CN105777759B

CN105777759B - 一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂

Info

Publication number: CN105777759B
Application number: CN201610286399.3A
Authority: CN
Inventors: 周星露; 刘兴国; 戈震
Original assignee: HANGZHOU HERTZ PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU HERTZ PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: CN105777759A

Abstract

本发明提供了一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、含其的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明化合物对A549、SGC7901、MCF‑7、HL‑60、PC9‑IR等肿瘤细胞株具有抗增殖抑制作用，可应用于治疗人或动物细胞增殖性相关的实体瘤或血癌的药物中；本发明化合物具有较好的药代动力学性质，可应用于口服治疗人或动物细胞增殖性相关的实体瘤或血癌或者罹患自身免疫性疾病；本发明化合物具有双位点的反应特性。

Description

一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂

技术领域

本发明属于医药领域，具体是一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、含其的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

小分子共价抑制剂(covalent inhibitors)，也称不可逆抑制剂(irreversibleinhibitors)，是通过共价键与靶蛋白残基发生不可逆结合，从而发挥其生物学功能的一类抑制剂。共价抑制剂药物在过去的几十年里对人类健康做出了重要贡献。相对于非共价抑制剂,共价抑制剂通过与靶蛋白以共价键结合增强了与靶标的亲和性,这是共价抑制剂表现其高生物活性的根本原因。近年来,由于非共价靶向抗肿瘤药物特别是大量针对激酶的替尼类药物耐药的产生,使人们又更多地关注共价抑制剂药物。近年来,许多大型制药公司均开展了针对特定酶靶点的共价抑制剂的研发,目前已有部分共价抑制剂进入临床试验，包括阿法替尼、卡那替尼、来那替尼等。其中，阿法替尼已于2013年7月12日被美国FDA正式批准用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的转移性非小细胞肺癌，成为首个被FDA批准的治疗肺癌的不可逆抑制剂新药。此外,抗病毒的共价药物也是近年来的研究热点，并且已取得了很大的进展,例如,2011年FDA已批准了两个抗丙型肝炎病毒共价抑制剂药物,即telaprevir和boceprevir。这些研究证明了不可逆抑制剂可有效用于疾病的治疗。

布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)，一种非受体酪氨酸激酶Tec家族的成员，是在除了T淋巴细胞和自然杀伤细胞之外的所有造血细胞类型中表达的关键信号酶。Btk在连接细胞表面B细胞受体(B-cell receptor，BCR)刺激至下游细胞内应答的B细胞信号传导途径中扮演至关重要的角色。Btk是B细胞发育、激活、信号传导和存活的关键调节物。另外，Bkt在众多其他造血细胞信号传导途径中起作用，例如在巨噬细胞中的Toll样受体(Toll like receptor，TLR)和细胞因子受体介导的TNF-α产生、在肥大细胞中的免疫球蛋白E受体(FcεR1)信号传导、在B-谱系淋巴样细胞中抑制Fas/APO-1细胞凋亡的信号传导以及胶原刺激的血小板聚集。参见例如C.A.Jeffries等，J.Bio.Chem.(2003)278:26258-26264、N.J.Horwood等，J.Exp.Med.(2003)197:1603-1611。近年来研究显示，Btk信号通路是目前非霍奇金淋巴瘤(NHL)，特别是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤及自身免疫疾病临床治疗研究中的新热点。小分子Btk抑制剂通过作用于BCR信号通路，与Btk结合而抑制Btk自身磷酸化，阻止Btk的激活，从而阻断细胞传导并诱导细胞凋亡。Btk抑制剂选择性强，毒副作用低，特别是伊布替尼的上市，被FDA定为“突破性”新药，其研究开发前景广阔。伊布替尼与Btk酶半胱氨酸(Cys481)残基的巯基发生反应，并形成共价键，使Btk酶失活而发挥疗效。然而，伊布替尼替尼在给药过程中，易被代谢(被代谢酶氧化代谢成双羟化产物或者被其他含巯基的酶、半胱氨酸、谷胱甘肽等进攻而失活)而影响药效(见下式)，其临床给药剂量达到了560mg/天，而使病人负担加重，因此仍需发展一类更为高效的BTK抑制剂用于相关疾病的治疗。

