CN104450697B - 一种与牡蛎抗病毒特性相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学与遗传育种领域，具体是涉及一种与牡蛎抗病毒特性状相关的SNP标记及其应用。SNP标记位于长牡蛎TLR免疫通路中TLR2‑1(CGI_10005421)单外显子基因上。本发明的意义在于可以在苗种繁育时对亲贝进行基因型鉴定，通过筛选基因型为A/A或者A/C的亲贝，提高后代群体的抗病毒特性。

Description

一种与牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学与遗传育种领域，具体是涉及一种与牡蛎抗病毒特性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

长牡蛎，隶属于软体动物门，瓣鳃纲/双壳纲。长牡蛎原产于太平洋沿岸的中国、日本和朝鲜，后被引种到欧美大陆。由于长牡蛎生长速度快，肉味鲜美和环境适应性强等特点，具有很高的食用和经济价值，逐渐成为我国甚至世界重要养殖的贝类品种。

目前为止，全世界范围内多种双壳贝类中已经检测到OsHV-1，并且OsHV-1已被证明与幼虫的大规模死亡有关，在繁育季节幼虫的大规模死亡也为养殖业带来了巨大的经济损失。

PRR概念由Charles Janeway在1989年第一次提出，最近十几年关于细胞识别微生物病原的机制的知识呈***式增长。现在已经很清楚知道几类模式识别受体家族PRRs存在于细胞微环境里，可以识别并病毒侵染。TLR家族是目前研究较多而且最清楚的PRR家族之一。疱疹病毒颗粒可被TLR2识别，TLR2可能识别疱疹病毒的糖蛋白，然后诱导促炎症细胞因子的表达。

SNP是单核苷酸多态性，作为最新一代的分子标记，SNP在海洋水产遗传、育种等领域已经逐渐显示出巨大的应用潜力。在牡蛎基因组中平均每20-30bp就会有一个SNP存在。SNP分析技术按研究对象的性质主要分为两大类：一是对未知的SNP进行分析，即确定某段序列中有无SNP的存在，或者是确定某一未知SNP与某种性状是否存在关联；二是对已知的SNP进行分析，即对不同群体或者个体中进行已知SNP位点基因型的分析，逐一确定每一个个体针对某一个SNP的基因型，进而开展后续基因定位或者关联分析等研究工作。发明内容

本发明的目的在于提供一种与牡蛎抗病毒特性性状相关的SNP标记及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记，SNP标记位于长牡蛎TLR免疫通路中TLR2-1(CGI_10005421)单外显子基因上。

所述SNP标记位于TLR2-1基因蛋白质分子的亮氨酸富集C端识别结构域(Leucinerich repeat C-terminal domain)上。

所述SNP标记位于SEQ ID NO.1所示5’端第858个碱基处(SEQ ID NO.1所示碱基序列所编码的氨基酸序列的第286个氨基酸处)的碱基为A或C。

所述SNP在基因组DNA中的基因型为A/A、A/C或C/C。

一种权利要求1所述的与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记的应用，所述SNP标记在鉴定苗种繁育前亲贝的抗病毒基因型中的应用。

与长牡蛎抗病毒特性性状相关的SNP标记的鉴定方法，包括步骤如下：

1)使用OsHV-1(牡蛎疱疹一型病毒)人工感染野生长牡蛎群体，筛选最先死亡的100个个体(TM组)和最后死亡的100个个体(TF组)。

2)提取步骤1)中两组长牡蛎个体基因组DNA。

3)取上述步骤2)中TM组的所得100个个体DNA，将各个体的DNA等量混合作为TM混池；取TF组的所得100个个体DNA，将各个体的DNA等量混合作为TF混池。

4)将步骤3)所得两个基因混池利用二代测序技术进行全基因组重测序。

5)步骤4)所述的重测序结束后，将两个混池测序所得序列与牡蛎基因组做比对，进行全基因组SNP位点的筛查；

6)选取牡蛎免疫相关关键通路基因作为候选基因，设计引物，SNP位点的特异性引物序列为(浓度10uM)：

正向引物序列F:5’-GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’

