CN111378651A - 一种胞内pb基因残留检测的方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种引物对组合，包括引物对1和选自引物对2、3和4中的任意一个、两个或三个；本发明还提供了探针或探针组合以及包含前述引物对组合和/或探针或探针组合的试剂盒；本发明还提供了一种测定CAR质粒拷贝数的方法和一种对CAR质粒残留进行质量控制的方法。本发明提供的引物对组合、探针或探针组合和试剂盒操作方便，特异性好，灵敏性高，反应效率高，反应体系可重复性好，能够用于含PB基因的CAR质粒拷贝数的定量检测或者CAR‑T细胞回输治疗患者外周血细胞中含有PB基因的CAR质粒的残留水平的定量检测。

Description

一种胞内PB基因残留检测的方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种胞内PB基因残留检测的方法及检测试剂盒。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)免疫疗法是目前肿瘤治疗领域中极具前景的方法之一，其在血液肿瘤的治疗中疗效显著。CAR-T是利用基因编辑技术，使T细胞表达肿瘤特异性嵌合抗原受体，以非主要组织相容性复合体(MHC)限制的方式结合肿瘤抗原，对肿瘤起到杀伤作用。CAR的结构主要包括四部分：细胞外的抗体单链可变区(可特异性结合肿瘤相关抗原)，胞外铰链区，跨膜结合区和活化T细胞的胞内信号区。目前CAR已经发展到第三代CAR，通过增加了多种不同的信号分子结构提高了T细胞的细胞毒性、体内增值活性、持续存活时间和增加细胞因子释放功能。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR不需要经过APC，能非MHC依赖性识别肿瘤抗原；肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。
目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤的治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性急性B-淋巴细胞白血病B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率。2017年8月和11月，美国食品和药物管理局先后批准了治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病的CAR-T药物Kymriah(CTL019)和针对特定淋巴癌的CAR-T药物Yescarta。
虽然CAR-T细胞免疫疗法在多种恶性肿瘤的治疗中取得了很好的疗效，但在治愈肿瘤患者的同时也带来诸多不良反应，如CAR-T细胞在清除肿瘤的同时也会攻击正常组织，治疗同时会产生大量细胞因子导致患者多器官功能衰竭等。目前CAR-T免疫治疗普遍采用慢病毒***感染T细胞，但这种方法感染效率较低，整个过程复杂难操作且周期长；而我们采用质粒载体导入CAR***虽然较大的提高了转导效率且缩短了转导周期，但是会有部分质粒残留在T细胞内，可能会对后续的治疗效果产生未知的影响。PB基因是CAR质粒中用于PB转座酶编码的DNA序列，属于骨架基因(PB转座子***参见CN201510638974.7)。利用实时荧光定量PCR的方法，可以从分子水平对PB基因含量进行检测，以计算单次回输细胞中的质粒残留水平。
因此，目前亟需建立检测PB基因特别是包含PB基因的CAR质粒基因的检测方法。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一组引物对和探针。在此基础上，本发明人得到了荧光定量PCR测定PB基因的拷贝数方法和试剂盒。本发明的方法或试剂盒能够测定含有PB基因的CAR质粒在细胞内的拷贝数，用于计算单次回输细胞中的质粒残留水平。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及引物对组合，其包含以下的4个引物对中的引物对1和选自引物对2、3和4中的任意一个、两个或三个：
引物对1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对
引物对2，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对
引物对3，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对；和
引物对4，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物对。
本发明的引物对1基于CAR质粒上的PB结构基因设计，对含有PB基因的CAR质粒的检测具有通用性。
本发明的引物对2、引物对3和/或引物对4为是基于人源Actin基因设计的特异性引物对。
本发明的另一方面涉及一种探针或探针组合，其选自如下的3个探针中的任意一个或者多个：
探针A，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；
