CN105768062A

CN105768062A - 一种复合羊肚菌益生菌功能性食品

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Publication number: CN105768062A
Application number: CN201610235540.7A
Authority: CN
Inventors: 邵素英
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明属于保健食品领域，具体涉及一种羊肚菌益生菌功能性食品。该功能性食品由以下重量份数的原料组成：羊肚菌酶解粉30‑70份，枸杞提取物20‑30份，银耳多糖10‑20份，低聚果糖2‑10份，小麦纤维2‑10份，大豆纤维2‑5份，茶多酚0.01‑0.03份，麦精10‑50份，植物乳杆菌粉剂20‑40份。本发明所提供的多糖提取方法使得多糖提取率得到提高，使产品具有较好的提高免疫力的效果，并且获得的产品具有较好的降解胆固醇的功效。

Description

一种复合羊肚菌益生菌功能性食品

技术领域：

本发明属于营养保健食品领域，具体涉及一种复合羊肚菌益生菌功能性食品。

背景技术：

羊肚菌是一种珍稀食用菌品种,因其菌盖表面凹凸不平、状如羊肚而得名。羊肚菌又称羊肚菜、羊蘑、羊肚蘑。用于食积气滞、脘腹胀满、痰壅气逆喘咳。羊肚菌又称羊肚菜、羊蘑。羊肚菌(Morchella)，又名草笠竹，是一种珍贵的食用菌和药用菌。其菌盖部分含有异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸7种人体必需的氨基酸，甘寒无毒，有益肠胃、化痰理气药效。羊肚菌的营养相当丰富，据测定，羊肚菌含粗蛋白20％、粗脂肪26％、碳水化合物38.1％，还含有多种氨基酸，特别是谷氨酸含量高达1.76％。人体中的蛋白质是由20种氨基酸搭配而组成的，而羊肚菌就含有18种，其中8羊肚菌种氨基酸是人体不能制造的，另外，据测定羊肚菌至少含有8种维生素：维生素B1、维生素B2、维生素B12、烟酸、泛酸、吡哕醇、生物素、叶酸等。羊肚菌的营养成份，可与牛乳、肉和鱼粉相当。因此，国际上常称它为“健康食品”之一。羊肚菌还含抑制肿瘤的多糖，抗菌、抗病毒的活性成分，具有增强机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等诸多作用。

真菌多糖又称多聚糖，是生物有机体内普遍存在的一类生物大分子，不仅参与组织细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。有一定的调节机体免疫功能的作用，其作用是多途径、多环节、多靶点的，如促进免疫细胞增殖与分化，分泌各种淋巴因子，调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)的平衡等。

真菌多糖对细胞有着极强的修复作用。服用真菌多糖保健食品，能及时补充细胞间质中缺乏的多糖等物质，使受损的细胞得到及时的修复，达到保持细胞健康、延长细胞寿命、从而实现人体健康的目的。上海医科大学李瑞等试验发现，真菌多糖能显著提高细胞膜的流动性和封闭度，衰老的细胞用真菌多糖培养后，封闭度提高11％，流动性提高32％，细胞膜流动性、封闭性的提高，表明细胞生理功能得到提高。

现代科技表明，真菌多糖是食用菌中所含的最重要的药效成分。是一种β-型的多糖，具有广泛的药理活性。灵芝、冬虫夏草、木耳、银耳、香菇、猴头菇、白灵菇、竹黄、云芝、鸡腿蘑、松茸、桑黄等食用菌，都含有真菌多糖。

中国发明专利201110407414.2公布了一种具有保健作用的真菌营养液，该营养液以香菇、灰树花、猴头菇、云芝等真菌为主要原料，辅以低聚木糖、异麦芽酮糖醇、牛磺酸、赖氨酸、维生素E、黄原胶和水等营养素加工而成，原料配伍科学，协同作用，具有提高人体免疫力和促进机体胃粘膜损伤修复双功能保健作用。

益生菌，是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。

调节肠胃功能紊乱是益生菌最广为人知的功能之一，除此之外，益生菌还具有产生营养物质、抵抗细菌病毒的感染以及预防治疗某些疾病的功能。本发明将提供一种添加有益生菌的复合真菌组合物，兼具真菌及多糖提高免疫力的功能以及益生菌的保健功效，改善目前保健品效果单一、复合功能不理想的问题。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明提供一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，由以下重量份数的原料组成：

羊肚菌酶解粉30-70份，枸杞提取物20-30份，银耳多糖10-20份，低聚果糖2-10份，小麦纤维2-10份，大豆纤维2-5份，茶多酚0.01-0.03份，麦精10-50份，植物乳杆菌粉剂20-40份。

