CN113564198A - 一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用 - Google Patents

一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用，其中所述PALM1基因是蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALMATA‑LIKE PENTAFOLIATA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述对PALM1基因进行RNAi的方法是：设计引物，通过RT‑PCR技术从紫花苜蓿中克隆PALM1基因；并为了避开该基因保守结构域，在其C端设计RNAi引物，扩增紫花苜蓿PALM1基因中如SEQ ID No.2所示的PALM1‑C‑RNAi片段，并将该片段转入载体pANDA35HK构建得到RNAi重组载体MsPALM1‑RNAi；然后进行遗传转化野生型紫花苜蓿野生型实验，通过愈伤再生的方式获得转基因MsPALM1‑RNAi株系，实现提高豆科牧草小叶数量。实验证实转基因植株的小叶数量显著提高，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物或后续的牧草品质改良，对我国草业生产具有重大意义和经济价值。

Description

一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用
技术领域
本发明涉及一种改良豆科牧草品质基因的应用，尤其涉及一种对蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALM1(PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1)进行RNAi以提高豆科牧草(以紫花苜蓿为例)小叶数量的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
苜蓿是豆科牧草的一种，是当今世界分布最广的栽培牧草，也是最为重要的一种多年生优质牧草。随着我国草食畜牧业和奶业的快速发展，国内对于高质量苜蓿的需求日益增长。但是目前国产苜蓿存在产量少、品质差、货源不稳定等问题，国产苜蓿的短缺情况已经成为限制我国草食畜牧业和奶业发展的一个重要因素。因此苜蓿的产量和品质改良是我国草业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。
苜蓿的产草量是以收获叶和茎为主，叶最多可贡献产草量的60％。叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是栽培管理及病虫害监测的主要研究对象。由于叶片储藏了苜蓿70％的蛋白质，而且叶片纤维含量仅为茎秆的1/3，因此叶茎比值越大，苜蓿的营养价值就越高，适口性就越好，同时利用价值也就相对越高。所以在苜蓿品质的评价体系中，叶茎比(叶片与茎秆重量的比值)是其中一个重要的指标。而选育叶量丰富、叶茎比高的苜蓿新品种一直是苜蓿育种工作者追求的目标。目前苜蓿叶片增多的性状已被作为一种形态学标记，被认为具有高产和优质的潜力。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降的一种基因编辑技术。
植物的叶发育模式分为单叶和复叶。单叶结构指得是在一个叶柄上只有一个小叶片，而复叶结构指得是在一个叶柄上有多个小叶片生成。蒺藜苜蓿的叶为复叶结构，包括三个小叶片。据已有的报道，三叶发育模式是由PALM1基因(PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1)决定的。发明人利用蒺藜苜蓿与紫花苜蓿的基因组高度相似性，克隆了紫花苜蓿的PALM1基因(MsPALM1)，并构建RNAi载体转化野生型紫花苜蓿(SY4D)，通过遗传转化技术获得了MsPALM1-RNAi转基因株系，并对MsPALM1-RNAi在复叶物种中调控小叶片数目进行了研究。经检索，有关在紫花苜蓿中获得PALM1基因的RNAi株系以及关于MsPALM1-RNAi在复叶物种中调控小叶片数目的应用目前还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种对蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALM1(PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1)进行RNAi以提高豆科牧草(以紫花苜蓿为例)小叶数量的应用。
本发明所述的对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用，其特征在于：所述PALM1基因是蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述对PALM1基因进行RNAi的方法是：设计引物，其中正向引物序列为CTTCCTACAATAGTTCTAGTCCT、反向引物序列为TTGGTGTTGGCTTGTTCCC，通过RT-PCR技术从紫花苜蓿中克隆PALM1基因；并为了避开该基因保守结构域，在其C端设计RNAi引物，其中所述正向引物序列为TGGATTGTGCCTTCTTTACCAT、反向引物序列为CATGACCGTTATCATCAA，扩增紫花苜蓿PALM1基因中如SEQ ID No.2所示的284bp的基因片段，命名为PALM1-C-RNAi，并将该片段转入RNAi载体pANDA35HK构建得到RNAi重组载体，命名为MsPALM1-RNAi；将构建的MsPALM1-RNAi载体进行遗传转化野生型紫花苜蓿野生型(SY4D)实验，通过愈伤再生的方式获得转基因MsPALM1-RNAi株系，实现提高豆科牧草小叶数量。
上述对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用中：所述豆科牧草优选是苜蓿、紫花苜蓿或三叶草。
本发明还公开一种提高豆科牧草小叶数量的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是MsPALM1-RNAi，其中含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