探针B，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；和
探针C，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示
在本发明的一个或多个实施方案中，所述探针A和/或探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2、BHQ3和MGB。
FAM的结构式以及连接方式如下面的式I所示。
Figure BDA0001927677340000031
BHQ1的结构式以及连接方式如下面的式II所示。
Figure BDA0001927677340000032
Hex的结构式以及连接方式如下面的式III所示。
Figure BDA0001927677340000041
TRAMA的结构式以及连接方式如下面的式IV所示。
Figure BDA0001927677340000042
MGB的结构式以及连接方式如下面的式V所示。
Figure BDA0001927677340000043
在本发明的一个或多个实施方案中，所述探针A的一个或多个位置的碱基被锁核酸修饰，即所述探针A中的一个或多个碱基引入了一个或多个锁核酸单体。
优选地，所述探针A的5’端起第4、7和10位中的任意1个、2个或3个碱基被锁核酸修饰；
在本发明的一个或多个实施方案中，所述探针B和/或C不被锁核酸修饰，其荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为MGB。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含前述引物对1和/或前述探针或探针组合。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含扩增内参基因的引物对；优选地，所述内参基因为Actin或GAPDH；更优选地，所述内参基因为Actin。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述扩增内参基因的引物对为扩增Actin基因片段的引物对2，其包含SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列的引物。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述扩增内参基因的引物对为扩增Actin基因片段的引物对3，其包含SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列的引物。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述扩增内参基因的引物对为扩增Actin基因片段的引物对4，其包含SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列的引物。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含前述引物对1和探针A。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含前述引物对1、所述引物对2、3和4中的一个、探针A和探针B。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含前述引物对1、所述引物对2、3和4中的一个、探针A和探针C。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含前述引物对1、所述引物对2、探针A和探针B。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含前述引物对1、所述引物对2、探针A和探针C。
优选地，所述试剂盒还可以包含PCR反应所需的试剂，例如Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。
本发明的再一方面涉及一种测定CAR质粒拷贝数的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)使用含PB基因的质粒和含Actin基因的质粒作为标准品母液，梯度稀释分别制成PB标准品系列和Actin标准品系列；
(3)使用前述引物对组合和前述探针或探针组合物和/或试剂盒，分别对PB基因标准品系列、Actin标准品系列和待测样品的DNA进行时荧光定量PCR；
(4)根据PB标准品系列产生的的Ct值与对应拷贝数和含Actin标准品系列产生的Ct值与对应拷贝数，分别绘制标准曲线，获得计算公式；
(5)将待测样品的PB基因和Actin基因的Ct值带入步骤(4)中的标准曲线的计算公式，获得待测样品的PB基因拷贝数和Actin拷贝数；
优选地，步骤(1)中的待测样品为含PB基因的CAR质粒转导过的CAR-T细胞或所述CAR-T细胞回输患者的外周血；
优选地，步骤(2)中的梯度稀释为10倍梯度稀释；
优选地，步骤(3)中所述实时荧光定量PCR的扩增反应的条件为：94℃5min；94℃20s，60℃1min，共40个循环。
