CN105858894A - 一种氮丰度转换处理高氨氮废水的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用兼养微生物氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，使用预培养获得或从培养体系中收获的微生物细胞如微藻、光细菌和其他化能细菌等，在丰氮培养基中进行快速培养积累兼养微生物细胞，接着收获该兼养微生物并转入限氮培养基中进行限氮培养2‑4天，最后转入高氨氮废水中并在光照条件下进行自养生长，由于兼养微生物在限氮过程中需要合成脂质体用于保存能量，同时降解叶绿体等细胞器，因此在光照条件下转丰氮过程中，需要大量的氨氮营养源用于合成叶绿素和其他光合作用需要的组件，从而能高效去除废水中的高浓度氨氮，达到净化废水的目的。

Description

一种氮丰度转换处理高氨氮废水的方法
技术领域
本发明涉及环境治理技术领域，特别涉及一种利用兼养微生物氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，具体来说就是使用预培养获得或从培养体系中收获的微生物细胞如微藻、光细菌和其他化能细菌等，在丰氮培养基中进行高密度培养积累兼养微生物细胞，接着收获该兼养微生物并转入限氮培养基中进行限氮诱导培养2-4天，最后转入高氨氮废水中并在光照条件下进行自养生长，从而高效去除废水中的高氨氮的过程。
背景技术
高氨氮废水净化是世界范围的一大难题，传统活性污泥法通过硝化-反硝化去除氨氮，通常因碳源不足需外加有机碳源，曝气设备建设运营、有机碳源的投加均增加了废水处理成本。氨氮是微藻最易利用的氮源形式，微藻通过光合作用自养生长时，吸收氨氮不需有机碳源也无需曝气，较活性污泥法优势明显。提高微藻产量可降低生物燃料制取成本；提高微藻接种浓度可提高污水净化***的抗冲击负荷及氨氮去除效果。自养、兼养、异养是微藻的三种营养模式，大多数微藻只能自养，部分可兼养和异养。与传统自养相比，异养、兼养通常可显著提高微藻产量，具有重大现实意义。
氮是影响微藻生长的重要元素，氮饥饿时微藻中含氮化合物如蛋白质、核酸、叶绿素等的合成受抑制，生长减缓甚至停滞，同时碳代谢途径由蛋白质合成转向脂质或淀粉合成。
氮是影响微藻生长的重要营养元素，一般而言，在氮饥饿条件下，微藻对细胞生长所需的含氮化合物诸如蛋白质、核酸、叶绿素等的合成受到抑制，而这些物质又为微藻细胞生长、***所必须，导致微藻生长显著减缓甚至停滞。与此同时，碳的代谢途径由蛋白质合成转向脂质或淀粉合成，以储备碳源和能量。然而，以往研究都集中于以制备生物燃料为目的有关氮饥饿对微藻生长和油脂或淀粉积累的影响。高等作物和海洋浮游藻类由氮饥饿恢复至丰氮后，具有比始终丰氮时吸收更多氮的倾向，但已有研究仅关注氮饥饿后微藻的生长及细胞组成的变化，对从氮饥饿恢复到丰氮后微藻的生长及氮元素吸收能力却鲜有涉及。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用兼养微生物氮丰度转换处理高氨氮废水的方法。由于兼养微生物从限氮培养转丰氮培养过程中，需要大量的氨氮营养源合成叶绿素及其他光合作用需要的组件从而开发一种简单高效、成本低廉的高效高氨氮废水处理方法。
本发明中的兼养微生物属于既能在光照条件下进行光合作用又能在黑暗条件下进行化能作用、体积微小的微生物，由于兼养微生物在限氮过程中需要合成脂质体用于保存能量，同时降解叶绿体等细胞器，因此在光照条件下转丰氮过程中，需要大量的氨氮营养源用于合成叶绿素和其他光合作用需要的组件，从而能高效去除废水中的高浓度氨氮，达到净化废水的目的。
本发明采用如下技术方案：
本发明的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法是使用预培养获得或从培养体系中收获的兼养微生物细胞，加入到丰氮培养基中进行高密度培养，然后收获兼养微生物细胞并转入限氮培养基中诱导培养2-4天，收获的细胞再转入高氨氮废水中，并在光照条件下进行自养生长，从而去除废水中的高浓度氨氮，到达净化废水的目的。
所述的兼养微生物是既能利用光合作用和无机碳源进行自养生长，又能在黑暗条件下利用有机碳源进行异养生长，还能在光照条件下同时利用无机和有机碳源进行兼养生长的微生物。
所述的兼养微生物是微藻或光合细菌。