其中：所述豆科牧草优选是苜蓿、紫花苜蓿或三叶草。
实验证实：本发明提供的对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用具有显著效果，紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因经过RNAi后表达量相比于野生型(SY4D)表达量有明显下调；紫花苜蓿转基因MsPALM1-RNAi株系表型小叶片数量由三个变为五个，提示应用本发明所述紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因进行RNAi操作，可显著提高植物的小叶片数量，同时也证明PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因经过RNAi抑制其功能后植株的小叶数目会明显增多。也预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，并可用于后续的牧草品质改良，对我国草业生产具有重大意义和经济价值。
附图说明
图1.紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因经过RNAi后表达量的测定。
其中：三个转基因株系相比于野生型(SY4D)表达量都具有明显下调。
图2.紫花苜蓿MsPALM1-RNAi转基因植株的表型分析。
紫花苜蓿的野生型复叶结构包括三个小叶，MsPALM1-RNAi转基因植株的小叶数量由三个变为五个。这证明PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因经过RNAi抑制其功能后植株的小叶数目明显增多。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、质粒、试剂或试剂盒等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因的克隆
通过生物信息学网站NCBI获得拟南芥PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1的序列，然后利用BLAST进行序列比对搜索，获得紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1的基因组序列，其中所述紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
根据SEQ ID No.1序列设计正向引物CTTCCTACAATAGTTCTAGTCCT和反向引物TTGGTGTTGGCTTGTTCCC。利用TRIzol试剂盒提取紫花苜蓿RNA。实验步骤如下：
1)取样品(≤100mg)立刻放入2ml加钢珠的EP管中并放入液氮，用研磨机打碎。研磨机参数：26-30HZ，60秒，2)加入1ml Trizol-RT，恒温混匀仪涡旋震荡，2000rpm，3min；3)加入400ul DEPC水，恒温混匀仪涡旋震荡，2000rpm，3min；静置5min，12000rpm室温离心15min；4)取上清移入1.5ml EP管(一式两份，600ul/管)，加等体积异丙醇，轻轻混匀，在室温中静置15min，并12000rpm离心10min，弃上清；5)加入800-1000ul 75％乙醇洗涤沉淀，将沉淀轻轻弹起，4000rpm室温离心3min；再次用75％乙醇重复洗涤沉淀，倒掉上清，瞬时离心，乙醇尽量用枪尖吸尽，然后置于超净工作台1～2min，直至边缘半透明时取出，注意：应避免RNA过度干燥，否则极难再次溶解；6)加入70ul DEPC水，轻弹，60℃金属浴10min；7)室温放置2min，放冰上测浓度。
将得到的紫花苜蓿RNA反转录得到Cdna，方法如下：
反转录试剂盒：Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
(1)溶解反转录试剂盒中的冷冻试剂，可以将试剂轻度离心收集至管底，注意：试剂始终保持放在冰上；
(2)将无RNase的PCR小管置于冰上，做好标记，配制20ul的反应体系，RNA反转的量为2-3ug；
Figure BDA0003171012990000041
(3)将上述反应体系放入PCR中，65℃反应10min，使模板与引物混合物变性，反应结束后将管子置于冰上冷却；
(4)在体系中加入其余的试剂盒反应试剂：
Figure BDA0003171012990000042
Figure BDA0003171012990000051
将上述体系小心混匀，瞬时离心至管底，设置PCR程序，25℃10min，55℃30min，85℃5min(使逆转录酶失活)，反应结束后放在-20℃冰箱保存。
用RT-PCR方法扩增PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因的全长CDS序列，方法及条件是：
(1)反应体系(50μl)
Figure BDA0003171012990000052
(2)反应程序
Figure BDA0003171012990000053
进行电泳，然后胶回收，进行加A反应，方法及条件是：
(1)加A反应体系(10μl)
Figure BDA0003171012990000054
(2)反应程序：
72℃ 30min
16℃ End
然后连接pEARLEYGATE201载体，方法及条件是：
(1)反应体系
Figure BDA0003171012990000061
(2)金属浴25℃，反应1h
然后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。
实施例2紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1 RNAi植株的获得
为了抑制紫花苜蓿中内源PALM1基因的功能，发明人避开保守结构域，在PALM1基因的C端设计RNAi引物(正向引物TGGATTGTGCCTTCTTTACCAT和反向引物CATGACCGTTATCATCAA)扩增紫花苜蓿PALM1基因中如SEQ ID No.2所示的284bp的基因片段，命名为PALM1-C-RNAi，并将该片段转入RNAi载体pANDA35HK构建得到RNAi重组载体，命名为MsPALM1-RNAi。