本发明人前期专利中报道了一类双位点BTK不可逆抑制剂及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物(专利申请号：201510242552.8)，以下式中的HZ-003为代表化合物。该类化合物与伊布替尼相比，在丙烯酰基的2位引入卤素取代，提高了药动性质、BTK抑制活性，并且对部分实体瘤抑制效果显著，但由于卤素原子的引入而影响了其水溶性。因此针对其这一特性，在保证其高活性的同时，发现一类水溶性改进的双位点BTK不可逆抑制剂具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供新颖的、未见文献报道的具有良好溶解度的双位点BTK不可逆抑制剂及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

基于伊布替尼的体内代谢途径分析以及构效关系，我们保留了丙烯酰胺2位的卤素，使其继续具有良好的药动学性质以及双位点的BTK不可逆抑制活性。在其芳香环中引入氮原子，提高其溶解度。

本发明采用如下的技术方案：

本发明所提供的BTK抑制剂具有通式(Ⅰ)结构：

及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：Ra,Rb,Rc独立选自H、卤素、-CF₃、-CN、-NO₂、OH、NH₂、-L-C₁-C₆的烷基、-L-C₁-C₆的烯基、-L-取代或非取代的杂芳基、或-L-取代或非取代的芳基，其中L是键、O、S、-S(＝O)、-S(＝O)₂、NH、C(O)、CH₂、-NHC(O)O、-NHC(O)或-C(O)NH，X选自氟、氯和溴,Y₁,Y₂选自C、N,Y₁,Y₂至少有一个选自N。

更进一步地，本发明优选的化合物具有通式(II)结构：

及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：每一个Rd独立地是H、卤素、-CF₃、-CN、-NO₂、-OH、C₁-C₃的烷氧基、或-NH₂，X选自氟、氯和溴,Y₁,Y₂选自C、N,Y₁,Y₂至少有一个选自N。

更进一步地，本发明优选的化合物具有通式(III)结构：

及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：X选自氟、氯和溴,Y₁,Y₂选自C、N,Y₁,Y₂至少有一个选自N。

术语说明：本文所用术语“芳基”是指5到12个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子***。芳环的非限制性实例有：苯环、萘环和蒽环。芳环可以是无取代或取代的。芳环的取代基选自卤素、硝基、氨基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基、卤代C₃-C₆环烷基；

本文所用术语“杂芳基”指5到12个环原子的不饱和的碳环，其中一个或多个碳被杂原子例如氧、氮、硫等置换。杂芳环可以是单环，也可以是双环，即通过两个环稠合而成。具体的杂环芳基可以是：吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，异恶唑基，异噻唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基和咪唑基等。杂环芳基可以是无取代或取代的。杂环芳基的取代基选自卤素、硝基、氨基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基、卤代C₃-C₆环烷基；

本文所用术语“杂环”指单环或稠合环基团，在环中具有5到9个环原子，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)_m(其中m是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。这些环可以具有一条或多条双键，但这些环不具有完全共轭的π电子***。无取代的杂环烷基的可以是吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉代基、硫代吗啉代基、高哌嗪基等。杂环可以是无取代或取代的。杂环的取代基选自卤素、硝基、氨基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基、卤代C₃-C₆环烷基。

本文所用术语“烷氧基”是指-O-烷基基团，其中烷基如上所定义。本文所用“烷氧基”的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。“烷氧基”还包括取代烷氧基。烷氧基可任选被卤素取代一次或多次。

术语“烯基”是指一类烷基，其中烷基的起始的两个原子形成双键，该双键不是芳香基的组成部分。也就是说，烯基始于原子-C(R)＝C(R)-R，其中R是指烯基的其余部分，各R可以相同或不同。烯基部分可以是支链、直链或环状的(在此情况下，它也会被称为“环烯基”)。根据结构，烯基可以是单价基团或双加基团(即亚烯基)。烯基可以是任选取代的。烯基的非限制性实例包括-CH＝CH₂、-C(CH₃)＝CH₂、-CH＝CHCH₃、-C(CH₃)＝CHCH₃。亚烯基包括但不限于-CH＝CH-、-C(CH₃)＝CH-、-CH＝CHCH₂-、-CH＝CHCH₂CH₂-和-C(CH₃)＝CHCH₂-。烯基可以具有2-10个碳原子。烯基也可以说具有2-6个碳原子的“低级烯基”。