本发明提供一种基于CAR质粒PB基因检测质粒拷贝数评估质粒残留量的方法。通过同时扩增内参基因Actin，获得每个样本的PB基因的Ct值与对应的内参基因Actin的Ct值，分别代入构建的标准曲线从而获得CAR质粒和Actin的拷贝数。
本发明的测定方法能够用于含PB基因的拷贝数检测，对含PB基因的CAR质粒具有检测的通用性。可用于CAR质粒残留量评估，生产质控或体外监测。
本发明的再一方面涉及一种对CAR质粒残留进行质量控制的方法，包括下述步骤：
A.测定CAR质粒骨架PB基因的拷贝数，
B.评估CAR质粒残留水平或与免疫治疗要求的外源基因残留水平进行比较或尽可能降低CAR质粒在免疫细胞中的残留量；
其中，步骤A中采用前述测定CAR质粒拷贝数的方法。
本发明的再一方面涉及前述引物对1、探针或探针组合物和试剂盒中的任一项或多项所述的探针在制备用于测定CAR质粒拷贝数的药物或者制备用于对CAR质粒残留量进行质量控制的产品中的用途。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor,CAR)是识别肿瘤细胞膜上肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的单链抗体和胞内信号域通过铰链区相连构成的嵌合基因。
术语“CAR-T”是将外源抗体基因通过基因转导/转染的技术导入T细胞后获得的表达该外源抗体基因的细胞。这类细胞具有识别并攻击表达相应细胞表面肿瘤相关抗原(TAA)的肿瘤细胞的能力。
术语“第三代CAR”：在二代CAR结构的基础上，进一步增加了一个额外的共刺激信号，使得CAR同时拥有两个共刺激因子(如同时拥有CD28和CD137)。
本发明中，术语“PB基因”是指是CAR质粒中用于PB转座酶编码的DNA序列，属于质粒结构中的骨架基因部分。
本发明中，术语“CAR质粒”是指含有CAR编码序列的、用于将CAR转染免疫效应细胞的载体质粒。
本发明中，术语“锁核酸(locked nucleotide acid，LNA)”是一种包含一个或多个锁核酸单体(LNA monomer(s)，即[2'-O,4'-C-methylene-β-D-ribofuranosyl monomer(s)])的寡核苷酸或寡核苷酸衍生物。在常规的TaqMan探针中引入锁核酸，能提高探针与目的序列的亲和力，增加探针的Tm值。
在本发明一个优选的实施方式(例如实施例1)中，锁核酸单体与碱基的连接方式如下面的式VI所示，其中，B表示碱基。
Figure BDA0001927677340000081
锁核酸单体与探针序列中被修饰的碱基T、C(5-甲基化)、G的具体连接方式(LNA-T，LNA-5-Me-C以及LNA-G)分别如下面的式VII、VIII和IX所示。
Figure BDA0001927677340000082
发明的有益效果
本发明取得了如下技术效果中的至少一项：
(1)本发明的引物对和探针对含PB骨架基因的CAR质粒检测具有检测的通用性。
(2)本发明提供的检测方法操作方便，提供的引物和探针检测的特异性好，灵敏性高，反应效率高，反应体系可重复性好，能够用于含PB基因的CAR质粒拷贝数的定量检测或者CAR-T细胞回输治疗患者外周血细胞中含有PB基因的CAR质粒的残留水平的定量检测。
附图说明
图1：PB基因引物探针设计位置。
图2：PB基因引物探针特异性验证。
图3：PB基因标准品系列标准曲线。
图4：Actin基因标准品系列标准曲线。
图5：扩增PB基因反应体系的重复性验证。
图6A：PB优选引物对1和探针A组合在ABI Onestep平台检测标准品的扩增曲线。
图6B：PB非优选引物对5和探针A组合在ABI Onestep平台检测标准品的扩增曲线。
图6C：PB非优选引物对6和探针A组合在ABI Onestep平台检测标准品的扩增曲线。
图7A：PB优选引物对1和探针A组合在LightCycler 480平台检测标准品的扩增曲线。
图7B：PB非优选引物对7和探针A组合在LightCycler 480平台检测标准品的扩增曲线。
图7C：PB非优选引物对8和探针A组合在LightCycler 480平台检测标准品的扩增曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：引物和探针的设计与合成
设计基于PB基因以及内参基因Actin的引物和探针，委托上海杰瑞生物科技有限公司合成。引物和探针的序列如下面的表1所示。引物和探针在PB基因中位置的相对关系如图1所示。其中探针A引入了锁核苷酸单体，字母大写的碱基为锁核苷酸修饰的碱基。
表1：引物序列和探针序列
Figure BDA0001927677340000101
Figure BDA0001927677340000111
PB基因序列：
TTAGAAGCAGCTCTGGCACATGTCGATGTTGTGCTCGCGGCAGATCACCTTCTTGCACTTCTTGCAGC TGGCGCTGGCCTTGCGGCGGATCTTGCTGGGGCAGTAGGTGCAGTAGGTGCGCTTCTTCATCACGGGCTCCTCGGTGCTGTCGTCGCTGGTGCCGGGCACCTCCTTGGGCAGGATGTTGCTGATGTTGTCGC(SEQID NO：12)其中下划线部分为(103bp)bp产物的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)
