CN105274094B

CN105274094B - Snp标记及其应用

Info

Publication number: CN105274094B
Application number: CN201410329322.0A
Authority: CN
Inventors: 张清峰; 李勇; 张耕耘; 全志武; 宋峰峰; 苗泽圃; 夏秋菊; 范艺翔
Original assignee: Shenzhen Huada Sansheng Garden Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Huada gene agriculture Holding Co., Ltd.
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2034-07-11
Also published as: CN105274094A

Abstract

本发明公开了SNP标记及其应用。其中，该SNP标记为山羊9号染色体18518518位置的碱基A或G。本发明的SNP标记与山羊的产羔数性状紧密相关，能够有效用于山羊的分子标记辅助育种。

Description

SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及山羊产羔数性状相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、试剂盒在山羊选育中的用途，以及检测山羊产羔数性状的方法。

背景技术

山羊是最早驯化的家畜之一，它为人类提供了丰富的畜产品。山羊能够在生态条件较差的环境中生存，在世界范围内有着广泛的分布，对世界农村和牧区的发展做出了重要贡献。山羊生产中，产羔数是一个重要经济性状，提高产羔数是增加收益的有效手段。但产羔数是复杂的数量性状，涉及多个基因、位点以及位点间的相互作用，极易受到环境的影响。传统的选择手段难以取得有效进展。分子标记辅助选择，可以通过影响选择时间、选择强度以及准确性而极大地提高这类性状的选择效果。目前应用较广泛的分子遗传标记技术有：限制性片段长度多态分析技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机引物扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性分析技术(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism,SNP)等。其中，SNP标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点，因此开发与山羊多胎相关的SNP遗传标记将对培育多胎山羊新品种(系)产生重大影响。其中，目前关于山羊多胎遗传标记的研究多基于已在其它品种或物种中发现的多胎候选基因。这些在山羊多胎遗传机制研究中发现的多胎相关遗传标记多是初步的结果，并且局限于已有候选基因，利用这些结果，还难以对山羊多胎性状做出较准确的选择。因而，在全基因水平上挖掘与产羔数性状(在本文中有时也称为“多胎性状”)相关的遗传标记很有必有。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种与山羊产羔数性状相关，能够有效用于山羊选育的SNP标记。

其中，需要说明的是，SNP(single nucleotide polymorphism,SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、***和缺失等。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种山羊产羔数性状相关的SNP标记。根据本发明的实施例，该SNP标记为山羊9号染色体18518518位置的碱基A或G。

根据本发明的实施例，所述SNP标记位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的方框标记处：

CTGATCTAATACTCAAAATTCACAGATTTCAGTTAAAAATCACTCACCACACCCCAAATCAGGAAGATCTTAAACTGACTCATCCAAAACTGTCAGAATACAGAAAGGTTGAATGTTATAATAGAAACATTATAATAGAAGAGAAGGCGGGAGGAGCGGTGTGGGAGACACACCAGGCAAGAACCAACAGAAAGAAAGCTGGTTTCCCTTTTGGCGGTATAAACTAAAAACACAAAATAAACTTTAAGATGAGGAACTCTACATGAGATAAAGTGGGTCACTTCATCAAAGGTTTCAATAGATCAGGAAGACAAAACTTTAAAGTATTACTAATACAACCTCAAAATATACAAACATCATTAGAACTGTCGGAAGAAATGGAAAACAGGGGTCTATTCATTACCACAGCCTAGTCTTATTCTAACTGAAATTGCTGCACAGCAGATTTAATTCAGCAAGAAGCCTTGTTTAATTCTGGAGAAAACGAGGTATCGAGTACAGAAGAAGCTTTTTCAAAAAGAAATATGGTATAGTGTCACACCAGCCACACGTGTATCTCATCTACTCCCCTGGCATTCTGTCCCTAGGAGGTGTTTTGATGTGTCAAAGTGATGGCAACACTTCTCCTATGGATGCAGGGTGGGTGGATTGCAAATGAGAAGCAGCAGCATGGAAGTCAGCTGTGCCCAATGCTTATTGCAGGTTTCACTGCTACAAAGTCTGAGACTTCAGTGAGTCAAAAAAAGCATTAGACATTTCCACAAATATGAATAACATCTGTTGAGATTACGGCATTTTCTACAGCAAACACAACAGTAATGATTATCGAATGCTCCCATTAGAATATTCCATGAGTCATTCACTCAGAAGCAAACACCGAAGATTAATCTAAAGTAGATTGCTTATTACTGGTTCTTGGCATTCTGCTTTCCTAGGGGTAC(SEQ ID NO：1)；