所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量3-6倍的水，浸泡3-5小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5-1微米，胶体磨流量为0.4-1吨/小时；

(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到50-60℃，调整pH到4.5-6.0,加入羊肚菌子实体重量0.05-0.1％的纤维素酶、0.01-0.1％的β-葡聚糖酶、0.01-0.1％的蛋白酶，保温酶解0.5-1.5小时，酶解过程中不断搅拌；

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉；

所述枸杞提取物制备方法如下：

枸杞粉碎，过40-50目筛后，添加枸杞3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30-45℃，2-4小时后调整温度为55-60℃1-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的枸杞残渣中添加75-85℃热水，热水添加量为枸杞残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得枸杞提取物；

所述银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(2)超声热水浸提：按过筛后的银耳与水质量体积比1-3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；

(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；

(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；

(5)离心分离获得上清液；

(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥，即得银耳多糖。

所述植物乳杆菌粉剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2015制备，该菌已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101；

所述植物乳杆菌粉剂中活菌含量为：7×10¹²-9×10¹²cfu/g；

所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12-16h，使菌体处于对数生长中期；

(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10-15％，35-38℃下100-200rpm培养8-12小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养60-70小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。

所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10-12g，牛肉膏10-12g，酵母膏5-8g，柠檬酸氢二铵2-4g，葡萄糖20-25g，吐温80 1-2mL，乙酸钠5-7g，磷酸氢二钾2-3g，硫酸镁0.58-0.6g，硫酸锰0.25-0.3g，胆固醇100-120mg，中草药粉剂5-8g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6；

所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10-12mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100-120μg/mL；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取五味子10-20份；党参10-15份；山楂10-20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度45-60℃保持2～4h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6-7，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5～1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；

所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10％；

所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶15-20份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，酸性磷酸酶5-10份；

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-2。

所述复合羊肚菌益生菌功能性食品的制备方法为：按本领域常规方法加工为片剂、粉剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊等，直接服用，也可以作为食品原料使用。

有益效果：

1、本发明所提供的复合羊肚菌益生菌功能性食品中除含有羊肚菌酶解粉、枸杞提取物、银耳多糖外还含有植物乳杆菌CGMCC NO.11763，该菌株①降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，可有效的分解人们由于饮食不当而摄入的亚硝酸盐；②该菌对胆固醇降解率高，可达到64.76％，尤其适用于肥胖人群及三高患者；③该菌黏附能力高，测定的自凝集率为95.71％，可有效地定植于胃肠道***中，充分发挥其生理活性作用。

2、本发明所提供的植物乳杆菌培养方法中，发酵培养基中添加有中药成分五味子、党参和山楂，这三种重要成分的添加可有效提高植物乳杆菌的耐酸耐胆盐能力，从而提高其在人体肠道中发挥的作用。

3、本发明所提供的植物乳杆菌培养方法中，发酵培养基中以可溶性形式添加有胆固醇，发酵完成后可有效提高菌株降解胆固醇的能力。由于本发明提供的产品中添加有所述植物乳杆菌，使得本发明除了具有提高人体免疫力能力外，还具有较好的降解胆固醇的能力。

具体实施方式：

实施例1：一种复合羊肚菌益生菌功能性食品

一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，由以下重量份数的原料组成：

羊肚菌酶解粉30份，枸杞提取物20份，银耳多糖10份，低聚果糖2份，小麦纤维2份，大豆纤维2份，茶多酚0.01份，麦精10份，植物乳杆菌粉剂20份。

所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量3倍的水，浸泡3小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5微米，胶体磨流量为0.4吨/小时；

(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到50℃，调整pH到4.5-6.0,加入羊肚菌子实体重量0.05％的纤维素酶、0.01％的β-葡聚糖酶、0.01％的蛋白酶，保温酶解0.5小时，酶解过程中不断搅拌；

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉；

所述枸杞提取物制备方法如下：

枸杞粉碎，过40目筛后，添加枸杞3倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30℃，2小时后调整温度为55℃1小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的枸杞残渣中添加75℃热水，热水添加量为枸杞残渣重量的2倍，处理时间30分钟，连续提取2次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得枸杞提取物；

所述银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(2)超声热水浸提：按过筛后的银耳与水质量体积比1：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；

(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；

(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；

(5)离心分离获得上清液；

所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h，使菌体处于对数生长中期；

(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10％，35℃下100rpm培养8小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养60小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。

所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，胆固醇100mg，中草药粉剂5g，蒸馏水1000mL，pH6.2；

所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100μg/mL；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取五味子10份；党参10份；山楂10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度45℃保持2h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；

