CN111500690A - 一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 - Google Patents
一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111500690A CN111500690A CN202010296169.1A CN202010296169A CN111500690A CN 111500690 A CN111500690 A CN 111500690A CN 202010296169 A CN202010296169 A CN 202010296169A CN 111500690 A CN111500690 A CN 111500690A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- car
- copy number
- cell
- detecting
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 35
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 abstract description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002558 medical inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940126672 traditional medicines Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种检测CAR‑T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其通过设计一段同时包含CAR‑T细胞的目的基因(慢病毒基因)序列及内参基因序列且拷贝数之比为1的DNA序列用于测定引物扩增效率之比，同时设计了特异性的可用于检测绝大部分CAR‑T细胞目的基因的引物与探针，并选用了数字PCR该检测方式，配合使用能减少检测误差，精确地反应CAR‑T细胞基因组中病毒载体拷贝数，从而来确保CAR‑T细胞***的有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T,Chimeric antigen receptor T cell)治疗是指通过基因编辑技术改造T细胞，加强T细胞杀伤肿瘤细胞的效果，从而达到***的目的。药物的安全性是重中之重，尽管CAR-T细胞治疗已经取得一定的进展，但它还属于一个未完全成熟开发的领域，在其开发过程中不断有许多新的技术进入该领域，且人们尚未有足够的数据评估其潜在风险。
CAR-T细胞治疗这项技术的难点并不在于前期的细胞治疗，而在后期的细胞治疗副作用如何处理及产品质量的控制。CAR-T细胞不同于传统的药物，其生产工艺复杂、要求高，由于个体化的CAR-T扩增细胞的产品制备工艺是以病人作为供体采集初始细胞材料才能进入工艺过程，即使采用已经在临床进行过充分临床验证的细胞治疗工艺，仍然难以做到如何保证每个肿瘤个体所制备的扩增细胞都质量是一致的。这限制了个体化的CAR-T细胞治疗产品的快速发展，因此提高CAR-T细胞治疗产品的技术安全性、有效性、质量的可控性以及细胞治疗产品制备工艺的一致性是目前细胞治疗产品研发者重点关注的方向。
关于载体的基因整合在T细胞的基因组中，一方面可以显示已经对T细胞的基因组进行了基因修饰，一方面又是一个衡量基因安全性的指标。载体基因整合可能给细胞带来一些原癌细胞基因的激活或抑癌细胞基因的失活等危害从而造成二次感染恶性肿瘤的风险，尽管现在对载体的基因整合设计已经大大降低了基因整合的二次感染风险，但这种整合的风险仍未完全得到消除，因此仍需对已被整合到细胞中的基因组载体中的病毒拷贝数进行检测。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种有效、稳定、准确的检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，从而来确保CAR-T细胞***的有效性和安全性。
本发明的技术方案如下：
一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，包括步骤：
针对CAR-T细胞中的目的基因设计正向引物、反向引物及第一探针，挑选内参基因的正向引物、反向引物及第二探针；
设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比；
同时培养一批CAR-T细胞以及未感染细胞分别提取DNA，进行DNA浓度和纯度分析后作为待检测组和阴性对照组，并设置不加DNA样品的空白对照，配置PCR反应液，制成微滴后经PCR反应，上机分析得到目的基因拷贝数与内参基因拷贝数；
根据数字PCR仪的读数以及之前获得的扩增效率之比，计算目的基因的拷贝数，所述CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比。
所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述CAR-T细胞中的目的基因的正向引物序列为SEQ ID NO.1，所述CAR-T细胞中的目的基因的反向引物为SEQID NO.2，所述第一探针序列为SEQ ID NO.3。
所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述第一探针的5’端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。
所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述内参基因的正向引物为SEQ ID NO.4，反向引物为SEQ ID NO.5，探针为SEQ ID NO.6。
所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述第二探针的5’端标记为VIC荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。
所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述用于检测引物扩增效率的基因序列为SEQ ID NO.7。
所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其中，所述PCR反应的反应程序为：第一阶段，95℃预变性10分钟，1个循环；第二阶段，95℃变性15秒，65℃延伸1分钟，共40个循环。
有益效果：本发明针对CAR-T细胞质量控制的需要，分析常用的慢病毒载体序列，设计了可适用于大部分慢病毒载体的引物、探针及用于测定引物扩增效率的标准品序列。利用数字PCR技术配合此引物和探针可对CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数准确定量，为CAR-T细胞治疗产品的有效性和安全性提供保障。
附图说明
图1为本发明提供的一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