实施例2：使用荧光定量PCR体系对含PB基因的质粒转导样本进行残留量评估
样品、试剂、仪器
仪器：Onestep荧光定量PCR检测仪(ABI)，LightCycle480荧光定量PCR检测仪(罗氏)，Nanodrop One核算蛋白浓度测定仪(Thermo)、电转仪：Lonza公司Nucleofactor 2b。
1、CD19CAR-T细胞的制备
委托上海捷瑞生物公司合成CD19CAR外源基因(含CD8信号肽，scFv，CD8跨膜区，CD8铰链区，4-1BB和CD3ζ)，序列如SEQ ID NO.14所示，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游***酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体中(pNB328的结构及序列参见CN201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；命名为pNB328-CD19CAR。
取1.5ml离心管，加入5×106个PBMC(购自ALLCELLS公司)，离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)按比例加入电转试剂共100ul，再加入4μg重组质粒pNB328-CD19CAR，重悬混匀细胞；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到事先包被有CD19抗原和抗CD28抗体的加好培养液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培养液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，获得CD19CAR-T细胞。
样本:含PB基因的CAR质粒pNB328-CD19CAR电转细胞样品，选择未转染的细胞系K562(购自ATCC)作为对照样品。
试剂：基因组抽提试剂盒(Takara)，Taqman gene expression Master Mix试剂(ABI)。
1、试验方法
取上述CD19CAR-T细胞与K562细胞，抽提基因组。根据荧光定量PCR方法的反应体系配置反应液，获取PB基因的Ct值及对应样本的Actin的Ct值。将量基因的Ct值带入各自的标准曲线，计算各基因的拷贝数。
具体步骤如下：
(1)外源DNA模板的制备：取CD19CAR-T细胞与K562细胞，提取细胞DNA；作为PB基因和Actin基因的检测模板。
(2)标准品的制备：使用含PB基因的CAR质粒pNB328-CD19CAR制备标准品母液，提取含内参基因Actin的质粒作为内参基因标准品母液，提取未转导的T淋巴细胞DNA作为背景。
(3)根据表2，分别制备10倍梯度的稀释标准品。
表2：PB基因标准品和Actin标准品的制备
PB标准品系列 浓度(ng/5μl) Actin标准品系列 浓度(ng/5μl) 拷贝数/5μl
1 1.00E+01 1 1.00E+01 2.46E+09
2 1.00E-01 2 1.00E+00 2.46E+08
3 1.00E-02 3 1.00E-01 2.46E+07
4 1.00E-03 4 1.00E-02 2.46E+06
5 1.00E-04 5 1.00E-03 2.46E+05
6 1.00E-05 6 1.00E-04 2.46E+04
(4)实时荧光定量PCR检测：配置定量PCR反应体系，该反应体系中包含了表1中的引物和探针的组合。对标准品DNA模板进行扩增反应。反应程序为两步法：第一步95℃5min；第二步，95℃20s，60℃1min，共进行40个循环。PCR反应体系如下面的表3所示。
表3：外源质粒基因拷贝数检测的荧光定量检测PCR反应体系
Figure BDA0001927677340000131
(5)引物、探针特异性检测
PB引物探针特异性检测：使用未转染的细胞系K562的基因组作为背景基因组，使用PB基因引物、探针扩增，检测引物探针组合的特异性。反应中设置一个阳性对照，即含PB基因的CAR质粒DNA的阳性样本，一个阴性对照，即添加不含任何DNA模板的水和一个PB标准品6(表2所示)。
(6)灵敏性检测：使用10倍梯度稀释的PB基因标准品和内参基因Actin标准品分别进行荧光定量PCR反应。根据PB基因的Ct值与对应标准品拷贝数构建外源基因的标准曲线，评估体系检测范围，
根据Actin基因的Ct值与对应标准品拷贝数构建标准曲线，评估体系检测范围。
(7)重复性检测：取含PB基因的CD19CAR-T细胞样本，取其细胞3×106共6份，抽提基因组后进行拷贝数检测，使用PB基因和Actin基因对应的引物、探针扩增，每份样品平行重复3次。测得的拷贝数值进行组内差异的统计学分析，以变异系数情况来确定该反应的重复性。
(8)中间密度检测：取一份CD19CAR-T细胞样本，按照3E+06细胞取6份，分为两组并标记。分别由两名操作人员对每组样本的拷贝数进行检测。统计不同批次间样本拷贝数及变异系数。若该批质控品拷贝数不在0.8～1.2间，使用质控品数值进行校正，质控品拷贝数计算公式＝2*[PB含量*1.42×109]/Actin拷贝数。