术语“药学可接受衍生物”是指所选化合物的盐和溶剂合物。

本文所用术语“溶剂合物”是指由溶质(例如：本发明的通式(I)～通式(III)化合物)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。为了本发明的目的，所述溶剂不能干扰溶质的生物学活性。合适的溶剂的实例包括但不限于水、甲醇、乙醇和乙酸。优选使用的溶剂为药学可接受溶剂。合适的药学可接受溶剂包括但不限于水、乙醇和乙酸。更优选地，所用溶剂为水。

本发明采用本领域技术人员所熟知的方法可以制备本发明所述化合物的盐。所述的盐可以是有机酸盐、无机酸盐等，所述的有机酸盐包括枸橼酸盐、富马酸盐、草酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、樟脑磺酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐等；所述的无机酸盐包括氢卤酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等。例如，与低级烷基磺酸，如甲磺酸，三氟甲磺酸等可形成甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐；与芳基磺酸，如苯磺酸或对甲苯磺酸等可形成对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐；与有机羧酸，如乙酸，富马酸，酒石酸，草酸，马来酸，苹果酸，琥珀酸或柠檬酸等可形成相应的盐；与氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸可形成谷氨酸盐或天冬氨酸盐。与无机酸，如氢卤酸(如氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氯酸)，硝酸，碳酸，硫酸或磷酸等也可形成相应的盐。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种活性组分以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述的活性组分可以是本发明的BTK抑制剂化合物、所述化合物的光学异构体、所述化合物或其光学异构体在药学上可接受的盐、所述化合物或其光学异构体的溶剂合物中的任意一种或任意多种。

所述载体包括药学领域的常规稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂等，必要时还可以加入香味剂，甜味剂等。本发明药物可以制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液及注射用药等多种形式，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

另一方面，本发明提供的是使用本文公开的通式(Ⅰ)～通式(III)所述的化合物及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物来抑制布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)活性或者治疗从布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)活性的抑制中获益的疾病、障碍或病症。

在进一步方面中，本文提供的是通过给予有需要的治疗者一种含有治疗有效量的至少一种化合物的组合物、从而抑制所述受治疗者的布鲁顿酪氨酸激酶活性的方法，其中所述化合物的结构式为通式(I)～通式(III)。在一些实施方式中，有需要的受治疗者罹患自身免疫性疾病，例如炎性肠病、关节炎、狼疮、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病(Still’s disease)、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力症、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、奥德甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、类风湿性关节炎综合征(gren’s syndrome)、多发性硬化症、传染性神经元炎(Guillain-Barrésyndrome)、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病(Addison’sdisease)、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、强制性脊椎炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻(coeliac disease)、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’ssyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、视神经炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、莱特尔综合征(Reiter’s syndrome)、高安动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、银屑病、全身脱毛、贝赫切特病(disease)、慢性疲劳、家族性自主神经功能异常、子宫内膜异位、间质性膀胱炎、神经肌强直、硬皮病或外阴痛。

在进一步的实施方式中，有需要的受治疗者罹患癌症。在一个实施方式中，所述癌症是B细胞增生性疾病，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(mmacroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、***边缘区B细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、纵膈(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)/白血病或淋巴瘤样肉芽肿病。

本发明还提供本发明所述的化合物或其可药用盐在制备BTK抑制剂中的应用，特别是在制备治疗细胞增生疾病中的应用。所述的细胞增生疾病包括癌症。换言之，本发明还提供通式(Ⅰ)～通式(III)所述的化合物、及其光学异构体或其药学上可接受的盐或溶剂合物单独或和其他药物联合使用在治疗增生类疾病(如癌症)中的应用。能和本发明所提供的化合物或其可药用盐联合使用的抗肿瘤药包括但并非限定至少一种以下种类：有丝***抑制剂(如长春碱、长春地辛和长春瑞宾)；微管蛋白分解抑制剂(如泰素)；烷基化试剂(如顺铂、卡铂和环磷酰胺)；抗代谢物(如5-氟尿嘧啶、替加氟、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)；可***抗生素(如阿雷素、丝裂霉素和争光霉素)；酶(如天门冬氨酶)；拓朴异构酶抑制剂(如依托伯苷和喜树碱)；生物反应调节剂(如干扰素)。

