CN105755010A

CN105755010A - 一种调控杨树木材产量的基因及其应用

Info

Publication number: CN105755010A
Application number: CN201610150078.0A
Authority: CN
Inventors: 周功克; 柴国华; 唐贤丰; 陈艳; 祁广; 王殿; 贺郭
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2016-07-13

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体的说是一种调控杨树木材产量的基因及其应用。R2R3?MYB基因PagMYB199的碱基序列如SEQ ID No.1中所示。所述PagMYB199基因作为增加杨树木材产量，进而缩短其育种周期的调控基因的应用。本发明从杂交杨（Populus alba×P. glandulosa cv ˊˊ84kˊ）中克隆得到的PagMYB199基因，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

一种调控杨树木材产量的基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说是一种R2R3-MYB基因PagMYB199及其应用。

背景技术

杨树具有基因组小，易于转化，生长快速等特点，是研究林木遗传发育及基因工程改良的模式植物，同时也是重要的经济树种，在我国广泛种植，主要用作造纸、建筑用料以及能源原料。但长期以来，杨树存在育种周期长、木材产量低等突出问题。因此，挖掘、利用与杨树生物量（木材产量）调控相关的重要基因不仅有助于加深对木材分子调控机理的理解，而且也为增加杨树木材产量和纤维含量等方面提供理论依据和应用指导。

杨树R2R3-MYB基因家族包含194个成员，形成81个基因对，来源于多种复制，有5种不同的进化命运，其成员参与众多发育过程（Chai et al., 2014）。其中，杨树PtrMYB2、PtrMYB3、PtrMYB20、PtrMYB21是拟南芥MYB46的同源基因，受PtrWND的直接调控，能够正调控木材（次生木质）的形成（McCarthy et al., 2010; Zhonget al., 2011; 2013）。桉树木质部特异表达的EgMYB2基因在木材形成和木质素积累过程中也能起到重要调控作用（Goicoechea, et al., 2005）。这些研究结果表明MYB转录因子在木材的形成中起关键作用。我们通过生物信息学在杨树中鉴定了一个R2R3-MYB基因PagMYB199，该基因在茎秆中大量表达（图3），意味着其可能参与杨树木材的形成。

木材作为一种重要的工业原料，对其研究意义重大。但传统的改良措施对于生长周期相对较长的林木类植物的改造功效十分有限，因此需要提供一种能够促进木材发育，增加生物量的基因材料。

发明内容

本发明目的在于提供一种R2R3-MYB基因PagMYB199及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种R2R3-MYB基因PagMYB199，R2R3-MYB基因PagMYB199的碱基序列如SEQ ID No.1中所示。

R2R3-MYB基因PagMYB199的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中所示。

一种R2R3-MYB基因PagMYB199的应用，所述PagMYB199基因作为增加杨树生物量（木材产量），进而缩短其育种周期的调控基因的应用。

一种植物表达载体，载体带有所述R2R3-MYB基因SEQ ID No.1核苷酸序列。

所述植物为杨树。

一种植物表达载体的应用，所述植物表达载体在增加杨树生物量中的应用。

本发明所具有的优点：

1.本发明从杨树中获得茎秆木质部特异表达的PagMYB199基因；

2.本发明通过获得的茎秆木质部特异表达的PagMYB199基因，构建PagMYB199基因的过表达和反义抑制载体，过表达转基因植株相对于对照矮小，反义抑制植株高大，其具有较大的研究价值和应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的qRT-PCR 分析杨树PagMYB199基因的组织表达模式图；杨树PdUBQ10 基因用作内参，结果显示这个基因在杨树茎的木质部中大量表达。

图2为本发明实施例提供的杨树PdC3H17 基因过表达和反义抑制载体的构建示意图。

图3为本发明实施例提供的qRT-PCR 分析PagMYB199在转基因杨树中的表达水平示意图。其中， CK-1, 转入空载体的转基因杨树；OE-26，27，29，过表达转基因株系；ANTI-3，6，18，反义抑制转基因株系。杨树PdUBQ10 基因用作内参。