利用PCR体外扩增技术对候选基因目的片段进行体外扩增。PCR反应程序：

7)将步骤6)所得扩增产物委托上海桑尼生物科技有限公司对其进行一代Sanger测序。

8)对步骤7)所述测序结果使用辅助软件对其测序峰图进行人工分析和统计。

9)将步骤8)分析统计结果使用plink软件对其与抗病毒性状进行关联分析，标记SNP。

通过对TM、TF两个群体在该SNP位点基因型与看病毒特性性状进行关联分析，发现抗病毒群体TF基因型更偏向于A/A或A/C，而病毒敏感群体TM基因型更偏向于C/C(P<0.05)。

根据以上结果鉴定标记SNP结果显示：在上述SNP位点出基因型为A/A或者A/C的个体对病毒不敏感，对病毒抗性较强；基因型为C/C的个体对病毒相对敏感，对病毒抗性较弱。

一种用于检测与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记的特异性引物，特异性引物为：

正向引物序列F:5’-GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’。

一种用于检测与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记的试剂盒，试剂盒含有正向引物序列F:5’-GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’

本发明所具有的优点：

与长牡蛎抗病毒相关的SNP标记位于长牡蛎TLR2-1基因ORF(Open readingframe，开放阅读框)的第858个碱基处，氨基酸序列的第286个氨基酸，此碱基存在A和C两种形式；相应的，该SNP在基因组DNA中存在A和C两种等位基因形式，该SNP位点为A基因型的个体对OsHV-1病毒抗性强于C基因型；该SNP在基因组DNA中的的基因型也对应的存在A/A,A/C,C/C三种(以下基因型均指该SNP在基因组DNA中的基因型)；该SNP所对应的氨基酸密码子存在GAA谷氨酸和GAC天冬氨酸两种形式。

本发明利用病毒相关两个群体全基因组重测序并筛选检查全基因组范围内SNP的基础上，再通过PCR技术对特定候选免疫相关基因的特定区域进行扩增,然后对PCR产物进行Sanger测序,检查验证SNP位点,以及对SNP位点的基因频率与抗病毒特性关联分析,从而标记出与牡蛎抗病毒特性显著相关的SNP位点。该SNP标记是能够在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定(牡蛎无损伤取样鉴定基因型)，通过筛选A/A和A/C基因型的亲贝，提高后代群体的抗病毒特性。本发明标记的牡蛎抗病毒特性相关的SNP具有一个用于水产业育种的潜在价值，有利于减少牡蛎养殖业的损失。

附图说明

图1为本发明实施例提供的包含SNP 10005421-858的PCR产物电泳检测图；

图2为本发明实施例提供的各种基因型碱基测序特征峰图(第一个碱基出现套峰，说明此位点为C/T杂合)，此图不代表本发明所述SNP峰图，在此仅对碱基峰图形式加以说明。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，本发明所用实验材料均来自市购。

实施例1

下面以具体实例对以上发明做进一步解释说明，具体步骤按照说明书中的SNP鉴定方法，即：

1)使用OsHV-1(牡蛎疱疹一型病毒)人工感染野生长牡蛎群体，筛选最先死亡的100个个体(TM组)和最后死亡的100个个体(TF组)。TM即为病毒敏感组，TF即为抗病毒组。

2)分别提取步骤1)中两组长牡蛎个体鳃组织基因组DNA。

3)取上述步骤2)中TM组所得的100个个体DNA，将各个体的DNA等量混合作为TM混池，取TF组的100个个体DNA，将各个体的DNA等量混合为TF混池。

4)将步骤3)所得两个基因混池委托深圳华大基因科技服务有限公司使用二代测序技术对其进行全基因组重测序。

5)步骤4)所述的重测序结束后，将两个混池测序所得序列与牡蛎基因组做比对，进行全基因组SNP位点的筛查；

6)根据牡蛎病毒应激表达谱数据库选取牡蛎免疫相关关键通路基因作为候选基因，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，SNP位点的特异性引物序列为(浓度10uM)：