本发明还提供了制备通式(Ⅰ)及其药学可接受衍生物的方法，以如下方案所示的合成路线合成：

如上所示，化合物1(参考WO2012158795的方法制备)与R₁B(OH)₂在磷酸钾、钯催化剂及合适的溶剂或混合溶剂如二氧六环/水存在下，回流反应24小时，得到的化合物2在三苯基磷、DIAD及合适溶剂如THF存在下，与Boc保护的3-羟基哌啶反应得到化合物3，随后在酸性条件下水解制备关键中间体4。该关键中间体DCC及合适溶剂如DCM存在下，与取代丙烯酸片段缩合反应，得到通式(I)化合物。

本发明发明人通过实验证实，本发明化合物对A549、SGC7901、MCF-7、PC-9IR、HL-60等肿瘤细胞株具有抗增殖抑制作用，可应用于治疗人或动物细胞增殖性相关的实体瘤或血癌的药物中。

本发明发明人通过实验证实，本发明化合物具有较好的药代动力学性质，可应用于口服治疗人或动物细胞增殖性相关的实体瘤或血癌或者罹患自身免疫性疾病。

本发明发明人通过实验证实，本发明化合物具有双位点的反应特性。

具体实施方式

下面通过实施例来说明本发明的可实施性，本领域的技术人员应当理解，根据现有技术的教导，对相应的技术特征进行修改或替换，仍然属于本发明要求保护的范围。

实施例1.关键中间体4a的制备

步骤1. 3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物2a)的合成

将3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物1)(2.61g,10mmol)、4-苯氧基吡啶硼酸(3.83g,18mmol)和磷酸钾(5.375g,25mmol)依次加入单颈瓶中，加入1,4-二氧六环(40mL)和水(10mL)，氮气保护下，加入三苯基磷钯(1.76g,1.5mmol)，回流反应24h。反应完毕冷却至室温，搅拌过夜，析出黄色沉淀，抽滤，水洗(50ml*3)，干燥24小时后得黄色固体2.25g，为3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物2a)，产率67％。

步骤2. 3-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物3a)的合成

将3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物2a)(2.12g,7mmol)、3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.55g,7.7mmol)、三苯基磷(2.75g,10.5mmol)和偶氮二异丁腈(2.12g,10.5mmol)溶于THF(250ml)中，室温反应12h(TLC薄层层析监测反应是否完全)。反应完毕后，减压回收溶剂。向剩余反应混合物中加入100乙酸乙酯，用100ml*3饱和碳酸钠溶液萃取有机层3次，合并有机相，饱和氯化钠洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂得到棕色固体1.40g，产率40％。步骤3.3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(化合物4a)的合成

将3-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物3a)(0.97g,2mmol)溶解于15ml二氧六环，滴加10ml 2N HCl，室温搅拌过夜。减压回收溶剂得到的粗品用甲醇重结晶，得到类白色固体4a(0.71g，产率80％，[M+H]＝424.2)。

实施例2.关键中间体4b的制备

步骤1. 3-(6-(2-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物2b)的合成

合成步骤参考实施例1步骤1.用类似于化合物2a的合成方法，从4-(4-氯苯氧基)吡啶硼酸(4.46g,18mmol)制备化合物2h(2.31g，产率68％)。

步骤2. 3-(4-氨基-3-(6-(2-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物3b)的合成

合成步骤参考实施例1步骤2.用类似于化合物3a的合成方法制备化合物3b(1.40g,产率40％)。

步骤3. 3-(6-(2-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(化合物4b)的合成

合成步骤参考实施例1步骤3.用类似于化合物4a的合成方法制备化合物4b(0.67g,产率77％，[M+H]＝442.2)。

实施例3.关键中间体4c的制备

步骤1. 3-(6-(4-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(化合物2c)的合成

合成步骤参考实施例1步骤1.用类似于化合物2a的合成方法，从4-(4-氯苯氧基)吡啶硼酸(4.46g,18mmol)制备化合物2c(2.32g，产率68％)。

步骤2. 3-(4-氨基-3-(6-(4-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物3c)的合成