根据本发明的实施例，所述SNP标记的AG基因型个体的产羔数显著高于GG基因型个体。

即发明人发现，该SNP标记的位点处基因型为杂合型AG的山羊的产羔数显著高于此处基因型为纯合GG的山羊。进而，根据本发明的实施例，通过检测山羊的上述SNP，能够有效地确定其产羔数性状，具体地，如前所述，该SNP标记的AG基因型个体的产羔数显著高于GG基因型个体，从而能够根据该SNP位点的基因型对山羊的繁殖性能进行遗传评估。由此，发明人确定，本发明的SNP标记与山羊的产羔数性状紧密相关，能够有效用于山羊的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对山羊育种材料进行早期选择(例如选择产羔数多即多胎的山羊个体)，进一步能够有效提高育种的效率和准确性，提高山羊繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出山羊优良品种。此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的SNP标记进行山羊分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的SNP标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物对包含：具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，用于检测所述SNP标记。

具体地，所述引物对的序列如下所示：

F:GGTCACTTCATCAAAGGTTT(SEQ ID NO：2)

R:AGAAGTGTTGCCATCACTTT(SEQ ID NO：3)

根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测山羊的上述与产羔数性状相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对该SNP标记的检测，确定待测山羊该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测山羊的产羔数性状。具体地，该SNP位点的AG基因型个体中产羔数显著高于GG基因型的个体。进而，表明该SNP位点的AG基因型可以作为判断山羊产羔数多少性状的重要标准。在山羊选育工作中可以通过保留位点基因型为AG的个体，淘汰位点基因型为GG的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。由此，用于检测前面所述的本发明的SNP标记的引物对，能够有效用于山羊的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育山羊优良品种。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的SNP标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的SNP标记的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测山羊的上述与产羔数性状相关的SNP标记的多态性检测，确定待测山羊该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测山羊的产羔数性状。具体地，该SNP位点的AG基因型个体中产羔数显著高于GG基因型的个体(p＝9.42×10^-5)。进而，表明该SNP位点的AG基因型可以作为判断山羊产羔数多少性状的重要标准。在山羊选育工作中可以通过保留位点基因型为AG的个体，淘汰位点基因型为GG的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的SNP标记的试剂盒，能够有效用于山羊的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育山羊优良品种。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的SNP标记、引物对或试剂盒，在山羊选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与山羊产羔数性状相关的SNP标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测山羊的所述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测山羊的产羔数性状，从而能够有效辅助山羊选育。

进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测山羊产羔数性状的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测山羊进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测山羊的产羔数性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与山羊产羔数性状相关的SNP标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测山羊进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测山羊的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测山羊的产羔数性状。具体地，该SNP位点的AG基因型个体中产羔数显著高于GG基因型的个体(p＝9.42×10^-5)。进而，表明该SNP位点的AG基因型可以作为判断山羊产羔数多少性状的重要标准。在山羊选育工作中可以通过保留位点基因型为AG的个体，淘汰位点基因型为GG的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。由此，本发明的检测山羊产羔数性状的方法，能够快速、高效、准确地检测山羊产羔数性状，进而能够有效用于山羊的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育山羊优良品种。