(9)准确度验证：以回收率(％)表示方法测定的结果与真实值之间的接近程度。
PB回收率：分别取三份含PB基因的CAR-T阳性样本，分别与PB标准品1、2、3按照1:1比例混合，计算样本的回收率。
Actin回收率：分别取三份CAR-T阳性样本，分别与Actin标准品1、2、3按照1:1比例混合，计算样本的回收率。
(10)耐用性检测：将准确度验证后的样本放置大于72h以后，重新检测其拷贝数。第一次检验数据引用准确性检测结果。比较拷贝数检测结果的变化差异。
3.实验结果
3.1特异性验证
如图2和表4所示，PB引物探针组合扩增含PB基因的CD19CAR-T阳性样本和PB标准品6扩增结果阳性，且PB阳性样本Ct值小于PB标准品6的Ct值；空白水和K562阴性样本检测不到扩增曲线，或它们Ct大于标准品6的Ct值，说明PB引物探针组合在扩增人源DNA专属性良好。
表4 PB引物、探针特异性验证
Figure BDA0001927677340000151
3.2标准曲线
荧光定量PCR结果显示，标准品DNA随着梯度稀释Ct值呈线性递增。
PB标准曲线的回归方程：y＝-3.454Log(x)+12.48，R2＝0.999。检测范围为1.0E+01ng～1.0E-04ng(如图3所示)。
Actin标准曲线的回归方程：y＝-3.461Log(x)+42.98，R2＝0.997，检测范围为2.46E+09个拷贝～2.46E+04个拷贝(如图4所示)。
3.3重复性
采用变异系数CV(％)评价重复性结果。对同一样本分为6份进行胞内残留质粒进行检测，每个样本设置平行重复3管。结果显示6份重复样本其胞内残留质粒量结果相近，批内变异系数小于25％(表5和图5)，表明建立的检测方法重复性良好。
表5 PB基因反应体系的重复性验证
Figure BDA0001927677340000161
3.4中间精密度检测
采用变异系数CV(％)评价不同人员对精密度的影响。分别由两名操作人员对相同的两组样本的拷贝数进行检测。
结果显示(表6)，两组人员针对同一份样本的质粒残留检测结果非常相近，其CV值小于25％，表明建立的CAR-T质粒残留检测方法稳定性良好。
表6 PB基因反应体系的中间精密度验证
Figure BDA0001927677340000171
Figure BDA0001927677340000181
3.5准确度检测
采用回收率(％)表示检测结果与真实值的接近程度。实验结果显示(表7)，标记为PB回收率检测样本其回收率在97.17％～107.48％，标记为Actin回收率检测样本其回收率在97.92％～118.97％，两者回收率都在100％±50％范围内，表明检测方法准确性良好。
表7 PB基因反应体系的准确度验证
Figure BDA0001927677340000182
Figure BDA0001927677340000191
Figure BDA0001927677340000201
3.6耐用性验证
将准确度检测后的样本放置72h以后，重新检测其拷贝数。结果显示不同放置时间的样本其质粒残留检测结果相近，其CV值小于25％(表8)，表明检测体系稳定，放置72h内检测结果不会有显著差异。
表8 PB基因反应体系的耐用性验证
Figure BDA0001927677340000202
Figure BDA0001927677340000211
对照实施例1
1、样品、试剂及仪器
样品：含PB基因的CAR-T质粒标准品。
试剂：细胞基因组DNA抽提试剂盒(Takara)，TaqMan gene expression MasterMix试剂(ABI)。
仪器：ABI Onestep平台(ABI)、LightCycler480荧光定量PCR检测仪(罗氏公司)。
2.实验方法
取自带有PB基因的CAR质粒pNB328-CD19CAR。根据荧光定量PCR方法的反应体系配制反应液，用不同的引物探针组合获取PB基因的Ct值。作为对照，PB基因标准品使用对应的优选的引物探针(如表1)和非优选引物探针进行扩增。
具体步骤如下：
(1)非优选的引物探针的设计、合成：
本发明人在研究过程中设计了多种引物、探针，这里列举其中有代表性的非优选引物探针作为对比实施例。
非优选的PB引物对分别为引物对5(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)、引物对6(SEQID NO:17和SEQ ID NO:18)、引物对7(SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)和引物对8(SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22)：
引物对5：
CACCTTCTTGCACTTCTTG(SEQ ID NO:15)；GAGCCCGTGATGAAGAAG
(SEQ ID NO:16)；
引物对6：
CTCTGGCACATGTCGATG(SEQ ID NO:17)；
CACCTACTGCACCTACTG(SEQ ID NO:18)；
引物对7：
TGGCACATGTCGATGTTG(SEQ ID NO:19)；
CACCTACTGCACCTACTG(SEQ ID NO:20)；
引物对8:
CTCTGGCACATGTCGATG(SEQ ID NO:21)；
GAGCCCGTGATGAAGAAG(SEQ ID NO:22)；
设计的引物交由上海捷瑞生物公司合成。
(2)使用含PB基因的CAR质粒pNB328-CD19CAR按照表2制备标准品系列；
(3)实时荧光定量PCR检测：配制定量PCR反应体系，其中引物对和探针组合分别为：引物对1和探针A、引物对5和探针A、引物对6和探针A的组合用ABI Onestep平台检测；引物对和探针组合分别为：引物对1和探针A、引物对7和探针A、引物对8和探针A的组合用LightCycler 480平台检测。反应程序为两步法：第一步95℃5min；第二步，95℃20s，60℃1min，共进行40个循环。PCR反应体系参考上面的表3。
3.实验结果
使用PB基因标准品作为模板，分别使用对应的优选引物探针和非优选引物探针进行扩增对比。
图6A、6B和6C为ABI Onestep检测平台对特异性引物对1和探针A、非特异性引物对5和探针A以及非特异性引物对6和探针A的扩增结果，显示出本发明提供的特异性引物对1与探针组合匹配良好，有更好的扩增曲线效果。
图7A、7B和7C为LightCycler 480检测平台对特异性引物对1和探针A、非特异性引物对7和探针A以及非特异性引物对8和探针A的扩增结果，显示本发明提供的特异性引物与探针组合匹配良好，有更好的扩增曲线效果。
由上述可见：
本发明通过对内参基因Actin和PB基因的检测，能够对含PB基因CAR-T细胞质粒进行定量检测；本发明使用锁核苷酸修饰的TaqMan探针检测PB拷贝数具有见测得高灵敏性、特异性和可重复性；通过对PB基因进行定量检测，可用于评估CAR-T质量控制和CAR-T治疗患者细胞中的质粒残留量检测。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
上海细胞治疗研究院
<120> 一种胞内PB基因残留检测的方法及检测试剂盒
<130> 18B008
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacatgtcg atgttgtg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacctactgc acctactg 18
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcaagatc cgccg 15
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagttcctg gcctggccct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagttcctg gcctggccct 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggtctctgt tcctgcttat tgg 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagaaaaact ggggtacctg gg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacattgagc agccttagag gg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aactccccaa taagcaggaa ca 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acattgagca gccttagagg g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggtacctgg ggagacatag aa 22
<210> 12
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttagaagcag ctctggcaca tgtcgatgtt gtgctcgcgg cagatcacct tcttgcactt 60
cttgcagctg gcgctggcct tgcggcggat cttgctgggg cagtaggtgc agtaggtgcg 120
cttcttcatc acgggctcct cggtgctgtc gtcgctggtg ccgggcacct ccttgggcag 180
gatgttgctg atgttgtcgc 200
<210> 13
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcacatgtcg atgttgtgct cgcggcagat caccttcttg cacttcttgc agctggcgct 60
ggccttgcgg cggatcttgc tggggcagta ggtgcagtag gtg 103
<210> 14
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgctg a 1461