本发明提供一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
目前常用的核酸检测方法主要有两种：实时定量PCR检测法及数字定量PCR检测法，其中，数字定量PCR检测方法在定量检测病毒载体拷贝数时准确度更高，且因其不需要设计或制备任何标准的曲线因而更加方便简捷。目前的数字定量PCR检测技术主要是利用先进的油包水样品乳化微滴检测技术与微流体力学检测技术，借助于微滴发生器，将每个油包水样品乳化后生成许多个均匀的纳升级乳化微滴，此时DNA片段和背景序列在乳化微滴中随机地分布。再使用热循环仪对微滴样品进行PCR扩增后通过微滴分析仪的双色光学管路检测逐个地分析每个微滴。这个***将通过计算核酸阳性和油包水阴性微滴的数量，从而以数字的格式对CAR基因拷贝数进行绝对定量分析。然而，由于现有的数字定量PCR检测方法没有针对目的基因设计引物及探针，也没有设计用于测定引物扩增效率的标准品序列，其仍存检测误差较大，无法精确地反应CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的问题。
基于现有技术所存在的问题，本发明提供了一种运用数字PCR技术检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，如图1所示，其包括步骤：
S10、针对CAR-T细胞中的目的基因设计正向引物、反向引物及第一探针，挑选内参基因的正向引物、反向引物及第二探针；
S20、设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比；
S30、同时培养一批CAR-T细胞以及未感染细胞分别提取DNA，进行DNA浓度和纯度分析后作为待检测组和阴性对照组，并设置不加DNA样品的空白对照，配置PCR反应液，制成微滴后经PCR反应，上机分析得到目的基因拷贝数与内参基因拷贝数；
S40、根据数字PCR仪的读数以及之前获得的扩增效率之比，计算目的基因的拷贝数，所述CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比。
本实施例设计了一段同时包含CAR-T细胞的目的基因(慢病毒基因)序列及内参基因序列且拷贝数之比为1的DNA序列用于测定引物扩增效率之比，同时设计了特异性的可用于检测绝大部分CAR-T细胞目的基因的引物与探针，并选用了数字PCR该检测方式，配合使用能减少检测误差，精确地反应CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数，从而来确保CAR-T细胞***的有效性和安全性。
在一些实施方式中，所述CAR-T细胞中的目的基因的正向引物序列为SEQ IDNO.1，所述CAR-T细胞中的目的基因的反向引物为SEQ ID NO.2，所述第一探针序列为SEQID NO.3。具体来讲，所述CAR-T细胞中的目的基因的正向引物(慢病毒序列的LTR区的正向引物)序列为：5’-GCTTCAAGTAGTGTGTGCCC-3’(SEQ ID NO.1)，所述CAR-T细胞中的目的基因的反向引物(慢病毒序列的Packaging signal区的反向引物)序列为：5’-CTTCAGCAAGCCGAGTCCT-3’(SEQ ID NO.2)；所述第一探针的序列为：5’-GGGACTTGAAAGCGAAAGGG-3’(SEQ ID NO.3)，所述第一探针的5’端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。
在一些实施方式中，所述内参基因的正向引物为SEQ ID NO.4，反向引物为SEQ IDNO.5，第二探针为SEQ ID NO.6。具体来讲，所述内参基因的正向引物的序列为：5’-CTCCCCACACACATGCACTTA-3’(SEQ ID NO.4)，所述内参基因的反向引物序列为：5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’(SEQ ID NO.5)；所述第二探针序列为：5’-AAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-3’(SEQ ID NO.6)，所述第二探针5’端标记为VIC荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。
在一些实施方式中，所述用于检测引物扩增效率的基因序列为：AAGCGTGTCAATTCTTAGCGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATCAAAGCCCTGGGACTAGGGGGTTAAAATACAGCTTCCAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGTAGGCCCACAAGACTTTT(SEQ ID NO.7)。本实施例中用于检测引物扩增效率的基因序列同时包含CAR-T细胞的目的基因(慢病毒基因)序列及内参基因序列且拷贝数之比为1。
在一些实施方式中，所述PCR反应的反应程序为：第一阶段，95℃预变性10分钟，1个循环；第二阶段，95℃变性15秒，65℃延伸1分钟，共40个循环。
下面通过具体实施例对本发明一种运用数字PCR技术检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法做进一步的解释说明：
实施例1
1、主要仪器设备包括：超净工作台、微滴式数字PCR仪系列、台式离心机、旋涡混悬器、Nanodrop超微量分光光度计；
2、主要用到的试剂包括：细胞基因组提取试剂盒(QIAGEN)、HPLC纯化的PCR引物及探针(GeneScript)，用于检测引物扩增效率的DNA片段((GeneScript)、ddPCR Supermixfor Probes(No dUTP)、Droplet Generation Oil、TE Buffer。
3、所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法具体包括以下操作：
1)、提取样本：在无菌环境中取CAR-T细胞样本悬液以及未感染的T细胞悬液，使用QIAGEN生产的细胞基因组提取试剂盒分别提取CAR-T细胞样本以及未感染的T细胞的基因组，将提取的基因组使用Nanodrop仪器进行DNA浓度和纯度分析；
2)、制备PCR液：PCR反应体积为20μL，其中包括10μL 2×Super Mix PCR reactionbuffer(Bio-rad公司)，1μL模板DNA(<66ng/μL)，0.4μL的上、下游引物(20μM)，0.2μL的Taqman探针(20μM)，最后用ddH2O补足体积至20μL；
3)、配合Droplet Generation Oil来制备微滴；
4)、进行PCR扩增：第一阶段，95℃预变性10分钟，1个循环；第二阶段，95℃变性15秒，65℃延伸1分钟，共40个循环；
5)、设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比。
6)读取CAR-T细胞基因组及未感染的T细胞的基因组的拷贝数数值。
4、检测样本数据分析：
将用于检测引物扩增效率的DNA片段干粉用TE buffer稀释成不同浓度，根据不同浓度的SEQ ID NO.7的检测值计算扩增效率之比：扩增效率之比＝参照基因内参基因拷贝数/参照基因目的基因拷贝数，取每个浓度重复孔平均值，计算不同浓度间扩增效率的相对标准偏差，在符合条件范围内取其平均值；