合成步骤参考实施例1步骤2.用类似于化合物3a的合成方法制备化合物3i(1.32g,产率38％)。

步骤3. 3-(6-(4-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(化合物4c)的合成

合成步骤参考实施例1步骤3.用类似于化合物4a的合成方法制备化合物4c(0.68g,产率78％，[M+H]＝442.2)。

实施例4. 1-(3-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-溴丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-1)

4a(548mg,1.3mmol)，2-溴丙烯酸(195mg,1.3mmol)溶于5ml二氯甲烷，室温滴加DCC(267mg,1.3mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液，回流反应4小时。反应结束后，冷却至室温，抽滤，滤液浓缩后，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯：三乙胺＝2：1：0.1)得白色固体202mg，产率30％，[M+H]＝520.1。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.50(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.35(s,1H,ArH),8.03(dd,1H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.4Hz,ArH),7.42(td,2H,J₁＝7.6Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.23(t,1H,J＝7.6Hz,ArH),7.18(dd,2H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.08(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),6.04(s,2H,-NH₂),5.19(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.10(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.05(d,1H,-C＝CH₂),4.91(m,1H,piperidine),4.63(m,0.5H,piperidine),4.45(m,0.5H,piperidine),4.12(m,0.5H,piperidine),3.75(m,0.5H,piperidine),3.43(m,0.5H,piperidine),3.17(m,0.5H,piperidine),2.85(m,0.5H,piperidine),2.77(m,0.5H,piperidine),2.30(m,2H,piperidine),1.73(m,2H,piperidine)。

实施例5. 1-(3-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氯丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-2)

合成步骤参考实施例4.用类似于化合物5-1的合成方法制备化合物5-2(214mg，产率35％，[M+H]＝476.2)。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.51(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.36(s,1H,ArH),8.05(dd,1H,J₁＝8.0Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.44(td,2H,J₁＝7.6Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.24(t,1H,J＝7.6Hz,ArH),7.20(dd,2H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.11(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),5.98(s,2H,-NH₂),5.21(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.11(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.06(d,1H,-C＝CH₂),4.92(m,1H,piperidine),4.63(m,0.5H,piperidine),4.43(m,0.5H,piperidine),4.11(m,0.5H,piperidine),3.74(m,0.5H,piperidine),3.42(m,0.5H,piperidine),3.17(m,0.5H,piperidine),2.82(m,0.5H,piperidine),2.75(m,0.5H,piperidine),2.31(m,2H,piperidine),1.73(m,2H,piperidine)。

实施例6. 1-(3-(4-氨基-3-(6-(2-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-溴丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-3)

合成步骤参考实施例4.用类似于化合物5-1的合成方法制备化合物5-3(227mg，产率29％，[M+H]＝538.1)。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.51(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.39(s,1H,ArH),8.06(dd,1H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.37(dd,2H,J₁＝8.4Hz,J₂＝7.2Hz,ArH),7.17(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),6.94(m,3H,ArH),6.00(s,2H,-NH₂),5.21(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.11(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.03(d,1H,-C＝CH₂),4.92(m,1H,piperidine),4.60(m,0.5H,piperidine),4.42(m,0.5H,piperidine),4.11(m,0.5H,piperidine),3.72(m,0.5H,piperidine),3.43(m,0.5H,piperidine),3.13(m,0.5H,piperidine),2.82(m,0.5H,piperidine),2.70(m,0.5H,piperidine),2.31(m,2H,piperidine),1.75(m,2H,piperidine)。

实施例7. 1-(3-(4-氨基-3-(6-(2-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氯丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-4)