图4为本发明实施例提供的杨树PagMYB199转基因植株（温室培养4个月）的表型分析图。CK-1, 2，转入空载体的转基因株系；OE-26，27，过表达转基因株系；ANTI-3，6，反义抑制转基因株系。

具体实施方式

实验所涉及的药品均购自Sigma 公司、Fermentas 公司、Thermo Fisher公司、上海生工公司。具体实验操作依据《分子克隆》。

实施例1 杨树R2R3-MYB基因PagMYB199的分子克隆

1.杨树PagMYB199基因的克隆

取培养室生长6个月左右的杨树茎秆，利用CTAB法提取其总RNA，利用RT-PCR技术扩增PagMYB199基因的全长cDNA，将其连入pMD18-T中测序（参见SEQ ID No.1）。扩增条件为：95℃ 5 min 预变性；94 30 s, 55 ℃ 40s, 72 ℃ 1 min, 35个循环；72 ℃ 8 min 片段延伸。扩增引物为：

PagMYB199cDNAF: 5’- ATGGGCAGACAACCTTGTTG- 3’；

PagMYB199cDNAR: 5’- TTAATGCTTGCCACCCATGTC -3’；

2.杨树PagMYB199基因的序列信息与特性分析

PagMYB199基因包含831bp的编码区（参见SEQ ID No. 1），编码蛋白的分子量为30.7kDa，N端有一个由96个氨基酸组成的R2R3-MYB保守结构域，是典型的R2R3-MYB蛋白。

3.杨树PagMYB199基因的表达模式分析

以培养室生长6个月的杨树为材料，选取其根、叶、芽、皮层、木质部和韧皮部，利用CTAB 法（Chai et al., 2014）分别提取其总RNA，反转录得到第一链cDNA。以PagMYB199qPCRF/R(5’- GGGTGAGTGGGGCTTTGTTCTCTG- 3’; 5’- AGGGCCCTTCTTCACACCGAGTTT- 3’)为引物，利用现有的qRT-PCR方法检测杨树PagMYB199基因在这六个组织中的表达情况。扩增条件为：95 ℃ 3 min 预变性；94 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环；72 ℃ 5 min 片段延伸。杨树PdUBQ10基因用作内参。结果表明PagMYB199基因在茎的木质部中大量表达（参见图1）。

实施例2 杨树R2R3-MYB基因PagMYB199的转基因应用

1.杨树PagMYB199基因过表达和反义抑制载体的构建

分别将杨树PagMYB199基因全长cDNA正向和反向连接到pCAMBIAL1300载体中，测序正确后得到含有PagMYB199基因的植物过表达和反义抑制载体（参见图2）。

2.农杆菌介导转化杨树

选取生长4周左右且状态良好的杂交杨叶片, 去除主脉和叶边缘, 将其剪成大小一致的叶盘, 放入分化培养基中黑暗预培养3天。同时，将PagMYB199过表达和反义抑制载体转入农杆菌EHA105，28℃培养至OD₆₀₀ = 1.0-1.3，制备成侵染液。将预培后的叶盘浸入制备好的侵染液中侵染20 min, 期间不断地摇动使叶盘与菌液充分接触; 取出叶盘用无菌滤纸吸干多余菌液, 放回原培养基中, 黑暗共培养4天后转至筛选培养基（MS+0.5 mg/l KT+1 mg/l 2,4-D+1 mg/l Hyg）中; 每15天换1次培养基, 待可见芽出现, 再把叶盘转至芽伸长培养基（MS+0.02 mg/l TDE+ 2 mg/l Hyg）, 芽长至1-2 cm时转入生根培养基（MS+ 2 mg/l Hyg）诱导生根。

3.转基因植株分子鉴定

取生长1个月的候选转基因杨树叶片，在液氮中利用CTAB法提取其总RNA，用DNAase I （Sigma 公司）去除可能污染的基因组DNA，然后利用反转录试剂盒（Fermentas 公司）反转录成第一链cDNA。以PagMYB199qPCRF/R为引物，利用qRT-PCR法检测其相对于对照植株（转化空载体）的表达水平。扩增条件为：95 ℃ 3 min 预变性；94 10 s, 60 ℃ 20s, 72 ℃ 20 s, 40个循环；72 ℃ 5 min 片段延伸。杨树PdUBQ10基因用作内参。结果如图3所示， PagMYB199基因在3个代表性过表达植株中的表达量要比对照高，而在3个代表性反义抑制植株中的表达量要比对照低，表明这些植株确实是PagMYB199过表达和反义抑制转基因植株。