正向引物序列F:5’-

GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’

利用PCR体外扩增技术对候选基因目的片段进行体外扩增。

PCR扩增体系：

PCR反应程序：

7)将步骤6)所得扩增产物委托上海桑尼生物科技有限公司对其进行一代Sanger测序，测序引物为步骤6)所述PCR扩增引物。

8)对步骤7)所述测序结果使用辅助软件seqscape v2.7对其测序峰图(如图2所示测序仪会根据检测结果特异性识别A、T、G、C四种特定碱基，然后给出测序峰图；如果同一位点出现套峰说明此位点基因型为此两种碱基类型杂合，如果此位点出现一种峰说明此位点基因型为该种碱基类型纯合)进行人工统计和分析，两组个体基因型分析统计结果如表1所示(其中00为信息缺失)。

9)将步骤8)分析统计结果使用plink软件对其与抗病毒性状进行关联分析，标记SNP，如SEQ ID NO.1所示5’端第858个碱基处(SEQ ID NO.1所示碱基序列所编码的氨基酸序列的第286个氨基酸处)。

通过关联分析，发现抗病毒群体TF在SNP10005421-858中A的等位基因频率显著高于病毒敏感群体TM，表明SNP10005421-858与牡蛎抗病毒特性显著相关，可以作为牡蛎抗病毒特性性状辅助选择的标记，并且在SNP10005421-858等位基因A使牡蛎具有对牡蛎疱疹病毒一型(OsHV-1)更强的抗性。

SEQ ID NO.1：

ATGATGCGGAAAGGAATAATGATGCTTTCTAGCCTATCTGTATTCTTAATGTTGATGTTTCTTGCTGGTTTATGTGACATGTGCCCCGTCTTACAGTGGGCAGGAAACAATGAAACAACTCTGAAATTTCTTACAAGGATGAAGATTGTTTCAAACGACACGTTTAGTAATTGCGACAAAAGTGTTCACCATCTCTTAATGGATGACTTAGGAATAGAAGAGGTTTCCCACAATGCATTAGAAGATTTCTATAACCTGAAATCTTTATCGTTATCAGGAAATTATATTTCCGCGCTGTCACCATTTTTACTGGAATACAAAAGAGGGTTGGAGTCTTTCAACATCGCAAATAATCGGCTCGAACGTATTGAGGACGGAACTTTTGAATATCTGGACAACGTAAAGGTAATTGAGCTCCAGTTTAACAACATTTCCTTTATCGGACCAGACGCTTTCTCAAGGAACCTCCGAGTTTTACAAACTGTAAACGTTTCCCATAATGCTCTAACATACGGAGAACCATGGCCATTTATACCGGAAGCGGACCCAACGGACGGCGAGGATTTGGTGTTTGACCTCGAATACAATCATATCTCGGAATTCCGGAACTCGCCTAACTGGACATACGATCTGGTTTCGCCCTTTGAGTACGACGTCAAGTTAAGTTTTAACAACATAACAAACATTCATATTGATGATGTTGTACATATATTCAATCCGGGTTTCCAAGGAAATACATTCGTAGAATACTTGTCTTTTAAAATCAATGCTTCTGAAAACCCTTTTTTCTGTGACTGTAATGTATATCCGTTTGCATCTTATTTGCGCGATTCGCTGTTTTATTTCTATAGAGTGGAAGAGTTCCGATACCGGTGTAACTCTCCTGATTCCTTGTCTCAAGAAGATTTCCTTCATGATATTCCCCTTGAGCAGTTTGTGTGTAACGTCACCGAAAACTGTCCCGACGGCTGTATCTGTCAGGAGCGGCCTTATTATGGATATCTTCACGTGAACTGTAGTTTCATGTACGGTTCTAACCAACAACCAATGAACACACTCCCTTTAACTCTTCCAACGTCCAAGAACGGCAAGATATCCTTACATCTGGATGGACACTACATCGCGTTACTAGAACAAAGGGGTTACCTTCCACAACTCGTAAATCTAACTCTCTCCTTCAACAAACTAGTACATATTGATCCAAAAGCTCTCACGTCCATGTCTGACAGACAATATCTAGATCTCTCACATAATTATCTCAAGTATGTGCCGAAAGAAATCCAGTATTTCAAGACGAATAAGGTTCGCATCGGTTCCAATCGCTTTGAGTGTAACTGCAACATGACTTGGATGGCCCAGTGGTTAAATCTGGATTCAAACGCTCCTGCTTACAATGCCCAGTGTGAATACGATGACGGCAGCGAGCGTTATTTTATACGCGACATCACCGATTCTTTGCTCAAATGCAGCTTTGAGAACCTCATCATTATAATCAGTGTCGTCGTTGGCATCCTCATCGCAATAATCATCGGGGCAGCCGTCACGGCCAGACGGTGTCCGTACGAGACAAAGGTTCTGATGTTTCGACTCTTCGGAGTGCACCCTGCCGACAAGTATCGCGTGGATTTGGAAGAACCACGTCAATACGACATCTATGTATCCCATTACGAACACGATTTACAGGCTAGACAATGGGTGAAATCAAAGTTCCTTCGCAAACTGGAAGAAAATCAAAAAAGAAAGTTCAAAGTCTTTTATTTCGAGCGAGATCTCAATGCTGGTACAGATATGTACGATGAATTAGTCACCCATATGAAACAATGCAGACGAATAGTGTTTATACTAACTAATGATTTTTTCAATGATGAAAAGAATATCTTTGAGGCAGATCAAGCAGAGATAGAACATCGAGCGAGCGACAATCTGCATGGACGTGTCATATATTTGTTATGGAACGAGAGCGTGCGAGAAAAAATAAAATTGGACCCATGGAAGTCTCGAATGGAGGGTAAACGCGTGCTCTGTCCAGACGACAAGTTCTTCTGGTCTAAGATGAGATACGAACTGCCTTTCAAGGGGGTGCCTTAA

