CN105861733A - 一种用于检测car-t转导效率的引物、探针和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测CAR‑T转导效率的引物、探针和方法，属于生物技术领域。本发明提供的检测CAR‑T转导效率的引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，所述下游引物的序列为：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA。本发明提供的引物和探针用于Real‑Time PCR检测的特异性好，能够准确检测CAR‑T的转导效率，提高了检测效率，为其在免疫细胞治疗技术的疗效检测提供有力的支持。

Description

一种用于检测CAR-T转导效率的引物、探针和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于检测CAR-T转导效率的引物、探针和方法。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，作为肿瘤免疫细胞治疗的前言技术，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效。CAR-T的基本原理就是利用病人自身的T细胞，嵌合抗原受体修饰后，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。
作为一种肿瘤疾病的疗法，CAR-T在注射到患者体内实现免疫治疗之前，需要有效的质控手段，判断CAR-T是否达到治疗要求，即需要对CAR-T转导效率进行检测。现有的检测方法包括Real-Time PCR法，流式细胞术等。
中国专利申请201610079872.0公开了检测CAR-T细胞的捕获探针、该细胞含量的检测方法；捕获探针包括能够结合在CAR-T细胞的配体，以及结合在该配体上的荧光分子，通过流式细胞术进行CAR-T细胞的检测。
Real-Time PCR法由于操作简便、精确且成本较低，被作为检测CAR-T转导效率的常用方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于检测CAR-T转导效率的引物、探针和方法，引物和探针针对CAR-T基因序列中的保守序列进行设计，结合本发明提供的方法，可以实现转导效率的定量检测，操作方便，准确性好，克服了现有技术对CAR-T检测特异性低、准确性低且易产生假阳性的问题。
本发明提供一种用于检测CAR-T转导效率的引物，包括上游引物和下游引物；上游引物的序列为：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即SEQ ID NO：1，下游引物的序列为：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即SEQ ID NO：2。
相应地，本发明还提供一种与上述引物配合使用的探针，所述探针的序列为：ACTCTCAGTTCACATC，即SEQ ID NO：3。
本发明提供的引物和探针针对CAR-T基因序列中的保守序列进行设计，用于Real-Time PCR检测的特异性好，能够准确检测CAR-T的转导效率，提高了检测效率，为其在免疫细胞治疗技术的疗效检测提供有力的支持。上游引物和下游引物均无引物二聚体，且上游引物和下游引物的退火温度差距较小。
优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
更优选地，所述荧光报告基团选自VIC；所述荧光淬灭基团为MGB。
此外，本发明还提供一种用于检测CAR-T转导效率的方法，包括如下步骤：
S1DNA模板的制作：无菌环境中，取培养的CAR-T细胞，提取DNA；
S2系列标准品的制作：使用质粒CART-19scFv作为标准品母液，提取感染前T淋巴细胞DNA，用来稀释CART-19scFv质粒，制成系列标准品；系列标准品的拷贝数分别为1.590E+08、1.590E+07、1.590E+06、1.590E+05、1.590E+04、1.590E+03、1.590E+02、1.590E+01；
S3Real-Time PCR检测：配制反应体系，该反应体系包括权利要求1所述的引物以及权利要求2至4任一项所述的探针，对DNA模板进行Real-Time PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制标准曲线，得出CAR-T基因拷贝数和CAR-T转导效率。
优选地，所述Real-Time PCR扩增反应的条件为：95℃15min；94℃5s，62℃10s，72℃20s，共40个循环；72℃300s。
优选地，所述步骤S1中的培养天数为10～14天。按现有培养方法，通过10～14天的培养，得到对数生长期的细胞，即最终的CAR-T产物。
CART-19scFv质粒的构建方法为：将CAR重组基因全序列合成，通过AsisI/NsiI双酶切连入慢病毒质粒载体pLent-EF1a中，得到CART-19scFv质粒。CART-19scFv质粒的谱图如图1所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供的引物和探针针对CAR-T基因序列中的保守序列进行设计，用于Real-Time PCR检测的特异性好，能够准确检测CAR-T的转导效率，提高了检测效率，为其在免疫细胞治疗技术的疗效检测提供有力的支持。本发明提供的Real-Time PCR检测方法简单，可以实现转导效率的定量检测，操作方便，准确性好。
附图说明
图1 CART-19scFv质粒的谱图。
图2本发明引物组的扩增曲线。
图3对比引物组的扩增曲线。
图4本发明引物组检测的标准曲线。
图5本发明实施例二中包含样品的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中涉及的材料可通过市售或本领域的常规技术获得。如：DNA提取试剂盒购自美国Axygen公司，Super Real Real PreMix购自天根生化科技(北京)有限公司，等。
实施例一 引物和探针
用于检测CAR-T转导效率的引物，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列为：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即SEQ ID NO：1；下游引物的序列为：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即SEQ ID NO：2。
与上述引物配合使用的探针，所述探针的序列为：ACTCTCAGTTCACATC，即SEQ IDNO：3。探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。设计的引物交由通用生物***(安徽)公司合成，探针交由Life Technology公司合成。
本发明同时设计了对比引物组：上游引物的序列为：TGCCGATTTCCAGAAGAAG，即SEQID NO：4，下游引物的序列为：GCGCTCCTGCTGAACTTC，即SEQ ID NO：5。
实施例二 Real-Time PCR检测
用于检测CAR-T转导效率的方法，包括如下步骤：
S1 DNA模板的制作：无菌环境中，取培养11天的CAR-T细胞，使用DNA提取试剂盒提取DNA；使用培养后的CAR-T细胞数量为4*106个；提取的DNA使用Nanodrop仪器进行DNA浓度和纯度分析，测得样品DNA浓度为69ng/μl。
S2 系列标准品的制作：使用质粒CART-19scFv作为标准品母液，质粒CART-19scFv的浓度为1.47μg/mL，提取感染前淋巴细胞DNA，用来稀释CART-19scFv质粒，制成系列标准品；系列标准品的拷贝数分别为1.590E+08、1.590E+07、1.590E+06、1.590E+05、1.590E+04、1.590E+03、1.590E+02、1.59E+01；
S3 Real-Time PCR检测：配制反应体系如表1所示，扩增反应的条件如表2所示，对DNA模板进行Real-Time PCR扩增反应，收集荧光信号，使用本发明提供的引物组(SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2)的扩增曲线如图2所示，使用对比引物组(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)的扩增曲线如图3所示。通过对比图2和图3可知，本发明提供的引物组的扩增曲线效果更好，引物与探针匹配良好。以Cq值为纵坐标，以Starting Quantity的对数为横坐标，绘制本发明引物组的检测标准曲线如图4所示。
表1 反应体系
表2 扩增反应条件
本发明提供的Real-Time PCR检测方法实现了CAR-T转导效率的定量检测，检测的单位为Copies/100ng genomic DNA(每100ng基因组中含的CAR-T基因拷贝数)。根据标准曲线，对样品的CAR-T拷贝数进行定量，换算出每100ng基因组中含的CAR-T基因拷贝数，以此得出转导效率。此样品为由90ng基因组DNA扩增得出，样品DNA为从4.0×106个细胞中得到的6.90ug基因组DNA取出，计算得样品(Cq值为26.34)的转导效率为0.55拷贝数/个细胞，阴性对照的Cq值为39.80。CAR-T产品转导效率的判断标准为≥0.2拷贝数/个细胞，作为判断CAR-T产品是否达到免疫治疗的要求的判断标准。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宜明细胞生物科技有限公司
<120> 一种用于检测CAR-T转导效率的引物、探针和方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgtagctg ccgatttcc 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgtcctaga ttgagctcgt ta 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actctcagtt cacatcctc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgccgatttc cagaagaag 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgctcctgc tgaacttc 18