所述混合酶添加量为混合物料总重量的5％；

所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶15份，β-淀粉酶10份，果胶酶10份，酸性蛋白酶10份，酸性磷酸酶5份；

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1。

实施例2一种复合羊肚菌益生菌功能性食品

羊肚菌酶解粉70份，枸杞提取物30份，银耳多糖20份，低聚果糖10份，小麦纤维10份，大豆纤维5份，茶多酚0.03份，麦精50份，植物乳杆菌粉剂40份。

所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量6倍的水，浸泡5小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为1微米，胶体磨流量为1吨/小时；

(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到60℃，调整pH到6.0,加入羊肚菌子实体重量0.1％的纤维素酶、0.1％的β-葡聚糖酶、0.1％的蛋白酶，保温酶解1.5小时，酶解过程中不断搅拌；

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉；

所述枸杞提取物制备方法如下：

枸杞粉碎，过50目筛后，添加枸杞6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度45℃，4小时后调整温度为60℃2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的枸杞残渣中添加85℃热水，热水添加量为枸杞残渣重量的4倍，处理时间50分钟，连续提取3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得枸杞提取物；

所述银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(2)超声热水浸提：按过筛后的银耳与水质量体积比3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；

(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；

(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；

(5)离心分离获得上清液；

所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养16h，使菌体处于对数生长中期；

(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为15％，38℃下200rpm培养12小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养70小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。

所述发酵培养基组成如下：蛋白胨12g，牛肉膏12g，酵母膏8g，柠檬酸氢二铵4g，葡萄糖25g，吐温80 2mL，乙酸钠7g，磷酸氢二钾3g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.3g，胆固醇120mg，中草药粉剂8g，蒸馏水1000mL，pH6.6；

所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为12mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为120μg/mL；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取五味子20份；党参15份；山楂20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度60℃保持4h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为7，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；

所述混合酶添加量为混合物料总重量的10％；

所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶20份，β-淀粉酶15份，果胶酶15份，酸性蛋白酶15份，酸性磷酸酶10份；

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：2。

实施例3：一种复合羊肚菌益生菌功能性食品

羊肚菌酶解粉50份，枸杞提取物25份，银耳多糖15份，低聚果糖7份，小麦纤维7份，大豆纤维3份，茶多酚0.02份，麦精30份，植物乳杆菌粉剂30份。

所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(2)水溶均质：将粉碎后的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体质量5倍的水，浸泡4小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.8微米，胶体磨流量为0.8吨/小时；

(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液转移到不锈钢酶解罐中加热到55℃，调整pH到5.0,加入羊肚菌子实体重量0.08％的纤维素酶、0.08％的β-葡聚糖酶、0.08％的蛋白酶，保温酶解1小时，酶解过程中不断搅拌；

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉；

所述枸杞提取物制备方法如下：

枸杞粉碎，过45目筛后，添加枸杞5倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度40℃，3小时后调整温度为60℃2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的枸杞残渣中添加80℃热水，热水添加量为枸杞残渣重量的3倍，处理时间40分钟，连续提取3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得枸杞提取物；

所述银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(2)超声热水浸提：按过筛后的银耳与水质量体积比2：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；

(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；

(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；

(5)离心分离获得上清液；

所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：

(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为12％，37℃下150rpm培养10小时，溶氧控制10％(通气0.5L/min)，之后再厌氧培养65小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。

所述发酵培养基组成如下：蛋白胨11g，牛肉膏11g，酵母膏6g，柠檬酸氢二铵3g，葡萄糖22g，吐温80 1.5mL，乙酸钠6g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.25g，胆固醇110mg，中草药粉剂6g，蒸馏水1000mL，pH6.5；

所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为11mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为110μg/mL；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取五味子15份；党参12份；山楂15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度50℃保持3h，加入混合酶制剂进行酶解，调节pH值为6.5，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取1h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；

所述混合酶添加量为混合物料总重量的8％；

所述混合酶的重量份数组成为：木聚糖酶18份，β-淀粉酶12份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，酸性磷酸酶8份；

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。

实施例4效果实验

1、植物乳杆菌CGMCC NO.11763的培养

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

(2)将对数期的菌种接入装有发酵培养基的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。

发酵培养基：

①：蛋白胨11g，牛肉膏11g，酵母膏6g，柠檬酸氢二铵3g，葡萄糖22g，吐温80 1.5mL，乙酸钠6g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.25g，胆固醇110mg，中草药粉剂6g，蒸馏水1000mL，pH6.5；