另外，根据本发明上述实施例的检测山羊产羔数性状的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，对待测山羊进行SNP标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriTCion fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增400-700bp的产物，再通过测序即可直接检测SNP位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行SNP标记检测。根据本发明的一些具体示例，通过对待测山羊进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测山羊的产羔数性状，进一步包括：提取待测山羊的基因组DNA；利用前面所述的引物对，将所述待测山羊的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测山羊的所述SNP标记的基因型；以及基于所述待测山羊的所述SNP标记的基因型，确定所述待测山羊的产羔数性状。由此，能够有效提高检测山羊产羔数性状的效率。

根据本发明的实施例，提取待测山羊的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用常规酚-氯仿方法抽提待测山羊的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。

根据本发明的实施例，将所述待测山羊的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，该PCR扩增的扩增体系以20μl计为：25-50ng/μl的模板DNA2μl，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3所示的引物各0.3μl，10mmol/L的dNTP mix0.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的SNP标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。

根据本发明的实施例，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序方法的至少一种对所述PCR扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。

根据本发明的实施例，基于测序结果，通过比对山羊参考基因组序列，能够有效确定待测山羊的所述SNP标记为AA、GG还是AG。

根据本发明的实施例，该SNP标记的位点处基因型为杂合型AG的山羊的产羔数显著高于此处基因型为纯合GG的山羊(p＝9.42×10^-5)。即本发明前面所述的SNP标记与山羊的产羔数性状紧密相关。由此，基于确定的待测山羊的该SNP标记的基因型，能够准确有效地确定待测山羊的产羔数性状。具体地，该SNP位点的AG基因型个体中产羔数显著高于GG基因型的个体(p＝9.42×10^-5)。进而，表明该SNP位点的AG基因型可以作为判断山羊产羔数多少性状的重要标准。在山羊选育工作中可以通过保留位点基因型为AG的个体，淘汰位点基因型为GG的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。进而本发明的方法能够有效用于山羊的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育山羊优良品种。

需要说明的是，本发明的与山羊产羔数相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的SNP标记不受山羊的年龄、性别等限制，可用于山羊的早期选育，可显著促进山羊的育种进程；

(2)检测山羊该SNP位点的方法，准确可靠，操作方便；

(3)山羊该SNP位点的检出，为山羊产羔数性状的标记辅助选择提供了科学依据。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，本发明的所述SNP标记位点的曼哈顿图。

图2显示了该位点基因型GG、AG的测序峰图，其中，

图2a为该SNP位点的GG基因型测序峰图；

图2b为该SNP位点的AG基因型测序峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1 与山羊产羔数相关的SNP标记的获得

发明人通过RAD-seq及GWAS挖掘青山羊多胎性状相关遗传标记，以便利用这些标记可以提高山羊多胎性状选择的准确性，具体步骤如下：

1.1青山羊血液样品的采集和DNA的提取

1)306个样品均来自于山东翰龙羊业股份有限公司青山羊，繁殖性状见表1；

2)基因组DNA采用酚-氯仿法提取。

1.2RAD-seq文库构建

文库构建方法参考(Rapid SNP Discovery and Genetic Mapping UsingSequenced RAD Markers)，具体如下：

