CN109251866B - 一株衣藻藻株及其在沼液净化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一株衣藻藻株，其保藏编号为：CGMCC NO.15497。本发明还提出所述的衣藻藻株在沼液净化中的应用。本发明提出的保藏编号为CGMCC NO.15497的衣藻，在适宜的培养条件下，可在猪粪沼液中生长，利用猪粪沼液中的污染物氨氮作为自身生长氮源，利用猪粪沼液中的污染物总磷作为自身生长磷源，对猪粪沼液起到脱氮除磷的净化作用。与其他商业藻种库购买的衣藻藻株相比，本发明的保藏编号为CGMCC NO.15497的衣藻无论是在生物量的积累上还是在对猪粪沼液脱氮除磷的效果上都具有明显优势。

Description

一株衣藻藻株及其在沼液净化中的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种衣藻及其在沼液净化中的应用。

背景技术

采取沼气工程技术处理禽畜废弃物，收获能源的同时，实现了污染治理,能够获得环保和经济等多重效益，是解决畜禽粪便污染问题的有效手段。但是,大中型沼气工程的发展本身也面临着诸多环境问题，这其中畜禽粪污厌氧发酵后产生的沼液如何处理利用的问题尤为显著。大中型沼气工程每天产生的沼液量十分可观，只经过厌氧处理的沼液，其中仍含有大量的氮、磷等营养成分,直接排入水体易引起富营养化,造成二次污染。同时，大多数大中型沼气工程多数建在市郊,沼液的就地消纳有一定的难度，且一次性消纳远超过农作物施肥的一般规律，若远距离输送,又存在能耗大,成本高的问题。因此,如何就地对沼液进行低成本的、深度的处理,是发展大中型沼气工程亟待解决的主要问题之一。

沼液是厌氧发酵后残留的液体，主要包括发酵过程中分解释放的有机、无机盐类，如铵盐、钾盐、磷酸盐等可溶性物质，总固体含量小于1％。与沼渣相比，沼液中的养分主要是速效性养分，据研究显示，畜禽粪污沼液中不仅含有丰富的氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰等中微量元素，还含有吲哚乙酸、细胞***素、赤霉素等植物生长调节物质以及喹啉酮、糖类、维生素、多胺等生物活性成分，因此，沼液虽然本身是一种废水，但是如果合理加以利用，它也是一种营养成分十分丰富的资源。

微藻是一种可快速生长繁殖的光合自养水生微生物，它光合效率高，细胞结构简单，适应环境的能力强，对环境中营养元素利用率高，且培养微藻不需要占用耕地面积。微藻生物质既可以作为生物燃油、生物天然色素(类胡萝卜素、虾青素、藻蓝蛋白等)的提炼原料，又可以加工成人类的保健食品和动物饲料、水产饵料，还能够用作有机缓释肥施于土壤中促进作物生长，因而是一种附加值高、用途广泛的微生物原料。人工培养微藻需要含有充足的碳、氮、磷等营养元素的液体培养基，而一些有机废水中的营养成分与微藻培养基类似，因而利用废水培养微藻迅速成为了微藻生物技术研究中的热点。微藻培养除了需要大量的营养盐以外，还需要消耗大量的水资源，微藻培养基的成本占到微藻培养总成本的30％-60％。利用沼液培养微藻，微藻可以吸收沼液中的碳、氮、磷等营养元素促进自身生长，在此过程中对沼液起到净化的作用。

利用微藻净化畜禽沼液，其中一项重要的技术难点在于，寻找针对特定沼液具有良好耐受性的微藻藻株，该藻株可以在一定浓度范围内的特定沼液中生长，摄取沼液中的氮磷污染物作为自身的营养源，并对沼液中的氨氮、病原微生物、养殖饲料药物残留等有毒有害的物质具有耐受性。

发明内容

针对上述背景中提到的问题，本发明从被猪粪沼液污染过的土壤环境中分离、纯化而获得一株野生微藻，该株微藻可以在猪粪沼液中生长，并摄取猪粪沼液中的氮磷等污染物作为自身的氮磷营养源以促进藻体细胞生长，同时能够对猪粪沼液起到良好净化的作用。同时，对猪粪沼液中的有毒有害物质具有一定的耐受性；即，本发明的第一个目的是提出一种衣藻藻株。

本发明的第二个目的是提出所述衣藻藻株的应用。

实现本发明目的的技术方案为：

一株衣藻(Chlamydomonas sp.)藻株，保藏编号为：CGMCC NO.15497。

上述衣藻藻株，于2018年3月29日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

所述的衣藻藻株在沼液净化中的应用。

一种沼液净化的方法，采用所述的衣藻藻株，包括：

以藻种干重0.01～0.1g/L的接种量将所述衣藻藻株的培养液接种于沼液中，所述沼液的COD为200～800mg/L，氨氮为40～150mg/L，总磷为10～50mg/L，悬浮固体为0～500mg/L，pH值为7.5～8.5。

接种量中，g是指微藻的干重，用烘干比重法可测得；L是指微藻的培养体积，液体成分主要是沼液，微藻细胞可视作固体颗粒。

进一步地，以藻种干重0.02～0.05g/L的接种量将所述衣藻藻株的培养液接种于沼液中。

如果是在人工培养基中对微藻进行纯培养，那么为了尽量获得多的生物量，一般接种量在0.02～0.03g/L左右。但是接种到沼液里面，考虑到沼液中各种复杂物质对微藻的冲击，需适当提高接种量，不然接种量跟纯培养一样的话很可能微藻耐受不了沼液就死了。我们进行多次实验后确定的优化值在0.03～0.05g/L左右。

其中，所述衣藻藻株的培养液，是将所述衣藻藻株在液体培养基中培养至对数生长期而得的；接种量为0.02～0.025g/L液体培养基；和/或，所述液体培养基为BG11。

其中，所述衣藻藻株在液体培养基中培养的条件为：照强度为100～300μmol/m²/s，光周期为光暗比(12～18):(6～12)，温度为15～30℃。

优选地，所述衣藻藻株在液体培养基中培养的条件为：光照强度为170～190μmol/㎡/s，光周期为光暗比18:6，温度为26±0.5℃。

其中，所述衣藻藻株在液体培养基中培养时，每天摇动培养容器2～4次。

本发明一种优选技术方案为，所述的方法包括步骤：

1)猪粪沼液经过预处理，达到COD 200～800mg/L，氨氮40～150mg/L，总磷10～50mg/L，悬浮固体0～500mg/L，pH值为7.5～8.5的条件；

2)加入所述衣藻藻株的培养液进行生长，生长的条件为：光照强度为100～200μmol/㎡/s，光周期为光暗比(12～20)：(4～12)，温度为24～28℃。

其中，所述预处理为絮凝和气浮处理，猪粪沼液经过预处理，达到COD 300～450mg/L，氨氮840～120mg/L，总磷20～30mg/L，悬浮固体0～300mg/L，pH值为8.0～8.5的条件。

絮凝和气浮处理可采用本领域已有的处理方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的保藏编号为CGMCC NO.15497的衣藻，在适宜的培养条件下，可在猪粪沼液中生长，利用猪粪沼液中的污染物氨氮作为自身生长氮源，利用猪粪沼液中的污染物总磷作为自身生长磷源，对猪粪沼液起到脱氮除磷的净化作用。与其他商业藻种库购买的衣藻藻株相比，本发明的保藏编号为CGMCC NO.15497的衣藻无论是在生物量的积累上还是在对猪粪沼液脱氮除磷的效果上都具有明显优势。

附图说明

图1为本发明衣藻藻株CGMCC NO.15497在光学显微镜下的细胞形态(目镜10倍×物镜40倍)。

图2为本发明中基于衣藻藻株CGMCC NO.15497构建的***发育树。

图3为本发明分离纯化获得的衣藻藻株CGMCC NO.15497与另外两株从商业藻种库随机购买的莱茵衣藻藻株FACHB-265和衣藻藻株FACHB-1935在猪粪沼液中20天内的生长对比图。

图4为本发明分离纯化获得的衣藻藻株CGMCC NO.15497与另外两株从商业藻种库随机购买的莱茵衣藻藻株FACHB-265和衣藻藻株FACHB-1935两株微藻在猪粪沼液中20天内对氨氮去除的对比。

图5为本发明分离纯化获得的衣藻藻株CGMCC NO.15497与另外两株从商业藻种库随机购买的莱茵衣藻藻株FACHB-265和衣藻藻株FACHB-1935两株微藻在猪粪沼液中20天内对总磷去除的对比。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。

本领域技术人员应当知晓，以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：藻株的分离、纯化及保藏

(1)样品采集

本发明所涉及的藻株是从北京市平谷区大兴庄镇西柏店村沼气服务站内经猪粪厌氧消化沼液污染过的土壤中取样分离得到的。从选定地点土壤表层采集土样，置于密封袋中，放在4℃冰箱内保存备用。

(2)藻株分离、纯化及藻株培养

取约0.5g土壤样品于24孔组织培养皿中，并加入BG11液体培养基(BG11培养基具体组成如表1所示)置于环境参数可调节的光照培养箱中进行藻种富集培养，培养3-4天后，培养基颜色可以明显看到由无色变为淡绿色。然后在BG11固体平板培养基(经灭菌处理的BG11液体培养基加入1.5％-2％的琼脂粉制备而得)上利用平板划线法进行分离纯化，直至平板中藻落单一，然后挑取无菌的单藻落接种到液体BG11培养基中，置于光照培养箱中培养。用光学显微镜观察经培养后的微藻藻株是否细胞形态一致，若一致则达到分离的目的，若不一致则重复平板划线的工作，直至细胞形态单一。

藻株培养阶段所使用的培养容器为100mL锥形瓶(有效培养体积为50mL)，BG11液体培养基，培养条件为温度28±0.5℃，光照强度150μmol/m²/s，光照周期12:12，每天人工摇瓶三次。

表1 BG11培养基配方及用量

藻株的鉴定

藻株的鉴定分两个步骤进行，首先进行形态学初步观察，然后再进行分子生物学鉴定。使用光学显微镜对分离纯化的微藻藻株进行观察并照相(10倍目镜×40倍物镜)。观察该藻株的细胞形态、大小、结构等特征。光学显微镜观察下的藻株形态附图1所示。

本发明分离纯化获得的这株微藻，在显微镜下观察其生物学特性为，藻体呈绿色，单细胞，细胞呈球形或卵形，前端有两条等长的鞭毛，能游动。

对该微藻进行分子生物学鉴定，以提取的DNA为模板，使用DNAMAN和Primer 5.0软件设计引物，(引物序正向5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，反向5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。对ITS基因进行PCR扩增，建立PCR反应体系均为50μL。其中DNA模板1μL，正反引物各1μL，dNTP4μL，5×Q5反应缓冲溶液10μL，Q5DNA聚合酶0.5μL，5×Q5High GC Enhancer 10μL。ITS基因PCR扩增程序为：94℃预变性30s，然后98℃变性5s，52℃退火30s，68℃延伸75s，共30个循环，最后68℃延伸5min。该过程委托北京艾普希隆生物科技有限公司测序。将所得序列在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLAST进行同源检测，跟藻种库中已有藻种基因进行比对，最后确定其种属。对藻株进行PCR扩增后，得到ITS的片段。测序后得到其ITS片段的长度为694bp。将此序列与NCBI数据库进行同源性分析，发现其与衣藻(Chlamydomonas sp.)的亲缘关系最近，同源性达到99％。使用MEGA5.10对ITS序列构建***发育树，结果如图2所示。

藻株的保藏

上述经分离纯化获得并鉴定的衣藻藻株，于2018年3月29日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.15497。

实施例2藻株最适培养条件探究

在获得足够生物量的上述微藻藻种后，为探究其适宜的培养条件，本发明对光照强度、光周期、温度、接种量四个微藻培养常见的技术参数进行了单因素试验—正交试验—响应面试验等一系列优化研究，设置的参数是光照强度：100、150、200、250、300(μmol/㎡/s)，光周期(光/暗比)：12/12、14/10、16/8、18/6；温度：15℃、20℃、25℃、30℃；纯培养接种量(藻种培养基培养)：0.015g/L、0.020g/L、0.025g/L、0.030g/L，发现最优为0.025g/L。同样的试验方式、设置沼液培养接种量(藻种用于净化猪粪沼液的培养)：0.020g/L、0.030g/L、0.040g/L、0.050g/L，试验发现最优接种量为0.041g/L。

最终得到该株微藻的最适培养条件为光照强度为180μmol/㎡/s，光周期为18:6(光:暗)，温度为26±0.5℃，接种量为0.022g/L。该阶段使用的培养容器为250mL锥形瓶(有效培养体积为150mL)，BG11液体培养基，置于环境参数可调的光照培养箱内，每天人工摇瓶三次。

为探究上述分离、纯化、保藏的衣藻藻株CGMCC NO.15497在净化猪粪沼液方面的潜力，本发明开展了利用真实猪粪沼液培养衣藻藻株CGMCC NO.15497的试验研究。在该试验研究中，除了本发明所述的衣藻CGMCC NO.15497藻株外，还研究了另外两株(对比例1、对比例2)从商业藻种库随机选择购买的衣藻藻株净化猪粪沼液的能力及其在猪粪沼液中的生长状况，以期与本发明所述的藻株进行对比。

实施例3和对比例中，每天取样6mL的培养液测定生物量及水质。所有试验组均设置三个重复。

实施例3：应用衣藻藻株CGMCC NO.15497净化猪粪沼液

(1)试验材料

本试验所用猪粪沼液取自北京市平谷区大兴庄镇西柏店村沼气服务站沼液储存罐内，因该储存罐中的原沼液中含有较高浓度的氨氮(＞900mg/L)和大量的悬浮固体(700-800 mg/L)，对原沼液进行了絮凝—气浮的预处理，使得氨氮浓度和悬浮固体浓度降到微藻能够耐受的程度。经过预处理的猪粪沼液的水质如表2所示。

表2经预处理后的猪粪沼液水质

本试验用的藻株为上述的本发明分离、纯化的衣藻藻株CGMCCNO.15497，采用实施例2优化的最适培养条件，在BG11培养基中培养至对数生长期后用于本试验研究。

(2)试验方法

处于对数生长期的微藻投加到250mL锥形瓶(有效培养体积150mL)中并添加猪粪沼液作为微藻培养基，置于环境参数可调的光照培养箱中培养，具体培养条件为:接种量0.041g/L光照强度150μmol/m²/s，光周期18:6(光:暗)，温度26±0.5℃。所有试验组共培养20天，每天人工摇瓶三次。

对比例1

本对比例用的藻株为从中国科学院武汉水生所淡水藻种库随机选择购买的莱茵衣藻藻株FACHB-265，采用实施例2优化的最适培养条件，BG11培养基中培养至对数生长期后用于本试验研究。

对比例2

本对比例用的藻株为从中国科学院武汉水生所淡水藻种库随机选择购买的衣藻藻株FACHB-1935。采用和实施例2优化的最适培养条件在BG11培养基中培养至对数生长期后用于本试验研究。

试验结果

三株微藻在猪粪沼液中的生长状况如图3所示。20天的培养时间内，莱茵衣藻藻株FACHB-265与本发明分离、纯化的衣藻藻株CGMCC NO.15497均可以在猪粪沼液中生长，但是生长能力差异明显。其中，衣藻藻株CGMCC NO.15497在猪粪沼液中的生长效果更好，第20天生物量可达到0.583g/L，而莱茵衣藻藻株FACHB-265在第20天生物量仅能达到0.450g/L。衣藻藻株FACHB-1935则在猪粪沼液中受到明显的抑制，培养初期尚能缓慢生长，从试验的第9天开始，细胞开始逐渐衰亡，生物量亦随之下降。试验结果表明，与商业藻种库随机选择购买的衣藻藻株相比，本发明分离纯化获得的衣藻藻株在猪粪沼液中的耐受性最好，积累生物质的能力也最强。

猪粪沼液中氨氮的变化如图4所示。20天的培养时间内，三株微藻对猪粪沼液中的氨氮的去除能力差异明显。其中，本发明分离、纯化的衣藻藻株CGMCC NO.15497对猪粪沼液中氨氮的去除能力最强，20天氨氮的去除率可达97.79％。莱茵衣藻藻株FACHB-265在20天内对猪粪沼液的氨氮去除率为81.33％。而由于衣藻藻株FACHB-1935从培养的第9天开始逐渐衰亡，因而其对猪粪沼液中氨氮的去除最终仅为20.11％。

猪粪沼液中总磷的变化如图5所示。20天的培养时间内，本发明分离、纯化的衣藻藻株CGMCC NO.15497对猪粪沼液中总磷的去除率为90.36％，莱茵衣藻藻株FACHB-265在20天内对总磷的去除率为79.53％，而由于衣藻藻株FACHB-1935从培养的第9天开始逐渐衰亡，因而其对猪粪沼液中氨氮的去除最终仅为18.90％。

综上所述，本发明分离、纯化获得的衣藻藻株CGMCC NO.15497对一定浓度的猪粪沼液具有良好的耐受性，利用猪粪沼液培养该株微藻，可以对猪粪沼液起到良好的净化作用，脱氮除磷的效果显著。与商业藻种库随机购买的两株衣藻相比，本发明涉及的这种从自然环境中分离的野生藻株，在猪粪沼液中的生长能力更好，因而是一种处理猪粪沼液的理想微生物材料，具有广阔的应用前景。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一株衣藻藻株及其在沼液净化中的应用

<130> KHP181115747.5

<141> 2018-10-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一株衣藻藻株(Chlamydomonas sp.)，其特征在于，保藏编号为：CGMCC No.15497。

2.权利要求1所述的衣藻藻株在沼液净化中的应用。

3.一种沼液净化的方法，采用权利要求1所述的衣藻藻株，其特征在于，包括：

以藻种干重0.01～0.1g/L的接种量将所述衣藻藻株的培养液接种于沼液中，所述沼液的COD为200～800mg/L，氨氮为40～150mg/L，总磷为10～50mg/L，悬浮固体为0～500mg/L，pH值为7.5～8.5。

4.根据权利要求3所述沼液净化的方法，其特征在于，以藻种干重0.02～0.05g/L的接种量将所述衣藻藻株的培养液接种于沼液中。

5.根据权利要求3所述沼液净化的方法，其特征在于，所述衣藻藻株的培养液是将所述衣藻藻株按接种量0.02～0.025g/L接种于在BG11液体培养基中培养至对数生长期而得的。

6.根据权利要求5所述沼液净化的方法，其特征在于，所述衣藻藻株在液体培养基中培养的条件为：光照强度为100～300μmol/m²/s，光周期为光暗比12～18:6～12，温度为15～30℃。

7.根据权利要求6所述沼液净化的方法，其特征在于，所述衣藻藻株在液体培养基中培养的条件为：光照强度为170～190μmol/㎡/s，光周期为光暗比18:6，温度为26±0.5℃。

8.根据权利要求4～7任一项所述沼液净化的方法，其特征在于，所述衣藻藻株在液体培养基中培养时，每天摇动培养容器2～4次。

9.根据权利要求3～5任一项所述沼液净化的方法，其特征在于，包括步骤：

1)猪粪沼液经过预处理，达到COD 200～800mg/L，氨氮40～150mg/L，总磷10～50mg/L，悬浮固体0～500mg/L，pH值为7.5～8.5的条件；

2)加入所述衣藻藻株的培养液进行生长，生长的条件为：光照强度为100～200μmol/m²/s，光周期为光暗比12～20：4～12，温度为24～28℃。

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