CN103289931B - 一种花域芽孢杆菌菌株sj及其在制备烟草抗病毒制剂和促生剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花域芽孢杆菌菌株SJ及其在制备烟草抗病毒制剂和促生剂中的应用，所述花域芽孢杆菌菌株SJ的保藏编号为：CGMCC No.7571。本发明制成达到一定活菌数的SJ菌制剂，所得的SJ菌制剂可以用来制备抗烟草病毒病的生物制剂和促进烟草生长的促生剂。通过采用本发明的技术方案，不仅可以减少抗烟草病毒的化肥农药的使用率，减轻了农药对环境造成的污染；而且使用本发明所述SJ菌制剂可以达到良好的抗病毒效果，还可以对烟草起到有效的促生作用；所述SJ菌制剂生产成本低、操作简单方便、保存时间长、易于贮存和运输，便于工厂扩大化生产，实现产业化，具有良好的技术效果和市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种花域芽孢杆菌菌株SJ及其在制备烟草抗病毒制剂和促生剂中的应用。
背景技术
烟草是我国主要的经济作物，其产量及质量关系着国计民生。目前，控制烟草病害的一般方法是使用化学农药，然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时长期使用化学药剂会造成农药残留超标和环境污染，导致烟叶内在品质下降，烟田生态失衡，甚至严重影响了烟叶生产的可持续发展。而生物防治是控制植物病害的一种新途径，它主要是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制植物病原菌的生长。微生物制剂中生防菌的种类、与病原微生物之间的拮抗作用大小是决定其抗病毒能力的关键，因此现在将寻找拮抗致病菌或致病害虫的高活性微生物及其代谢产物来预防和解决植物病毒病是目前的研究热点和突破口。
发明内容
本发明提供了一种花域芽孢杆菌菌株SJ及其在制备烟草抗病毒制剂和促生剂中的应用。使用本发明所述SJ菌制剂可以制备抗烟草病毒病的生物制剂和烟草促生剂，具有抗病毒效果好、有利于环境保护、易于产业化生产等优点。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种花域芽孢杆菌菌株SJ，其分类命名为花域芽孢杆菌Bacillusvallismortis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.7571。
所述花域芽孢杆菌菌株SJ的菌落为圆形，边缘整齐，直径3.0mm-8.0mm，呈白色，有突起，表面呈膜，里面为粘液，挑起有拉丝，菌体呈短杆状，芽孢端生，圆形。
本发明提供了含有所述的花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂。
其中，所述SJ菌制剂为固体菌剂或液体菌剂，所述固体菌剂有效活菌数为1亿/g以上，液体菌剂有效活菌数为1亿/mL以上。
其中，所述花域芽孢杆菌菌株SJ的优化培养基配方为：玉米粉6.0-8.0g/L，淀粉0.5-2.0g/L，葡萄糖3.0-5.0g/L，蛋白胨1.0-3.0g/L，豆饼粉8.0-10.0g/L，葡萄糖2.0-3.0g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，碳酸钙3.0-5.0g/L，七水硫酸镁0.8-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，消泡剂1.5-3.0g/L，pH8.0-8.5。
本发明还提供了所述的含有花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂在制备烟草抗病毒制剂中的应用。
其中，所述病毒为烟草花叶病毒。
本发明还提供了所述的含有花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂在制备烟草促生剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明从植烟土壤中分离得到防治TMV的拮抗菌株SJ，并通过对其培养基优化的技术方案，将其制成达到一定活菌数的SJ菌制剂，所得的SJ菌制剂可以用来制备抗烟草病毒病的生物制剂和促进烟草生长的促生剂。通过采用本发明的技术方案，不仅可以减少抗烟草病毒的化肥农药的使用率，减轻了农药对环境造成的污染；而且使用本发明所述SJ菌制剂可以达到良好的抗病毒效果，还可以对烟草起到有效的促生作用；所述SJ菌制剂生产成本低、操作简单方便、保存时间长、易于贮存和运输，便于工厂扩大化生产，实现产业化，具有良好的技术效果和市场应用前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1为本发明所述花域芽孢杆菌SJ的平板培养基照片。