Claims (7)

1.一种用于检测CAR-T转导效率的引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即SEQ ID NO：1；所述下游引物的序列为：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即SEQ ID NO：2。
2.一种与权利要求1所述的引物配合使用的探针，其特征在于：所述探针的序列为：ACTCTCAGTTCACATCCTC，即SEQ ID NO：3。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团选自VIC；所述荧光淬灭基团为MGB。
5.一种用于检测CAR-T转导效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1 DNA模板的制作：无菌环境中，取培养后的CAR-T细胞，提取DNA；
S2 系列标准品的制作：使用质粒CART-19scFv作为标准品母液，提取感染前T淋巴细胞DNA，用来稀释CART-19scFv质粒，制成系列标准品；
S3 Real-Time PCR检测：配制反应体系，该反应体系包括权利要求1所述的引物以及权利要求2至4任一项所述的探针，对DNA模板进行Real-Time PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制标准曲线，得出CAR-T基因拷贝数和CAR-T转导效率。
6.根据权利要求5所述的用于检测CAR-T转导效率的方法，其特征在于：所述Real-TimePCR扩增反应的条件为：95℃15min；94℃5s，62℃10s，72℃20s，共40个循环；72℃300s。
7.根据权利要求5所述的用于检测CAR-T转导效率的方法，其特征在于：所述步骤S1中的培养天数为10～14天。
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