将CAR-T细胞及未感染的T细胞提取的样本各设置三个重复，同时设置3个空白对照(不含有任何DNA模板)。根据提取样本的目的基因数和内参基因数以及引物扩增效率之比计算CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数，CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比，例：某样本中CAR-T细胞的基因组目的基因拷贝数检测值为220，基因组内参基因拷贝数检测值为709，扩增效率之比为1.004，则该样本中每个细胞的平均病毒载体拷贝数为2×220/709×1.004＝0.623。
综上所述，本发明针对CAR-T细胞质量控制的需要，分析常用的慢病毒载体序列，设计了可适用于大部分慢病毒载体的引物、探针及用于测定引物扩增效率的标准品序列。利用数字PCR技术配合此引物和探针可对CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数准确定量，为CAR-T细胞治疗产品的有效性和安全性提供保障。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 深圳科诺医学检验实验室
<120> 运用数字PCR技术检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数
<160> 7
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcttcaagtagtgtgtgccc
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttcagcaag ccgagtcct
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggacttgaa agcgaaaggg
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctccccacac acatgcactta
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctagtccca gggctttgatt
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaagagcta ggaaggacag gcaacttggc
<210> 7
<211> 433
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aagcgtgtca attcttagcg gttaaatata gctgctgacc tttctgtagc tgggggcctg 60
ggctggggct ctctcccatc ccttctcccc acacacatgc acttacctgt gctcccactc 120
ctgatttctg gaaaagagct aggaaggaca ggcaacttgg caaatcaaag ccctgggact 180
agggggttaa aatacagctt ccagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 240
tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 300
tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg 360
agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gagggtaggc 420
ccacaagact ttt 433
Claims (7)
1.一种检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，包括步骤：
针对CAR-T细胞中的目的基因设计正向引物、反向引物及第一探针，挑选内参基因的正向引物、反向引物及第二探针；
设计用于检测引物扩增效率的基因序列，将所述用于检测引物扩增效率的基因序列配置成不同梯度浓度的溶液，每份样品检测同时加入目的基因的正向引物、反向引物及第一探针以及内参基因的正向引物、反向引物及第二探针，根据检测的拷贝数之比计算扩增效率之比；
同时培养一批CAR-T细胞以及未感染细胞分别提取DNA，进行DNA浓度和纯度分析后作为待检测组和阴性对照组，并设置不加DNA样品的空白对照，配置PCR反应液，制成微滴后经PCR反应，上机分析得到目的基因拷贝数与内参基因拷贝数；
根据数字PCR仪的读数以及之前获得的扩增效率之比，计算目的基因的拷贝数，所述CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数＝2×目的基因拷贝数/内参基因拷贝数×扩增效率之比。
2.根据权利要求1所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞中的目的基因的正向引物序列为SEQ ID NO.1，所述CAR-T细胞中的目的基因的反向引物为SEQ ID NO.2，所述第一探针序列为SEQ ID NO.3。
3.根据权利要求2所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述第一探针的5’端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述内参基因的正向引物为SEQ ID NO.4，反向引物为SEQ ID NO.5，探针为SEQ ID NO.6。
5.根据权利要求4所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述第二探针的5’端标记为VIC荧光发生基团，3'端标记为TAMRA荧光淬灭基团。
6.根据权利要求1所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述用于检测引物扩增效率的基因序列为SEQ ID NO.7。
7.根据权利要求1所述检测CAR-T细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应程序为：第一阶段，95℃预变性10分钟，1个循环；第二阶段，95℃变性15秒，65℃延伸1分钟，共40个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010296169.1A CN111500690A (zh) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | 一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010296169.1A CN111500690A (zh) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | 一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111500690A true CN111500690A (zh) | 2020-08-07 |