②：删去①中的胆固醇；

③：删去①中的中草药粉剂；

2、降解胆固醇能力测定

步骤1中分别以发酵培养基①和②为发酵培养基完成发酵后，分别取1ml发酵液离心并用无菌水洗涤2遍后重悬于1ml无菌水中，分别接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，取以上培养不同时间的菌液样品各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCC NO.11763对胆固醇有很好的降解作用，60h小时后，降解率可达到64.76％。并且，添加有胆固醇的培养基所培养出的CGMCC NO.11763降解胆固醇的能力显著提高。

表1对胆固醇的降解情况。

3、耐胆盐实验

步骤1中分别以发酵培养基①和③为发酵培养基完成发酵后，分别取1ml发酵液离心并用无菌水洗涤2遍后重悬于1ml无菌水中，分别接种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.4％、0.6％、1％)的10mL MRS液体培养基(pH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.51±0.92×10⁷(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力，而采用添加有中草药成分的培养基，其耐胆盐能力有效提高。

表2耐胆盐能力检测(×10⁷cfu/ml)

4、耐酸实验

步骤1中分别以发酵培养基①和③为发酵培养基完成发酵后，分别取1ml发酵液离心并用无菌水洗涤2遍后重悬于1ml无菌水中，分别接种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mL MRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力，且添加有中草药成份的培养基能有效提高该菌的耐酸性。

表3耐酸能力检测(×10⁷cfu/ml)

5、亚硝酸盐分解实验

步骤1中以①培养基，发酵过程中根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCNO.11763对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，CGMCC NO.11763对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。

6、黏附能力测定

培养CGMCC NO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCC NO.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCNO.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。

表5黏附能力表

类别	A_0平均值±s	A_24平均值±s	凝集率％
				11763磷酸盐混合液	0.5131±0.0045	0.0220±0.0369	95.71

实施例5本发明的益生性试验

将本发明实施例3制备的产品，用无菌水制备成活菌数为2×10¹⁰CFU/mL的益生菌溶液，于4℃保存备用；

1、模拟胃液及肠液的耐受试验：

取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。

取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水100mL使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。

取1mL保存好的益生菌溶液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于30-45℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明，活菌存活率为97％。然后取在人工胃液中消化不同时间的培养液各1mL，分别接种于9mL pH值为6.8的人工肠液中，置于30-45℃静置培养2-4h，并分别在0、3、6、24h取样，测定其活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率为99％。

2、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.8％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将0.5mL保存好的益生菌溶液接种到4.5mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存的活菌数。将培养液在灭菌生理盐水中十倍逐级稀释至10-8，并用MRS倾注，然后置于35℃静置培养24h。

结果表明活菌存活率为99％。

以上试验结果表明，本发明营养保健食品中的益生菌益生性(耐pH性、耐胆盐)较强，非常适合人体胃肠环境，在模拟胃肠环境中存活率大，可有效改善胃肠功能。

需要说明的是：本发明实施例1-3制备的营养保健食品同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

实施例6本发明对降胆固醇效果实验

1.实验材料

1.1实验动物及饲料

昆明种小鼠，♂性，体重(20±2)g，由广州中医药大学实验动物中心提供；

普通饲料为市售小鼠饲料；高脂饲料由为60％普通饲料+10％猪油+10％奶粉+10％蛋黄粉+7％白糖+2％花生+0.5％盐+0.5％麻油；

1.2试剂

总胆固醇试剂盒(TCH，浙江东欧诊断产品有限公司)

饲喂试剂配置：

样品液①：2g实施例3产品加入50mLsj超纯水，振荡混匀，即得；

样品液②：实施例3产品制备过程中CGMCC NO.11763发酵培养基去除胆固醇，其他条件不变制备的产品2g加入50mL超纯水，振荡混匀，即得

对照液：纯水；

2.方法

2.1小鼠的分组与饲养

小鼠适应性喂养5天后，随机分为2组：空白组、实验组，每组20只；饲喂75天；

空白组：高脂饲料，给纯水，体积与样品液溶液体积相同；

实验组①：高脂饲料，给样品液①800mg/kg.d；

实验组②：高脂饲料，给样品液②800mg/kg.d；末次给药后，禁食不禁水12小时，眼眶取血制备血清，依试剂盒说明书方法测定总胆固醇(TC)；实验结果如下：

组别	实验前	75天
			空白组	2.32±0.25	3.15±0.32
实验组①	2.31±0.13	2.40±0.17
			实验组②	2.32±0.21	2.58±0.22

由实验结果可知，实验前后，实验组和对照组小鼠血清中胆固醇差异显著，本发明所述产品对降低血清中胆固醇含量具有明显的效果。

实施例7本发明产品提高免疫力的效果实验

本产品实施例3产品在冬季选择北京地区100位年龄在60-75岁体弱易感冒的老年人连续食用1月，每日食用5克，以食用前和食用后效果比较，结果见表1，结果表明本产品对提高老年人抵抗力、增强身体免疫力有明显效果，产品有良好的食用和营养滋补功效。同时能够显著提高睡眠质量，改善率达到70％(以有质量睡眠时间为评估依据)许多连续食用本产品老人反映久服效果更佳，全年不感冒，身体状况更好.