所述的微藻是小球藻属(Chlorella sp.)、筒柱藻属(Cylindrotheca sp.)、硅藻(Diatom)、菱形藻(Nitzschia sp.)、裂壶藻(Schizochytrium sp.)、杜氏藻属(Dunaliella)、栅藻(Scenedesmus sp.)、微绿球藻(Nannochloris sp.)、衣藻属(Chlamydomonas sp.)、扁藻(Tetraselmis sp.)或空球藻属(Eudorina sp.)；所述的光合细菌是蓝细菌(Cyanobacteria)；所述的蓝细菌(Cyanobacteria)是聚球蓝细菌属(Synechococcus)、大颤蓝菌属(Oscillatoria)、紫色细菌如红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或红微菌属(Rhodomicrobium)。
所述的丰氮培养基是含氮量在0-4000mg/L的培养基；所述的丰氮培养基是人工培养基或丰氮废水；所述的人工培养基包括自养培养基、混养培养基和异养培养基，所述混养和异养培养基的有机碳源浓度初始还原糖浓度范围为0.01-200g.L-1。所述的人工培养基优选是BG-11培养基、F/2培养基、walne培养基或TAP培养基。
所述的高氨氮废水是市政废水、工农业废水、食品废水、生活废水、造纸厂废水、糖蜜废水、啤酒厂废水，奶制品加工厂废水、沼气发酵废水或动物粪便废水。
所述高密度培养和诱导培养的pH范围为0.1-10；所述培养的温度范围为4-45℃。
本发明的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法的具体步骤如下：
(1)兼养微生物的转接：
从-70℃冰箱取出冻存兼养微生物菌株并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照自养、混养或异养培养；
所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳；光照培养氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始浓度介于1-15g.L-1，优选4g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300L/h，优选80-120L/h；CO2浓度0.9-3％，培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50-400小时，优选120-200小时；
所述的混养和异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200g.L-1，优选20g.L-1；通入空气，通气量100-400L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时；
(2)兼养微生物在富含有机碳的丰氮废水或自养、混养和异养培养 基中高密度异养培养：
将平板培养物接种至生物反应器培养，在在富含有机碳的废水或混养和异养培养基中高密度异养培养；生物反应装置包括摇瓶、通气瓶、光生物反应器、发酵罐或开放培养池；直到细胞对数生长期，细胞密度达到106-1010以上；
所述的混养和异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200g.L-1，优选20g.L-1；通入空气，通气量100-400L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时；
(3)兼养微生物细胞的收获：
取对数生长后期或稳定期的异养细胞，低转速(800-2000g)离心收获，收获的兼养微生物细胞用无菌水冲洗两次，然后再次收获；(4)收获的兼养微生物细胞转接到限氮培养基进行限氮培养：
收获的兼养微生物细胞按1:1至1:100的比例加入限氮培养基进行限氮诱导培养2-4天；
所述的限氮诱导培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳；光照培养氮源为氨氮，其初始浓度介于40-160mg.L-1，优选80mg.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300L/h，优选80-120L/h；CO2浓度0.1-15％，培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于4-400小时，优选12-48小时；
(5)限氮培养的微藻细胞高效吸收高氨氮营养物并净化废水：
将收获的限氮细胞转入高氨氮废水培养，吸收高浓度氨氮并净化废水。
本发明的积极效果如下：
本发明是通过氮丰度转化策略，由于兼养微生物从限氮诱导培养转自养丰氮培养过程中，需要大量的氨氮合成叶绿素及其他光合作用需要的组件从而开发一种简单高效、成本低廉的生物高效处理高浓度氨氮废水方法。该工艺可以用来进一步满足大规模工业化废水处理并大大降低成本。