合成步骤参考实施例4.用类似于化合物5-1的合成方法制备化合物5-4(201mg，产率31％，[M+H]＝494.1)。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.52(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.39(s,1H,ArH),8.05(dd,1H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.37(dd,2H,J₁＝8.4Hz,J₂＝7.6Hz,ArH),7.15(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),6.94(m,3H,ArH),5.92(s,2H,-NH₂),5.21(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.12(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.06(d,1H,-C＝CH₂),4.91(m,1H,piperidine),4.63(m,0.5H,piperidine),4.41(m,0.5H,piperidine),4.11(m,0.5H,piperidine),3.75(m,0.5H,piperidine),3.44(m,0.5H,piperidine),3.16(m,0.5H,piperidine),2.81(m,0.5H,piperidine),2.75(m,0.5H,piperidine),2.32(m,2H,piperidine),1.74(m,2H,piperidine)。

实施例8. 1-(3-(4-氨基-3-(6-(4-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-溴丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-5)

合成步骤参考实施例4.用类似于化合物5-1的合成方法制备化合物5-5(234mg，产率30％，[M+H]＝538.1)。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.41(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.28(s,1H,ArH),7.96(dd,1H,J₁＝8.8Hz,J₂＝2.4Hz,ArH),7.01(m,5H,ArH),5.84(s,2H,-NH₂),5.29(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.13(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.03(d,1H,-C＝CH₂),4.92(m,1H,piperidine),4.61(m,0.5H,piperidine),4.44(m,0.5H,piperidine),4.12(m,0.5H,piperidine),3.74(m,0.5H,piperidine),3.41(m,0.5H,piperidine),3.13(m,0.5H,piperidine),2.82(m,0.5H,piperidine),2.68(m,0.5H,piperidine),2.32(m,2H,piperidine),1.75(m,2H,piperidine)。

实施例9. 1-(3-(4-氨基-3-(6-(4-氟苯氧基)吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氯丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-6)

合成步骤参考实施例4.用类似于化合物5-1的合成方法制备化合物5-6(205mg，产率31％，[M+H]＝494.1)。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.41(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.28(s,1H,ArH),7.97(dd,1H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.01(m,5H,ArH),5.92(s,2H,-NH₂),5.21(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.12(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.06(d,1H,-C＝CH₂),4.99(m,1H,piperidine),4.65(m,0.5H,piperidine),4.41(m,0.5H,piperidine),4.17(m,0.5H,piperidine),3.75(m,0.5H,piperidine),3.43(m,0.5H,piperidine),3.16(m,0.5H,piperidine),2.83(m,0.5H,piperidine),2.71(m,0.5H,piperidine),2.33(m,2H,piperidine),1.74(m,2H,piperidine)。

实施例10. 1-(3-(4-氨基-3-(6-苯氧基吡啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-氟丙基-2-烯-1-酮的制备(化合物5-7)

合成步骤参考实施例4.用类似于化合物5-1的合成方法制备化合物5-7(195mg，产率33％，[M+H]＝460.2)。¹H-NMR(δ,CDCl₃-d6):8.51(d,1H,J＝2.0Hz,ArH),8.36(s,1H,ArH),8.05(dd,1H,J₁＝8.0Hz,J₂＝2.4Hz,ArH),7.43(td,2H,J₁＝7.6Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.26(t,1H,J＝8.0Hz,ArH),7.21(dd,2H,J₁＝8.4Hz,J₂＝2.0Hz,ArH),7.12(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),5.99(s,2H,-NH₂),5.21(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.11(d,0.5H,J＝4.0Hz,-C＝CH₂),5.06(d,1H,-C＝CH₂),4.92(m,1H,piperidine),4.65(m,0.5H,piperidine),4.39(m,0.5H,piperidine),4.12(m,0.5H,piperidine),3.72(m,0.5H,piperidine),3.42(m,0.5H,piperidine),3.17(m,0.5H,piperidine),2.83(m,0.5H,piperidine),2.76(m,0.5H,piperidine),2.32(m,2H,piperidine),1.77(m,2H,piperidine)。