表6食用效果对照表

人数	食用前30天感冒次数(总计)	食用2月后30天内感冒次数(总计)
			100	31	6

实施例8银耳多糖提取效果对比试验

方法1：银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(2)超声热水浸提：按3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提0.5h；

(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；

(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；

(5)离心分离获得上清液；

(6)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥称重，即得银耳多糖。

方法2：银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(2)超声热水浸提：按3：20的比例加入纯净水，在pH7条件下，400W超声波，105℃水浴浸提140min；

(3)离心分离获得上清液；

(4)上清液减压浓缩得浓缩液，添加浓缩液3倍体积的95％乙醇，4℃下醇析24h，弃去上清液，再加入与初始浓缩液等体积的无水乙醇静置30min后，弃去上清液，沉淀洗涤3次，喷雾干燥称重，即得银耳多糖。

银耳多糖粗提取率(％)＝(粗多糖干重/银耳子实体烘干后干重)×100

根据上述公式计算上述两种提取方法对银耳多糖粗提取率的影响，方法1银耳多糖粗提取率为20.22％，方法1银耳多糖粗提取率为17.13％，可见，间歇热蒸汽浸提能有效提高超声热水浸提对银耳多糖的粗提取率。

Claims

1.一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，由以下重量份数的原料组成：羊肚菌酶解粉30-70份，枸杞提取物20-30份，银耳多糖10-20份，低聚果糖2-10份，小麦纤维2-10份，大豆纤维2-5份，茶多酚0.01-0.03份，麦精10-50份，植物乳杆菌粉剂20-40份；

所述植物乳杆菌粉剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2015制备，保藏号为CGMCC NO.11763。

2.如权利要求1所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉；

所述枸杞提取物制备方法如下：

枸杞粉碎，过40-50目筛后，添加枸杞3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温度30-45℃，2-4小时后调整温度为55-60℃ 1-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的枸杞残渣中添加75-85℃热水，热水添加量为枸杞残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得枸杞提取物。

3.如权利要求1所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述银耳多糖提取方法如下：

(1)取市售的银耳烘干粉碎后过80目筛；

(3)热蒸汽浸提：将上述提取体系置于灭菌锅，121℃，5min；

(4)循环重复步骤(2)、(3)4次；

(5)离心分离获得上清液；

4.如权利要求1所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂中活菌含量为：7x10¹²-9x10¹²cfu/g。

5.如权利要求1所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述植物乳杆菌粉剂的制备方法如下：

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12-16h，使菌体处于对数生长中期；

(2)将对数期的菌种接入发酵培养基中，接种量为10-15％，35-38℃下100-200rpm培养8-12小时，溶氧控制10％，之后再厌氧培养60-70小时；发酵完毕发酵液静置沉淀、离心得到沉淀物，然后添加沉淀物质量1倍的载体，混合均匀，50℃流化床干燥即得植物乳杆菌粉剂，载体重量份数组成为：酸奶粉25份，糊精12份。

6.如权利要求5所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：蛋白胨10-12g，牛肉膏10-12g，酵母膏5-8g，柠檬酸氢二铵2-4g，葡萄糖20-25g，吐温80 1-2mL，乙酸钠5-7g，磷酸氢二钾2-3g，硫酸镁0.58-0.6g，硫酸锰0.25-0.3g，胆固醇100-120mg，中草药粉剂5-8g，蒸馏水1 000mL，pH 6.2～6.6。

7.如权利要求6所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述胆固醇的添加方法为：先用无水乙醇溶解胆固醇，配制浓度为10-12mg/mL的胆固醇溶液,然后按一定比例添加到培养基中，使胆固醇最终浓度为100-120μg/mL。

8.如权利要求6所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：

所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10％；

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-2。

9.如权利要求1所述的所述的一种复合羊肚菌益生菌功能性食品，其特征在于，由以下重量份数的原料组成：羊肚菌酶解粉50份，枸杞提取物25份，银耳多糖15份，低聚果糖7份，小麦纤维7份，大豆纤维3份，茶多酚0.02份，麦精30份，植物乳杆菌粉剂30份。

10.权利要求1所述复合羊肚菌益生菌功能性食品在保健领域的应用。