本发明的有益效果在于本发明引入了改变氮丰度营养代谢途径的方法，用来处理高氨氮废水。处理完的废水又可以回收利用，满足了微藻工业化处理废水应用的要求，是一条经济、高效地制微藻污水处理的新途径。收获的微藻细胞可以进一步处理用于生物能源和动物饲料等的制备。
附图说明
图1为小球藻(Cholorella sorokiniana)在自养、异养、兼养(混养)下的生长特性。
图1a代表小球藻Cholorella sorokiniana在自养和混养培养基中生长曲线图，P代表自养培养，M代表混养培养，M1-M50代表混养培养时有机碳的浓度。从图1a可以看出，相同时间内混养细胞生物量远远高于自养培养生物量。且有机碳浓度与混养生物量成正比；
图1b代表代表小球藻Cholorella sorokiniana在异养培养基中的生 长曲线图。其中H代表异养培养，H1-H50代表异养培养时有机碳的浓度。从图1b可以看出，相同时间内自养细胞生物量远远高于自养培养生物量，与混养生物量相当。且有机碳浓度与自养生物量成正比；因此采用混养和异养高密度培养很快速积累微藻生物量用于下一步实验。
图2小球藻(Cholorella sorokiniana)在自养、异养、兼养下丰氮和限氮的细胞透射电镜图；
(a)原种自养NS,M组，其中NS,M代表丰氮混养培养，原种自养指在初始培养微藻时用的是自养培养基；(b)原种自养NS,H组，其中NS,H代表丰氮异养培养，原种自养指在初始培养微藻时用的是自养培养基；(c)原种异养NS,M组，其中NS,M代表丰氮混养培养，原种异养指在初始培养微藻时用的是异养培养基；；(d)原种异养NS,H组，其中NS,H代表丰氮异养培养，原种异养养指在初始培养微藻时用的是异养培养基；。从图2可以看出，自养培养过程中，可以观察到叶绿体，脂质颗粒很小且不明显，在混养和异养培养中，叶绿体消失，脂质颗粒明显，且能观察到淀粉颗粒。说明采用混养和异养培养积累细胞并采用限氮诱导的方法能快速去除高氨氮废水。
图3氮丰度转化过程中NH4+-N浓度的变化；
(a)混养和异养高密度和限氮培养过程中中NH4+-N浓度的变化。其中NS，M为丰氮混养高密度培养；NS，H为丰氮异养高密度培养；ND，M为限氮混养培养；ND，H为限氮异养培养；(b)高NH4+-N废水浓度的变化，起始NH4+-N浓度80mg/L；(c)高NH4+-N废水浓度的变 化，起始NH4+-N浓度160mg/L。从图3可以看出，采用本发明的氮丰转换的方法在初始浓度为80mg/L的氨氮废水中氨氮去除率最高可达12.4mg/L/d；在初始浓度为160mg/L的氨氮废水中氨氮去除率最高可达19.1mg/L/d。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1
高氨氮耐受藻株—小球藻(Cholorella sorokiniana)本地筛选，该藻株既能在光合作用的自养生长，又能在黑暗条件下异养生长，还能同时在上述条件下混养生长。其自养、异养和混养条件下的生长特性如图1所示。
其中自养培养基配方为：K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，EDTA 0.001g/L，NaNO3 1.5g/L，Na2CO3 0.02g/L，A5微量元素液1.5ml/L，其中A5微量元素液组成：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，和CoCl2·6H2O 0.05g/L.其中NH4Cl的浓度为40mg/L,80mg/L和160mg/L。
异养培养基配方同上，并加入不同有机碳源至初始还原糖浓度为0.1-200g.L-1，最优15g.L-1。
混养培养基配方同上，并加入不同有机碳源和无机碳源，有机碳源至初始还原糖浓度为0.1-200g.L-1，最优15g.L-1。无机碳源为 0.001％-100％CO2，最优2％，或无机碳NaHCO3或Na2CO3或两者的混合，浓度为0.1-100g.L-1，最优0.2g.L-1。
高氨氮废水配方如下：NaCl 0.007g/L，MgSO4·7H2O 0.002g/L，CaCl2·2H2O 0.004g/L，KH2PO4 0.0085g/L，K2HPO4 0.0217g/L，Na2HPO4 0.025g/L，微量金属溶液0.1ml/L，其中A5微量金属溶液组成：H3BO3 5.7g/L，MnCl2·4H2O 2.5g/L，ZnSO4·7H2O 11g/L，FeSO4·7H2O 2.5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.15g/L，Na2EDTA 25g/L，和CoCl2·6H2O 0.8g/L.
最后调节加入不同量的NH4Cl调节培养基氨氮的浓度，使氨氮的浓度在80mg/L。
通过步骤1中所描述的方法，于-70℃冰箱中接种小球藻细胞到固体平板培养中活化藻株，然后将生长在固体培养基上的小球藻单菌落接种至250mL摇瓶中摇床培养，温度控制在28℃±5℃；当细胞进入对数生长末期后，接入丰氮且富含有机碳废水或人工培养基在生物反应装置中进行高密度自养、异养和混养培养。生物反应装置包括摇瓶、通气瓶、各种光生物反应器、发酵罐和开放培养池等。在上述适宜条件培养，直到细胞对数生长期，细胞密度达到(106-1010以上)。最后取对数生长后期或稳定期的微藻细胞，低转速(＜8000r/min)离心收获，收获的兼养微生物细胞用无菌水冲洗两次。收获的兼养微生物细胞按一定的比例加入限氮培养基进行限氮诱导培养2-4天，然后收获，再转入高氨氮废水中进行自养培养，结果显示采用本发明的利用兼养微生物丰氮转换处理高氨氮废水的方法，在初始浓度为80mg/L的高氨氮废水中氨氮去除率最高可达12.4mg/L/d(如图3c所示)。
实施例2
南昌本地某市政废水处理厂收集的高氨氮废水，其总氮浓度在178mg/L，氨氮浓度为160mg/L。首先采用以上方法依次进行高密度培养、收获、限氮培养和收获微藻细胞，然后再转入高氨氮废水中进行自养培养，结果显示采用本发明的利用兼养微生物丰氮转换处理高氨氮废水的方法，在初始浓度为160mg/L的高氨氮废水中氨氮去除率最高可达19.1mg/L/d(如图3c所示)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的方法是使用预培养获得或从培养体系中收获的兼养微生物细胞，加入到丰氮培养基中进行高密度培养，然后收获兼养微生物细胞并转入限氮培养基中诱导培养2-4天，收获的细胞再转入高氨氮废水中，并在光照条件下进行自养生长，从而去除废水中的高浓度氨氮，到达净化废水的目的。
2.如权利要求1所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的兼养微生物是既能利用光合作用和无机碳源进行自养生长，又能在黑暗条件下利用有机碳源进行异养生长，还能在光照条件下同时利用无机和有机碳源进行兼养生长的微生物。
3.如权利要求1所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的兼养微生物是微藻或光合细菌。
4.如权利要求3所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的微藻是小球藻属(Chlorella sp.)、筒柱藻属(Cylindrotheca sp.)、硅藻(Diatom)、菱形藻(Nitzschia sp.)、裂壶藻(Schizochytrium sp.)、杜氏藻属(Dunaliella)、栅藻(Scenedesmus sp.)、微绿球藻(Nannochloris sp.)、衣藻属(Chlamydomonas sp.)、扁藻(Tetraselmis sp.)或空球藻属(Eudorina sp.)；所述的光合细菌是蓝细菌(Cyanobacteria)；所述的蓝细菌(Cyanobacteria)是聚球蓝细菌属(Synechococcus)、大颤蓝菌属(Oscillatoria)、紫色细菌如红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或红微菌属 (Rhodomicrobium)。
5.如权利要求1所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的丰氮培养基是含氮量在0-4000mg/L的培养基；所述的丰氮培养基是人工培养基或丰氮废水；所述的人工培养基包括自养培养基、混养培养基和异养培养基，所述混养和异养培养基的有机碳源浓度初始还原糖浓度范围为0.01-200g.L-1。
6.如权利要求5所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的人工培养基是BG-11培养基、F/2培养基、walne培养基或TAP培养基。
7.如权利要求1所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述的高氨氮废水是市政废水、工农业废水、食品废水、生活废水、造纸厂废水、糖蜜废水、啤酒厂废水，奶制品加工厂废水、沼气发酵废水或动物粪便废水。
8.如权利要求1所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述高密度培养和诱导培养的pH范围为0.1-10；所述培养的温度范围为4-45℃。
9.如权利要求1所述的氮丰度转换处理高氨氮废水的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)兼养微生物的转接：
从-70℃冰箱取出冻存兼养微生物菌株并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照自养、混养或异养培养；
所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳；光照培养氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始浓度介于1-15g.L-1，优选4g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300L/h，优选80-120L/h；CO2浓度0.9-3％，培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50-400小时，优选120-200小时；
所述的混养和异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200g.L-1，优选20g.L-1；通入空气，通气量100-400L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时；
(2)兼养微生物在富含有机碳的丰氮废水或自养、混养和异养培养基中高密度异养培养：
将平板培养物接种至生物反应器培养，在在富含有机碳的废水或混养和异养培养基中高密度异养培养；生物反应装置包括摇瓶、通气瓶、光生物反应器、发酵罐或开放培养池；直到细胞对数生长期，细胞密度达到106-1010以上；
所述的混养和异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200g.L-1，优选20g.L-1；通入空气，通气量100-400L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制 在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时；
(3)兼养微生物细胞的收获：
取对数生长后期或稳定期的异养细胞，低转速(800-2000g)离心收获，收获的兼养微生物细胞用无菌水冲洗两次，然后再次收获；
(4)收获的兼养微生物细胞转接到限氮培养基进行限氮培养：
收获的兼养微生物细胞按1:1至1:100的比例加入限氮培养基进行限氮诱导培养2-4天；
所述的限氮诱导培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳；光照培养氮源为氨氮，其初始浓度介于40-160mg.L-1，优选80mg.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300L/h，优选80-120L/h；CO2浓度0.1-15％，培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于4-400小时，优选12-48小时；
(5)限氮培养的微藻细胞高效吸收高氨氮营养物并净化废水：
将收获的限氮细胞转入高氨氮废水培养，吸收高浓度氨氮并净化废水。
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