实施例11.体外Btk激酶抑制活性和体外抗肿瘤活性测试

本发明化合物的体外Btk激酶抑制活性测定方法：

将药物溶于DMSO中制成10mM的储备液，并稀释至50x的测试浓度药液备用，测试浓度以3被梯度稀释，分别为25nM，8.33nM，2.78nM，0.93nM，0.31nM，0.10nM。在96孔板里加入10μL 50x药物备用液，再加入90μL 1x激酶缓冲液，在振荡器上震荡10分钟。从96孔板各孔取5μL转移至384孔板，384孔板里设2复孔。激酶反应：准备2.5x激酶缓冲液：将酶加入1x激酶基础缓冲液中。准备 2.5x短肽溶液：将FAM标记的短肽和ATP加入1x激酶基础缓冲液中。在加有5μL药液384孔板中，加入10μL 2.5x激酶缓冲液，室温孵育10分钟。在384孔板中加入10μL 2.5x短肽溶液，28℃孵育1小时。加入25μL终止液停止反应。读数，并计算化合物对酶的抑制率，拟合计算出BTK激酶的IC₅₀。

选用不同的实体瘤和白血病细胞株对所合成的化合物进行了体外抗肿瘤活性的测定:

细胞株：人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF7)、人胃癌细胞(SGC7901)、急性前髓细胞性白血病细胞(HL60)、人肺癌细胞吉非替尼耐药细胞(PC9-IR)。

培养基：A549:RPMI 1640+胎牛血清

MCF7：DMEM+胎牛血清

SGC7901：RPMI 1640+新生牛血清

HL60：RPMI 1640+胎牛血清

PC9-IR：DMEM+胎牛血清

药物配制方法：将药物溶于DMSO中制成10mM的储备液，并按一定比例稀释得到5个不同浓度(测试浓度100x)。

肿瘤细胞体外培养：

将所选取的五株肿瘤细胞A549、MCF7、SGC7901、HL60、PC9-IR，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育，待细胞密度长到70～90％时传代(贴壁细胞用Duck’s EDTA消化后传代)，用于以后实验所需。

肿瘤细胞A549、MCF7、SGC7901、HL60、PC9-IR，在96孔板上种入4000个/200μL/孔，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜。每孔加入化合物2μL，终浓度为50μM，10μM，2μM，0.4μM，0.08μM共同于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育72小时，以DMSO(2％)为对照组。72小时后，加入20μL CCK-8溶液，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中4小时。用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。用酶标仪在450nm测定吸光度(OD值)，所得数据用于计算IC₅₀。

细胞抑制率的计算公式为：细胞抑制率％＝[(对照组OD值-空白组OD值)-(用药组OD值-空白组OD值)]/(对照细胞OD值-空白组OD值)×100％，用CalcuSyn软件计算求得半数抑制浓度(IC₅₀)。

表1部分化合物对BTK激酶抑制活性和体外肿瘤细胞增殖抑制活性

从表中数据可以看出，大部分化合物对BTK都具有明显的抑制活性，与HZ-003相比，略有下降。但是，在细胞水平上，所测试的化合物5-1～5-6均表现出比阳性对照更为强效的肿瘤细胞增殖抑制活性，与HZ-003相比也表现出更强或相当的肿瘤细胞增殖抑制活性。与伊布替尼相比，化合物5-1～5-6的实体瘤细胞活性更强(A549、SGC-7901、MCF-7)，且对血液瘤细胞(HL-60)同样如此。特别是在人肺癌细胞(A549)中，化合物5-1比伊布替尼活性提高了10倍，比HZ-003提高了5倍。同时，所有化合物在PC9-IR(吉非替尼耐药株)中同样显示出强效的肿瘤细胞增殖抑制活性。因此，本发明所涉及的可用作BTK抑制剂具有广阔的抗肿瘤应用前景。

实施例12.溶解度试验

称取研成细粉的受试化合物100mg，分别于25℃±2℃在一定量的溶剂(1ml，3ml，10ml，100ml)中，每隔5分钟强力振摇30秒钟；观察30分钟内的溶解情况，如无可见溶质，视为完全溶解。

实验结果显示，HZ-003在100ml溶剂时仍有部分未溶解，参照中国药典的定义，属于极微溶解。而化合物5-1在100ml溶剂时完全溶解，在10ml时有小部分未溶解，属于微溶，比HZ-003明显提高。说明芳香环氮原子的引入明显提高了化合物的溶解度。