Family
ID=71866456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010296169.1A Pending CN111500690A (zh) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | 一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111500690A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112176037A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-05 | 深圳普瑞金生物药业有限公司 | 检测car-t细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒 |
| CN113913502A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-11 | 深圳因诺免疫有限公司 | 检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法 |
| WO2022079489A1 (en) * | 2020-10-12 | 2022-04-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Determination of cellular kinetics and biodistribution for car-t cells |
| CN114686576A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-07-01 | 武汉科技大学 | 一种用于检测单个car-t细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用 |
| CN114717317A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-08 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 通用的car拷贝数检测剂及其应用和应用方法 |
| CN114958983A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-08-30 | 湖州申科生物技术有限公司 | 分析和检测慢病毒载体介导的目的基因的拷贝数的方法 |
| WO2024046474A1 (zh) * | 2022-09-01 | 2024-03-07 | 南京传奇生物科技有限公司 | 一种检测car拷贝数的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861733A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 宜明细胞生物科技有限公司 | 一种用于检测car-t转导效率的引物、探针和方法 |
| CN105950761A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-09-21 | 安徽未名细胞治疗有限公司 | 一种体内检测car-t细胞数的方法 |
| CN109913535A (zh) * | 2017-12-12 | 2019-06-21 | 上海市刑事科学技术研究院 | 荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法 |
| CN109971836A (zh) * | 2017-12-28 | 2019-07-05 | 上海细胞治疗研究院 | 双重荧光定量pcr测定car拷贝数的方法和试剂盒 |
-
2020
- 2020-04-15 CN CN202010296169.1A patent/CN111500690A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861733A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 宜明细胞生物科技有限公司 | 一种用于检测car-t转导效率的引物、探针和方法 |
| CN105950761A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-09-21 | 安徽未名细胞治疗有限公司 | 一种体内检测car-t细胞数的方法 |
| CN109913535A (zh) * | 2017-12-12 | 2019-06-21 | 上海市刑事科学技术研究院 | 荧光定量检测核基因组拷贝数及人线粒体基因组拷贝数的方法 |
| CN109971836A (zh) * | 2017-12-28 | 2019-07-05 | 上海细胞治疗研究院 | 双重荧光定量pcr测定car拷贝数的方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| ALEXANDER KUNZ ET AL.: "Optimized Assessment of qPCR-Based Vector Copy Numbers as a Safety Parameter for GMP-Grade CAR T Cells and Monitoring of Frequency in Patients", vol. 17, pages 448 - 454 * |
| NILS WETHKAMP ET AL.: "Identification of clinically relevant cytomegalovirus infections in patients with inflammatory bowel disease", vol. 31, no. 3, pages 527 - 538 * |
| NIRALI N SHAH ET AL.: "Clonal expansion of CAR T cells harboring lentivector integration in the CBL gene following anti-CD22 CAR T-cell therapy", vol. 3, no. 15, pages 2319 * |
| 代洋等: "CART免疫疗法中慢病毒拷贝数检测的实验研究", vol. 39, no. 2, pages 1 - 7 * |
| 张丽萍等: "仅有部分慢病毒载体在宿主细胞内发生了功能性整合", 第十四次全国医学遗传学学术会议, pages 1 * |
| 马海燕 等: "应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率", 生命科学研究, no. 5, pages 1 - 2 * |
| 黄黎珍 等: "慢病毒载体法制备转基因动物研究进展", 实验动物与比较医学, no. 1, pages 1 - 3 * |