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccttcttg cacttcttg 19
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagcccgtga tgaagaag 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctctggcaca tgtcgatg 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacctactgc acctactg 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggcacatgt cgatgttg 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cacctactgc acctactg 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctctggcaca tgtcgatg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagcccgtga tgaagaag 18

Claims (10)

1.引物对组合，其包含以下引物对中的引物对1和选自引物对2、3和4中的任意一个、两个或三个：
引物对1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；
引物对2，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对；
引物对3，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对；
引物对4，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物对。
2.探针或探针组合，其包含以下探针中的任意一个、两个或三个：
探针A，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；
探针B，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；
探针C，其核酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3.根据权利要求2所述的探针或探针组合，其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3。
4.根据权利要求2或3所述的探针或探针组合，其中，
探针A和/或探针B中的一个或多个位置的碱基被锁核酸修饰。
5.根据权利要求4所述的探针或探针组合，其中，
探针A的5’端起第4位、第7位、和第10位中的任意1个、2个、或3个碱基被锁核酸修饰。
6.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对组合，和/或权利要求2至5中任一权利要求所述的探针或探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其还包含PCR反应所需的试剂，优选地，所述PCR反应所需的试剂选自Mg2+、反应缓冲液、dNTP和DNA聚合酶中的一种或多种。
8.一种测定CAR-T细胞治疗残留质粒拷贝数的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)使用含PB骨架基因的CAR质粒和含Actin基因的质粒作为标准品母液，分别制成CAR质粒基因标准品系列和Actin标准品系列；
(3)使用权利要求1的引物对组合和/或权利要求2-5所述的探针或探针组合和/或权利要求6-8所述的试剂盒，分别对PB基因CAR质粒标准品系列、Actin标准品系列和待测样品的DNA进行实时荧光定量PCR；
(4)根据每个含PB基因CAR质粒标准品系列产生的Ct值与对应拷贝数，含Actin标准品系列产生的Ct值与对应拷贝数，分别绘制标准曲线，获得计算公式；
(5)将待测样品的PB基因和Actin基因的Ct值带入步骤(4)中的标准曲线的计算公式，获得待测样品的PB基因拷贝数和Actin拷贝数；
优选地，步骤(1)中的待测样品为含PB基因CAR质粒转导过的细胞；
优选地，步骤(2)中的梯度稀释为10倍梯度稀释；
优选地，步骤(3)中所述实时荧光定量PCR的扩增反应的条件为：94℃5min；94℃20s，60℃1min，共40个循环。
9.一种对CAR质粒残留量进行检测的方法，包括下述步骤：
A.测定PB基因的拷贝数，
B.评估质粒残留量或与免疫治疗要求的残留外源基因拷贝数进行比较；
其中，步骤A中所述测定PB基因拷贝数采用根据权利要求8所述的测定PB基因拷贝数的方法；
所述CAR质粒含有PB骨架基因。
10.权利要求1所述的引物对组合和/或权利要求2至3中任一权利要求所述的探针或探针组合在制备用于测定CAR质粒拷贝数的药物或者制备用于对CAR质粒残留进行质量控制的药物中的用途，其中所述CAR质粒含有PB骨架基因。
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