4. PagMYB199过表达植株矮小，而反义抑制植株高大

观察温室培养4个月PagMYB199转基因植株的表型，相对于对照（转化空载体），过表达植株生长受到抑制，茎秆变矮、变细，生物量减少，而反义抑制植株生长受到促进，茎秆变高、***，生物量增加（参见图4）。

SEQ ID No.1：

ATGGGCAGACAACCTTGTTGCGACAAACTTGGTGTGAAGAAGGGCCCTTGGACAGCTGAGGAAGACAAGAAGTTGGTCAATTTTATTCTCACACATGGCCAATGTTGCTGGCGTGCTGTACCCAAGCTCGCCGGACTCCGCCGGTGTGGCAAGAGCTGCCGTCTTCGCTGGACTAATTACCTCCGGCCTGACTTGAAGAGAGGCCTTCTTAACGAGGATGAGGAGCAACTTGTCATTGACCTCCATGCTTGCCTTGGCAACAGGTGGTCCAAAATCGCAGCAAGATTGCCGGGAAGAACAGATAATGAGATCAAGAATCACTGGAATACCCACATTAAGAAAAAGCTAATAAAGATGGGAATTGATCCTGTTACGCACGAGCCTCTCAGTAAACAAGGGAGCCCGCAAGAAAGTATAGTACCTTGTCACAGTAATTATGATCAACCCAATTTTAACGCTGATGGTCAGCAGGTCCTCCCCCAAAATTGTGGCCATGCCTCCTCTAGCACTACTGATAATTCAAGCACGACCACCCCGACTGAAAATTCTTCAGTGGATGAATGCATAGGGTCATCAGAACCTAACAGTACTACTGACAGTGATCCACTAATGAGTTGCCTATGGTCGGAGGTATTTCTTGATGATTCATCTTGGAACTTTCAAGCCACTAGAGGAGGAGATTATGGTGAATTCGGGCTATCTAAATCTTCATCAGAGGATAGTAACTCTCCATGGGTTTTAGACTCTCAGGATCTTGGAGATGAATTCTTTGGACTTAGTTGTTTCAGTGACATGGACTTGAGTATCCTAGACATGGGTGGCAAGCATTAA

（a）序列特征：

●长度：831

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：杂交杨的茎秆

SEQ ID No.2：

MGRQPCCDKLGVKKGPWTAEEDKKLVNFILTHGQCCWRAVPKLAGLRRCGKSCRLRWTNYLRPDLKRGLLNEDEEQLVIDLHACLGNRWSKIAARLPGRTDNEIKNHWNTHIKKKLIKMGIDPVTHEPLSKQGSPQESIVPCHSNYDQPNFNADGQQVLPQNCGHASSSTTDNSSTTTPTENSSVDECIGSSEPNSTTDSDPLMSCLWSEVFLDDSSWNFQATRGGDYGEFGLSKSSSEDSNSPWVLDSQDLGDEFFGLSCFSDMDLSILDMGGKH*

（a）序列特征：

●长度：276

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：杂交杨的茎秆

Claims

1.一种R2R3-MYB基因PagMYB199，其特征在于：R2R3-MYB基因PagMYB199的碱基序列如SEQ ID No.1中所示。

2.按权利要求1所述的R2R3-MYB基因PagMYB199的编码蛋白，其特征在于：R2R3-MYB基因PagMYB199的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中所示。

3.一种权利要求1所述的R2R3-MYB基因PagMYB199的应用，其特征在于：所述PagMYB199基因作为增加杨树生物量（木材产量），进而缩短其育种周期的调控基因的应用。

4.一种植物表达载体，其特征在于：载体带有所述R2R3-MYB基因SEQ ID No.1核苷酸序列。

5.按权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物为杨树。

6.一种权利要求4所述的植物表达载体的应用，其特征在于：所述植物表达载体在增加杨树生物量中的应用。