1)用Taq Ⅰ对基因组进行酶切，连接P1接头(含有barcode)；

2)随机打断，连接P2接头；

3)通过PCR筛选同时带有P1和P2接头的序列；

4)选取400bp-700bp的片段进行测序，其中，每个样本平均得到1.2G的数据，平均测序深度15×。

1.3关联分析

(1)采用Plink软件对上述获得的测序数据进行GWAS分析，从14万个SNP中找到了1个山羊多胎相关的SNP(见表2)。

(2)单因素方差分析表明：不同基因间产羔数存在显著差异(p＝9.42×10^-5，具体为AG、GG基因型产羔数存在显著差异。

(3)采用GLM方法对所述SNP位点与产羔数进行相关性分析。

线性模型如下：y＝μ+G+e。y：个体产羔数，μ：群体均值，G：基因型效应，e：残差。

结果表明所述位点与产羔数显著相关(p<0.05)，具体基因型产羔数(见表3)。

表1 青山羊繁殖性状统计表

2012-2013年每胎产羔数	1羔	2羔	3羔	4羔	5羔	6羔	合计
								个体数	78	124	79	21	3	1	306

表2 青山羊产羔数性状相关的SNP基本信息

编号	染色体	位置^a	等位基因	最小等位基因频率	P^b
						位点1	Chr9	18518518	A/G	0.051	7.26×10^-5

注：a.用RAD-seq得到的SNP侧翼序列进行BLAST，将其定位在基因组中(Caprahircus CHIR_1.0)。b.全基因组关联分析显著性p值。

图1显示了该SNP标记位点的曼哈顿图。如图1所示，横坐标为染色体编号，纵坐标为关联分析-log P值，点线为基因组水平5％显著的阈值线(6.6)，单核甘酸多态性标记的颜色对应特定染色体。

由图1、表2所示的全基因组关联分析结果及统计信息表明：该SNP位点与山羊直卷毛性状极显著相关(7.26×10^-5)。进而，表明SNP位点为判断山羊多胎相关的SNP标记。

表3 不同基因型产羔数的统计信息

注：不同基因型间产羔数存在显著差异(p＝9.42×10^-5)，具体为AG、GG基因型间产羔数存在显著差异，AA基因型没有进行显著性分析。

表3所示的统计信息表明：该SNP位点的AG基因型个体中产羔数显著高于GG基因型的个体(p＝9.42×10^-5)。进而，表明该SNP位点的AG基因型可以作为判断山羊产羔数多少性状的重要标准。在山羊选育工作中可以通过保留位点基因型为AG的个体，淘汰位点基因型为GG的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。

实施例2 与山羊产羔数相关的SNP标记的测序验证

2.1提取待测青山羊血液样品中的基因组DNA

待测青山羊血液样品来自山东翰龙羊业股份有限公司青山羊，随机选取5份，按照实施例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。

2.2扩增含SNP位点的核苷酸片段

以前述提取获得的各待测青山羊血液样品中的基因组DNA为模板，利用正向引物GGTCACTTCATCAAAGGTTT(SEQ ID NO：2)和反向引物AGAAGTGTTGCCATCACTTT(SEQ ID NO：3)扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。该PCR扩增的扩增体系以20μl计为：25-50ng/μl的模板DNA2μl，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3所示的引物各0.3μl，10mmol/L的dNTP mix0.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

2.3测序识别SNP位点基因型

前述步骤中所获得的PCR产物先经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，再于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID NO：1序列中501bp处(即本发明的SNP标记)的基因型。其中，GG和AG三种基因型的测序峰图分别如图2a、2b所示。其中，测序时采用了反向引物序列，所以测得的序列为反向互补序列。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种山羊产羔数性状相关的SNP标记，其特征在于，包含：

所述SNP标记为碱基A或G，所述SNP标记位于山羊9号染色体，位置为核酸的第18518518位，所述核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，该SNP位点的AG基因型个体产羔数显著高于GG基因型的个体。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，用于检测所述SNP标记。

4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含：

权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒，在山羊选育中的用途。

6.一种检测山羊产羔数性状的方法，其特征在于，通过对待测山羊进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测山羊的产羔数性状。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过对待测山羊进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测山羊的产羔数性状，进一步包括：

提取待测山羊的基因组DNA；

利用权利要求3所述的一组引物对，将所述待测山羊的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

基于所述测序结果，确定所述待测山羊的所述一种SNP标记中每一种的基因型；以及

基于所述待测山羊的所述一种SNP标记中每一种的基因型，确定所述待测山羊的产羔数性状。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

该SNP位点的AG基因型个体产羔数显著高于GG基因型的个体。