，每个浓度做10次。

每个检测中加入样品10μL，荧光标记抗体50μL，37℃温育20min，然后清洗检测杯，在PerkinElmer公司的Victor X4荧光读数仪上进行读数，将测试结果带入图2标准曲线，计算样品测试浓度，测试结果如表2所示，检测结果显示试剂精密度良好。

表2质控品测试结果

实施例2

(1)检测反应杯包被

将MPO抗体1703(Medix公司)用0.2M磷酸缓冲液(pH7.8)稀释成10μg/ml，200μL/孔，37℃包被2小时，洗板。

(2)检测反应杯封闭

用封闭缓冲液按300μL/孔加入反应杯，37℃封闭2小时，弃去包被反应杯中的封闭液，拍干。

(3)检测反应杯干燥

将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30％的37℃干燥箱中烘干4小时，密封干燥保存。

2、荧光标记抗体的制备

(1)荧光微粒前处理

取1mg羧基时间分辨荧光微球(300nm，0.1ml，10mg/mL，Bangslab公司)，加60ul 500mM MES(2-(N-***啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，40μL，10mg/mL)，加纯化水至终体积400μL，室温23℃混匀15min。加1mL 100mMMES pH6.0缓冲液，15000rpm离心清洗20min，弃去上清，100mM MES pH6.0缓冲液恢复到1ml。

(2)抗体交联

加0.1mg MPO单克隆抗体1701(Medix公司)，室温25℃混匀30min。

(3)封闭

加BSA封闭液，至终浓度10mg/mL BSA，室温25℃混匀过夜。

(4)清洗

加3mL交联缓冲液(100mM MES pH6.0)，25000rpm离心清洗30min，弃去上清。加500ul交联缓冲液(100mM MES pH6.0)，超声分离，终浓度2mg/ml。

(5)工作用荧光标记抗体配制

配制反应缓冲液：缓冲液1L中含有50mM PB，1％酪蛋白，0.9％NaCl，1％PEG，0.5％tween 20，pH7.2。

用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体。

3、清洗液的配制

配制清洗缓冲液，含5mM PB，0.9％NaCl，0.05％Tween 20，pH7.8。

4、校准品测试

采用上述方法制备的试剂组合成MPO时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准品，每个浓度重复10次。

每个检测中加入校准品10μL，荧光标记抗体50μL，37℃温育20min，然后清洗检测杯，在PerkinElmer公司的Victor X4荧光读数仪上进行读数。

通过表3结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密度均小于10％(除0和0.1ng/ml水平以外)，试剂灵敏度相比实施例1来说有所降低，仅在1ng/ml水平与0值校准品有较为显著区分。说明荧光微粒前处理过程中通过添加手臂的方式能有有效的提升检测的灵敏度。

表3 MPO定量检测标准曲线数据

Claims (10)

1.一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、在检测反应杯内表面包被MPO单抗或者多抗；

S2、将时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记抗体；

S3、将待测MPO样品加入步骤S1包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；

S4、清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600～630nm；

S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。

2.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。

3.根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述镧系元素螯合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。

4.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100～1000nm。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球为前处理后的羧基时间分辨荧光微球；所述前处理包括：加入MES、EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15～60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10～100ul 50mM氨基己酸。

6.根据权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述初次活化处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加60ul 500mMMES缓冲液pH5.0～7.0，加0.02～0.2mgEDC，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15～30min；所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加1mL100mM MES pH5.0～7.0，15000rpm离心清洗10～25min，弃去上清；加400ul 100mMMES pH5.0～7.0，超声分离，加0.02～0.2mg NHS，加0.01～0.1mgEDC，室温混匀10～20min。

7.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，步骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后用反应缓冲液稀释到终浓度50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤；所述每1L反应缓冲液中含有50～200mM PB，1～5％酪蛋白，0.9～3％NaCl，0.5～2％PEG，0.02～2.0％tween 20，pH6.0～9.0。

8.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述清洗采用的清洗液每1L含5～100mM PB，0.9～3％NaCl，0.02～1.0％Tween 20，pH6～9。

9.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述标准曲线为系列浓度的MPO校准品的MPO浓度与对应的荧光信号的关系曲线；该荧光信号为采用所述基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法测得的荧光信号。

10.一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测反应杯、荧光标记抗体和清洗液；

所述检测反应杯内表面包被MPO单抗或者多抗；

所述荧光标记抗体是由时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备而得；

所述清洗液每1L含5～100mM PB，0.9～3％NaCl，0.02～1.0％Tween 20，pH6～9。