图2为本发明所述花域芽孢杆菌SJ菌制剂对TMV病毒粒体影响的电镜照片图，其中a显示未经处理的TMV病毒粒体形态，b显示与SJ制剂混合后的TMV病毒粒体形态。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
一、活性菌株的分离纯化
2012年7月4日从山东沂水烟区植烟土壤中共取样50余份根际土壤，分别取2g样品悬浮在20ml生理盐水中，180rpm，震荡30min。分别取100μL样品悬浮液在营养琼脂平板均匀涂布，35℃培养箱中倒置培养16h，挑取形态各异的单菌落用划线法接种到营养琼脂平板上，通过反复多次划线得到纯菌，共筛选出126株纯菌，并将所有菌株通过斜面保存。
二、防治TMV拮抗细菌的SJ菌株的筛选
挑取上述纯化菌株接种于LB液体培养基，28℃恒温，140rpm振荡培养48h，取20ml与等体积20倍TMV汁液混合30min后，摩擦接种TMV（烟草花叶病毒，tobacco mosaic virus）的枯斑寄主三生-NN烟，每株接种上部4片叶，以无菌水与TMV混合为对照，3～5d调查枯斑抑制率。经初步测试有拮抗活性的菌株采用相同方法重复测试，每处理3株，三次重复。枯斑抑制率计算公式：
枯斑抑制率实验结果显示菌株SJ对TMV的抑制效果最好，对TMV的枯斑抑制率达到94.5％，生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑制病毒活性的抗生物质（见表1）。
表1 菌株SJ对烟草普通花叶病毒的抑制作用
三、对花域芽孢杆菌的细菌分子遗传学分类鉴定
对SJ菌株提取DNA，以该DNA为模板，16S rDNA通用引物为引物，对16S rDNA片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示该菌株16S rDNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus vallismortis的16s rDNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株SJ16S rDNA与Bacillusvallismortis同源性最高，因此可以判定该菌株为芽孢杆菌属的花域芽孢杆菌，命名为花域芽孢杆菌菌株SJ。
将筛选到的花域芽孢杆菌菌株SJ进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年5月8日；Bacillusvallismortis的编号为CGMCC No.7571。
如图1所示，花域芽孢杆菌菌株SJ在营养琼脂平板上37℃培养18h形成的菌落为圆形，边缘整齐，直径3.0mm-8.0mm,白色，有突起，表面呈膜，里面为粘液，挑起有拉丝。花域芽孢杆菌菌体呈短杆状，芽孢端生，圆形。
四、花域芽孢杆菌菌株SJ的培养基优化
将试管斜面保存的SJ菌种划线接种于NA培养基平板上，28℃培养64h后接种于营养肉汤液体培养基中进行液体培养，每500mL三角瓶中装液量为200mL，于35℃，180r/min.恒温摇床培养16h，作为种子液用于下面的试验。
固定氮源尿素，添加玉米粉、蔗糖、葡萄糖、淀粉等单一碳源，进行碳源筛选；固定碳源玉米粉，添加豆饼粉、酵母粉、蛋白胨等单一氮源，筛选出最优氮源，调整培养基pH、发酵温度、转速、接种比例等优化出最优培养基。
经实验筛选出花域芽孢杆菌菌株SJ的优化培养基配方为：玉米粉6.0-8.0g/L，淀粉0.5-2.0g/L，葡萄糖3.0-5.0g/L，蛋白胨1.0-3.0g/L，豆饼粉8.0-10.0g/L，葡萄糖2.0-3.0g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，碳酸钙3.0-5.0g/L，七水硫酸镁0.8-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，消泡剂1.5-3.0g/L，pH8.0-8.5。
发酵结果：pH7.0左右，有效活菌数为250亿/mL。
五、抗烟草病毒病的SJ菌制剂的制备
将试管斜面保存的SJ菌种划线接种于营养肉汤培养基平板上，35℃培养16h后接种于营养肉汤液体培养基中进行液体培养，每500mL三角瓶中装液量为200mL，于35℃，180r/min，恒温摇床培养16h，做为一级种子液。
将一级种子液接种到已优化的培养基中，350L发酵罐中装液量240L，35℃，搅拌转速180r/min，发酵16h后做为二级种子液接种到10吨发酵罐，35℃，搅拌转速180r/min，大约14h左右，芽孢率80%放罐，为SJ菌株的发酵液。将所得菌液滤去渣滓，与载体碳酸钙按1:1比例混合，搅拌均匀，通过喷雾干燥塔，设定进风温度170℃，出风温度60℃，除去水分，使菌体完全被吸附在载体上，所得为SJ菌制剂。有效活菌数的测定按照GB20287农用微生物菌剂标准，测得有效活菌数500亿/g。