| 龚永平 等: "微滴式数字PCR绝对定量应用研究进展", 中国预防兽医学报, no. 8, pages 1 - 4 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112176037A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-05 | 深圳普瑞金生物药业有限公司 | 检测car-t细胞目的基因拷贝数的方法、引物对、探针及试剂盒 |
| WO2022079489A1 (en) * | 2020-10-12 | 2022-04-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Determination of cellular kinetics and biodistribution for car-t cells |
| CN113913502A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-11 | 深圳因诺免疫有限公司 | 检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法 |
| CN114958983A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-08-30 | 湖州申科生物技术有限公司 | 分析和检测慢病毒载体介导的目的基因的拷贝数的方法 |
| CN114717317A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-08 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 通用的car拷贝数检测剂及其应用和应用方法 |
| CN114686576A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-07-01 | 武汉科技大学 | 一种用于检测单个car-t细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用 |
| WO2024046474A1 (zh) * | 2022-09-01 | 2024-03-07 | 南京传奇生物科技有限公司 | 一种检测car拷贝数的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111500690A (zh) | 一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 | |
| CN111349719B (zh) | 一种用于新型冠状病毒检测的特异引物及应用 | |
| CN104513865B (zh) | 反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法 | |
| CN113604607A (zh) | 快速检测猫疱疹病毒的era核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法 | |
| CN107557494A (zh) | 鉴别检测猪腹泻冠状病毒的引物及多重rt‑pcr方法 | |
| CN106755329A (zh) | 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒 | |
| CN109517927A (zh) | 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用 | |
| Aubry et al. | “ISA-Lation” of single-stranded positive-sense RNA viruses from non-infectious clinical/animal samples | |
| CN107586886B (zh) | 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法 | |
| WO2022242513A1 (en) | System and method for automatic nucleic acid extraction and quialitative analysis | |
| Hsiao et al. | Detection and genetic characterization of the novel torque teno virus group 6 in Taiwanese general population | |
| CN105349700A (zh) | 一种快速鉴别小鼠细小病毒mvm株与mpv株的hrm检测方法及引物 | |
| CN110904099A (zh) | 一种检测饲料中非洲猪瘟病毒的数字pcr技术及试剂盒 | |
| CN114438265A (zh) | 同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN111500768B (zh) | 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在双重数字pcr的用途 | |
| CN115491431A (zh) | 基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用 | |
| CN113215317A (zh) | 牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字pcr检测引物、探针、试剂盒及其应用 | |
| Ruan et al. | Development and Implementation of a Quadruple RT-qPCR Method for the Identification of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strains | |
| CN111575403A (zh) | 一种检测rna病毒核酸的高通量数字pcr试剂盒及检测方法 | |
| CN112063757A (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用 | |
| Ly et al. | Application of droplet digital PCR to validate rift valley fever vaccines | |
| CN111979355A (zh) | 一种大黄鱼虹彩病毒的TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法 | |
| CN105224824A (zh) | 基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法 | |
| CN110747261A (zh) | 一种四环素类抗生素抗性基因tetX的特异性引物、检测方法和应用 | |
| CN111440901B (zh) | 一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的pcr-hrm引物、方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |