CN105821155A - 一种与对虾对wssv抗性相关的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种与对虾抗WSSV性状相关的分子标记及其应用。与对虾抗WSSV性状显著相关的分子标记为位于TRAF6基因的DNA序列SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变,利用关联分析方法鉴定出该位点与对虾WSSV的抗性性状显著相关，AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组(P<0.05)，提示AA基因型为抗性优势基因型。本发明标记可以作为对虾抗病育种的分子标记辅助对虾的遗传选育。

Description

一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记及其应用。
背景技术
由对虾白斑综合症病毒(WSSV)引起的对虾白斑综合症是危害我国对虾产业的最为严重的病害之一，该病毒致死率高、感染范围广、传播速率快，每年因该病毒的暴发和流行给对虾产业造成的损失巨大。为了解决该问题，科研人员从病毒本身的特征、病毒入侵机制、机体的免疫防御体系、环境对病毒爆发的影响等多个方面进行了***研究，以解析病毒暴发的过程和机制，为病害防控提供有效的技术指导。同时，遗传育种工作者也试图从遗传选育入手，培育抗WSSV的新品种。
由于对虾WSSV致死率高，因而很难通过攻毒进行性状测试后存活的虾进行留种繁殖下一代，只能通过全同胞或和半同胞的抗性能力来进行选择，这样带来的问题是选择效率低，成本高，且对虾对WSSV抗性的遗传力很低，难以通过传统的遗传选育来培育WSSV抗性品种。通过筛选与抗WSSV性状相关的分子标记，利用该分子标记指导选留抗性个体，能够辅助并加快抗性遗传选育的进程，为抗性品种的培育提供有效的技术手段。
Toll通路是对虾体液免疫的重要信号通路，在对虾的抗菌或抗病毒免疫中起着重要作用。TRAF6基因是Toll信号通路中一个重要因子，在WSSV感染时其表达明显上调，提示其可能通过调节抗菌肽(AMPs)基因的表达参与抗病毒免疫反应(WangP.H.,WanD.H.,GuZ.H.,etal.Litopenaeusvannameitumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6(TRAF6)respondstoVibrioalginolyticusandwhitespotsyndromevirus(WSSV)infectionandactivatesantimicrobialpeptidegenes.DevCompImmunol,2011，35(1):105-114)。
发明内容
本发明的目的是在对虾免疫相关基因TRAF6中与对虾对WSSV抗性相关的分子标记及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，与对虾的抗WSSV性状显著相关的分子标记为位于TRAF6基因的DNA序列SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变。
所述分子标记AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组(P<0.05)，提示AA基因型为抗性优势基因型。
一种用于检测与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的引物对，引物对为：
LvTF6F:TGTCTTCGAACAAATATCACATG和LvTF6R：GGGTTGAAGTATTTTTGCAAGGG。
一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的应用：所述对虾对WSSV抗性相关的分子标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用。
一种辅助抗WSSV品种的选育方法：
1)提取待分析材料的基因组的DNA；
2)以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3所述的引物对进行扩增，根据扩增产物获得SNP位点进行分型，获得分型信息；
3)将上述获得的分型信息中选择A/A基因型个体进行留种和建立家系育种。
本发明所具有的优点：本方法筛选获得的抗WSSV相关的分子标记能够从分子水平上对抗性个体进行选择，可以解决传统选育对于一些难以从表型进行度量的性状进行选择的困难。本发明建立的抗性分子标记辅助抗性遗传选育的方法，操作简单，时间短，为筛选抗性品种提供了一条有效的途径。
具体实施方式
实施例1：对虾TRAF6基因中与抗性相关SNP分子标记的获得1.易感和抗性材料的筛选
选取500尾健康凡纳滨对虾置于12个50L的水族箱中，实验前随机取10尾对虾检测无WSSV感染，实验水温为(23±1)℃。经饥饿处理后，投喂WSSV感染致死的病虾(WSSV病毒含量为104-106copy/ngDNA)。攻毒后每天检查3次(每次间隔6h)并收集死虾，随机取样提取基因组DNA，最早死亡的48尾对虾作为WSSV易感组。至攻毒后第14天，凡纳滨对虾存活情况稳定，取存活的48尾对虾作为WSSV抗性组。
2.基因组DNA提取
凡纳滨对虾DNA的提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒说明进行。分别提取上述抗性组和易感组的个体DNA，将提取获得的DNA使用NanoDrop1000检测DNA浓度和纯度，将经检测DNA浓度>50ng/μl和纯度OD260/280为1.7-1.9的个体DNA再经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测DNA片段完整性的个体，即为合格的DNA样品，在-20℃保存待用。
3.TRAF6基因SNP发掘和基因组DNA序列的获得
TRAF6基因SNP的发掘参考Yuetal(YuY.,WeiJ.,ZhangX.,LiuJ,,LiuC.,LiF.,XiangJ..SNPDiscoveryintheTranscriptomeofWhitePacificShrimpLitopenaeusvannameibyNextGenerationSequencing,PLOSONE,2014,9(1):e87218)文章中所述，通过转录组测序数据挖掘出TRAF6基因中的SNP位点，SNP位点周边的DNA序列利用凡纳滨对虾基因组组装数据获得。
4.TRAF6基因SNP分型
使用SNaPshot多重SNP分型技术平台对TRAF6基因的SNP在抗性组和易感组材料中进行SNP分型，获得每个个体在每个SNP位点的的基因型。
5.抗性相关SNP位点的获得
通过SPSS16.0中的非参数检验方法(卡方检验，χ2)对易感组和抗性组中各个SNP位点的基因频率、基因型频率及单倍型分布进行差异检验，设置限制性的阈值P＝0.05，结果显示TRAF6基因组序列中SEQIDTRAF6-g的139bp处的SNP位点与抗WSSV性状呈显著相关，该标记AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组(P<0.05)，提示AA基因型为抗性优势基因型，有可能作为抗病对虾筛选的标记。
其中，SEQIDTRAF6-g基因序列如下：
SEQIDTRAF6g：
TGTCTTCGAACAAATATCACATGGAAATCTGAACAGTATTTTTTGACTCTATTTATTCATGGAATGCAAAGTGAGAATGATGACTTTCTTGACTGGCCCTTTAGTGGACGCATAACACTTTCTGTACTAGACTGTGAT[G/A]TATCATTACCTAAAAACCATATCACAGAGACCATGGTGACAAAACCAGGTCTGCAGGCATTCAAGCGTCCTGATGTTGCTCGTAATCCAAAAGGATTTGGATTCACAGAATTTGTACCCCTTGCAAAAATACTTCAACCC
(a)序列特征
*长度：279碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：凡纳滨对虾
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，其特征在于：与对虾抗WSSV性状显著相关的分子标记为位于TRAF6基因的DNA序列SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变。
2.按权利要求1所述的与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，其特征在于：利用关联分析方法鉴定出该位点与对虾WSSV的抗性性状显著相关，AA基因型在抗性组中的基因频率显著高于易感组(P<0.05)，提示AA基因型为抗性优势基因型。
3.一种用于检测权利要求1所述的与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的引物对，其特征在于：引物对为：LvTF6F:TGTCTTCGAACAAATATCACATG和LvTF6R：GGGTTGAAGTATTTTTGCAAGGG。
4.一种权利要求1的与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的应用，其特征在于：所述对虾对WSSV抗性相关的分子标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用。
5.一种辅助抗WSSV品种的选育方法，其特征在于：
1)提取待分析材料的基因组的DNA；
2)以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3所述的引物对进行扩增，根据扩增产物获得SNP位点进行分型，获得分型信息；
3)将上述获得的分型信息中选择A/A基因型个体进行留种和建立家系育种。
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