长度：2088bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线形

分子类型：DNA

特性名称：cDNA

来源：长牡蛎

表1

实施例2

试剂盒中各成分组成如下：

长牡蛎个体鳃组织基因组DNA(15ng/ul)；

特异性引物F；

特异性引物R；

预混型EXTaq聚合酶Premix Taq^TM(TaKaRa)；

ddH₂O。

试剂盒中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：2ul长牡蛎个体鳃组织基因组DNA，12.5ul预混型EXTaq聚合酶Premix Taq^TM(TaKaRa)，0.5ul正向引物F，0.5ul反向引物R，余量为双蒸水；

正向引物序列F:5’-GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’

其中，PCR反应的条件为：94℃4分钟；94℃10秒，55℃30秒，72℃2秒，35个循环；72℃10分钟。

反应所得产物即为目的含SNP位点的序列,序列如SEQ ID NO.1所示，检测该序列2088bp位点上的碱基，从而判断样本的基因型。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记，其特征在于：SNP标记位于长牡蛎TLR免疫通路中TLR2-1单外显子基因上；

所述SNP标记位于SEQ ID NO.1所示5’端第858个碱基处，碱基类型为A或C。

2.按权利要求1所述的与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记，其特征在于：所述SNP标记位于TLR2-1基因蛋白质分子的亮氨酸富集C端识别结构域(Leucine rich repeat C-terminal domain)上。

3.按权利要求1所述的与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记，其特征在于：所述SNP在基因组DNA中的基因型为A/A、A/C或C/C。

4.一种用于检测与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记的特异性引物，其特征在于：特异性引物为：

正向引物序列F:5’-GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’。

5.一种用于检测与长牡蛎抗病毒特性相关的SNP标记的试剂盒，其特征在于：试剂盒含有

正向引物序列F:5’-GAATATTATCTATTCACTACATACCTGACATG-3’；

反向引物序列R:5’-GGATCAATATGTACTAGTTTGTTGAAGG-3’。