所述SJ菌制剂可以采用固体菌剂或液体菌剂的形式，所述固体菌剂有效活菌数为1亿/g以上，液体菌剂有效活菌数为1亿/mL以上即可达到良好的抗菌效果。
六、抗植物病毒的SJ菌制剂对TMV的拮抗作用
将菌株SJ制剂稀释1000倍，与80倍TMV汁液等体积混合15min后，摩擦接种三生-NN烟，每株接种上部2片叶，以无菌水与TMV混合为CK，同时以SJ培养液、NB培养基代替SJ制剂液为比较。计算枯斑抑制率。
表2 SJ制剂对TMV的抑制作用
| SJ发酵液 | SJ制剂 | 营养肉汤培养基 | |
| 平均枯斑数 | 8.4 | 9.5 | 296 |
| CK | 324 | 351 | 349 |
| 抑制率% | 97.41 | 97.29 | 15.19 |
通过表2看出，SJ菌制剂既不影响发酵液的活性，又能很好的吸附菌液，对TMV的防效达到97.29％。说明选择碳酸钙作为载体，不影响SJ活菌对TMV的抑制作用，碳酸钙作为填料，具有吸附性好、价格便宜等优点，可以在生产上使用。
七、透视电镜下观察SJ制剂对TMV病毒粒体的影响
负染法处理提纯的TMV后，经过JEM-100CX透射电镜观察，视野中的TMV粒体呈典型的杆状，长度约500nm，刚直且排列整齐，完整性好；SJ制剂稀释1000倍与等体积纯TMV粒体混合处理2min后，如图2所示，经电镜观察，视野中TMV粒体发生显著变化几乎全部断裂成小杆状，排列凌乱无序。由此可见，SJ制剂对TMV粒体有强烈的破坏作用，证明SJ制剂对TMV的拮抗物质可对病毒产生钝化作用，抑制TMV外壳蛋白的聚合，并破坏粒体的完整性。
八、促生作用
2-3叶期普通烟NC89，移栽至直径10cm的小花盆，移栽时用稀释1000倍的SJ制剂灌根，每株10ml，间隔3d，再连续灌根2次，以营养肉汤、无菌水灌根为对照，每处理6株，3次重复。末次灌根30d后，调查鲜重，最大叶长、宽。
由表3看出，普通烟NC89，连续三次灌根，SJ菌制剂处理其鲜重，最大叶长、宽均高于营养肉汤和清水处理，与清水处理差异极显著。
表3 4A1发酵液灌根对NC89的促生作用
九、菌体制剂的稳定性试验
将SJ菌制剂在室温下放置，每隔一段时间对制剂进行计数。将制剂稀释1000倍与TMV等体积混合，温室接种三生NN烟，检测对病毒的枯斑抑制率，结果如表4所示。
表4 SJ菌制剂室温下活性降解规律
通过表4看出，SJ菌制剂在室温下保存，随着时间的延长，活性逐渐降解，保存12个月，对TMV的活性下降到79.04％，菌数为250亿/g，说明SJ菌制剂在室温下，降解缓慢，分析其原因主要是形成了芽孢，易于贮存和运输，具有开发为生防制剂的潜质。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种花域芽孢杆菌菌株SJ，其特征在于：其分类命名为花域芽孢杆菌Bacillus vallismortis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.7571。
2.根据权利要求1所述的一种花域芽孢杆菌菌株SJ，其特征在于：花域芽孢杆菌菌株SJ的菌落为圆形，边缘整齐，直径3.0mm-8.0mm，呈白色，有突起，表面呈膜，里面为粘液，挑起有拉丝，菌体呈短杆状，芽孢端生，圆形。
3.含有权利要求1所述的花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂。
4.根据权利要求3所述的含有花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂，其特征在于：所述SJ菌制剂为固体菌剂或液体菌剂，所述固体菌剂有效活菌数为1亿/g以上，液体菌剂有效活菌数为1亿/mL以上。
5.根据权利要求3所述的含有花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂，其特征在于：所述花域芽孢杆菌菌株SJ的优化培养基配方为：玉米粉6.0-8.0 g/L，淀粉0.5-2.0 g/L，葡萄糖 3.0-5.0 g/L，蛋白胨1.0-3.0 g/L，豆饼粉8.0-10.0 g/L，葡萄糖2.0-3.0 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0 g/L，碳酸钙3.0-5.0 g/L，七水硫酸镁0.8-1.0 g/L，硫酸锰0.1-0.5 g/L，消泡剂1.5-3.0 g/L，pH 8.0-8.5。
6.根据权利要求3所述的含有花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂在制备烟草抗病毒制剂中的应用，其特征在于，所述病毒为烟草花叶病毒。
7.根据权利要求3所述的含有花域芽孢杆菌菌株SJ的SJ菌制剂在制备烟草促生剂中的应用。
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