实施例13.体外双位点不可逆抑制剂性质的表征：

首先，采用化合物5-1预处理重组Btk后，用不含抑制剂的培养基重复洗涤，其活性不会恢复(参见例如J.B.Smaill等，J.Med.Chem.1999,42，1803)。其次，通过质谱，观察到了主要质谱峰对应化合物5-3和Btk之间的共价复合物的分子量之比为1:1(化合物4:518,道尔顿，重组Btk激酶结合域：33487；复合物预测值为34005，实测值为34005)。

其次，采用化合物5-1与半胱氨酸共孵浴3小时后，经HPLC-MS检测，发现大部分化合物5-1转变为被两个半胱氨酸加成的产物(预测分子量为：682)，实际分子量为(682)，实验证明，所测试的化合物具有被双分子含巯基化合物加成的能力，这也阐明了此类化合物虽然在体外Btk激酶抑制活性与阳性药伊布替尼相当，但是在细胞层面上能明显优于伊布替尼。

实施例14.口服药代动力学实验

以伊布替尼为参比，分别考察了化合物5-1在大鼠体内的药代动力学性质，具体方法如下：以SD大鼠为实验动物，灌胃给药20mg/kg，尾静脉静注给药5mg/kg。灌胃给药的尾静脉取血时间点为0.17,0.33,0.5,1,1.5,2,4,6,8,12,24小时；静脉给药取血时间点为0.05,0.1,0.17,0.5,1,2,4,6,8,12,24小时。取全血0.3ml，离心后取血浆0.1ml采用LC-MS进行分析。结果表明，化合物5-1的口服生物利用度分别为19％，而伊布替尼的生物利用度为12％，因此化合物5-1在体内的稳定性较伊布替尼有了明显的显著提高。其原因可能在于丙烯酰胺的α位引入卤素引入后，在不影响药物吸收的前提下，使得双键的代谢速率受到一定程度的抑制，进而提高了血药浓度而提高生物利用度。

实施例15：使用化合物5-1治疗类分湿性关节炎

在类风湿性关节炎的小鼠模型中，评价了化合物5-1的体内功效，在Balb/c小鼠中，通过给予抗胶原蛋白抗体和脂多糖诱导关节炎(Nandakumar等，Am.J.Pathol.2003,163:1827-1837)。具体方法如下：在第0天，在雌性Balb/c小鼠静脉内注射100mg/kg抗II型胶原蛋白的Chemico mAb合剂，在第1天，腹膜内注射1.25mg/kg脂多糖。在第2天至12天，按10mg/kg的化合物5-1，每天口服给药1次。结果表明，化合物5-1具有明显的体内抗类分湿性关节炎的作用，具体来讲，模型组中出现的炎性细胞浸润、滑膜增生、炎性肉芽组织形成，坏死组织出现等现象在化合物5-1治疗后得到明显改善。

Claims

1.一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于其具有通式II的结构：

及其药学上可接受的盐，其中：每一个Rd独立地是H、卤素、-CF₃、-CN、-NO₂、-OH、C₁-C₃的烷氧基、或-NH₂，X选自氟、氯和溴，Y₁、Y₂选自CH、N，Y₁、Y₂至少有一个选自N。

2.一种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，其特征在于其具有通式III的结构：

及其药学上可接受的盐，其中：X选自氟、氯和溴，Y₁、Y₂选自CH、N，Y₁、Y₂至少有一个选自N。

3.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种活性组分以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述活性组分是如权利要求1至2中任意一项所述的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂化合物、所述化合物在药学上可接受的盐中的任意一种或任意多种。

4.如权利要求1至2中任意一项所述的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂化合物及其在药学上可接受的盐在制备治疗从布鲁顿酪氨酸激酶活性的抑制中获益的疾病、障碍或病症的药物中的应用。

5.如权利要求1至2中任意一项所述的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂化合物及其在药学上可接受的盐在制备单独或和其他药物联合使用治疗细胞增生疾病的药物中的应用。

6.如权利要求1至2中任意一项所述的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂化合物及其在药学上可接受的盐在制备单独或和其他药物联合使用治疗癌症的药物中的应用。

7.如权利要求1至2中任意一项所述的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂化合物及其在药学上可接受的盐在制备单独或和其他药物联合使用治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

8.如权利要求1至2中任意一项所述的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂化合物及其在药学上可接受的盐在制备单独或和其他药物联合使用***的药物中的应用。