将MsPALM1-RNAi载体进行遗传转化野生型紫花苜蓿(SY4D)实验，方法如下：
取材：选取未开花紫花苜蓿的叶片(不要选取过嫩、过老以及受损害的叶片)，应选取健壮、展开的叶片；
取材时携带冰盒，将取好的叶片放入50mL的离心管中并置于冰上，防止叶片萎蔫；
将超净工作台进行紫外照射杀菌，准备工作完成后，将取好的叶片转移到已提前灭菌的50mL离心管中，ddH2O加入20％NaClO和千分之一Tween-20后清洗材料洗15min，清洗过程中轻晃材料，5min左右时倒掉溶液，再洗一次至14min，然后用灭菌的ddH2O清洗5遍，每次1min，将NaClO洗尽；
将摇好的农杆菌(OD600值大约0.6-0.8左右)收集在离心管中，4000rpm离心10min，倒掉上清，用2-3mL的液体SM4重悬农杆菌至OD600为0.2；
将洗好的叶片分次放入无菌的培养皿中，大小类似的叶片叠在一起，用刀片切除叶片边缘，后将叶片切成小块状放入50mL离心管中，加入按比例稀释的菌液；
在真空泵中放入盛有叶子的离心管，抽真空10min，以减少细胞间隙，让菌液更好的侵入叶片伤口，提高转化效率；
将离心管放到水平摇床，慢摇10min；
倒掉菌液，叶片平铺在SM4(加1mLcef)培养基上，共培养一周；
后期培养阶段：SM4培养基(加2mLcef、200ul视植物抗性而定抗生素)上生长4周后，期间每两周转一次，移入MSBK培养基，MSBK处理两周后更换至MSS培养基，此时可适当将PPT减量，待植物生根后开始移入1/2MS培养基，长出幼苗后，移入土壤，使其在温室生长，转入温室的转基因植株存活后，进行转基因植株的鉴定，确定RNAi阳性转基因植株。
其中，上述SM4培养基、MSBK培养基、MSS培养基、1/2MS培养基的配方如下：
Figure BDA0003171012990000071
为了分析获得的RNAi阳性转基因植株中MsPALM1的表达水平，本发明采集RNAi阳性转基因植株的顶端组织，利用qRT-PCR(正向引物GGTTGGACGACACTCATGGAT和反向引物AGAGTCTTGAGAGGTTTAGTGCAACA)对MsPALM1表达水平进行分析，所用器材：BIO-RAD实时荧光定量PCR仪，SYBR green Mix。方法是：
(1)将cDNA稀释到15ng/μl，每个样品需要做三个生物学重复或者三个技术重复；正向引物与反向引物提前混合至2.5μm；
(2)Real-time PCR体系(10μl)：
SYBR 5μl
Primers 2μl
cDNA模板 3μl
(3)Real-time PCR程序：
Figure BDA0003171012990000081
结果表明，紫花苜蓿中内源PALM1抑制水平在不同转基因株系中有所不同，与野生型相比，RNAi阳性转基因植株中MsPALM1出现显著下调(图1)。
实施例3紫花苜蓿MSPALM1-RNAI转基因植株的表型分析
以常规方法对紫花苜蓿MsPALM1-RNAi转基因植株表型进行分析，结果表明，紫花苜蓿的野生型复叶结构包括三个小叶，而MsPALM1-RNAi转基因植株的小叶数量由三个变为五个(图2)。这证明对PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1通过RNAi抑制其功能后可以显著增加小叶数目。
序列表
<110>山东大学
<120>一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用
<141>2021-7-17
<160>2
<210>1
<211>765
<212>DNA
<213>人工序列
<221> 紫花苜蓿PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1基因的核苷酸序列
<222>（1）…（765）
<400>1
atggctacag atattggcct tctttccaat atgactcaga tccaaaaatc atcacaatca 60
caatctcaac aacaccaacc aaaccctaac tccaacacca ctacaacccc ttcaccatca 120
tcatcaactt ggatgtggaa ccctaaacaa caccaacagc aacaagaaca agaagatgaa 180
gattcatggg aggtaagggc ttttgctgaa gacacaagga atattatgaa cacaacatgg 240
ccaccaaggt cttatacctg cactttttgc agaagagagt tccggtcagc tcaagctctt 300
ggtggtcaca tgaatgttca ccgccgcgac cgtgctcgtc tccatcaaag ccaaccaccg 360
ttaaattcat ctcatccttc atcaccattc ataaatattc ctccacaaga gcttgttgct 420
aatgctggat tgtgccttct ttaccattta ccaaacccta ataataatgc ttttgcttcc 480
tacaatagtt ctagtcctaa tggagaatct ccttctactt ttctctcaat ctcatcatca 540
acatcttatc ctccaaataa tttgatgatg caaatgcaaa cttgttctcc atcttttaat 600
tttcaagtgg ataattcagc taggttgatc aataatagca tttcttcttt ttctagcaaa 660
gtggaccatc aacatgctac ttgcacctcc attgatgata acggtcatga aattgaagag 720
cttgatcttg agctccgttt agggaacaag ccaacaccaa cttga 765
<210>2
<211>284
<212>DNA
<213>人工序列
<221> PALM1-C-RNAi的核苷酸序列
<222>（1）…（284）
<400>2
tgctggattg tgccttcttt accatttacc aaaccctaat aataatgctt ttgcttccta 60
caatagttct agtcctaatg gagaatctcc ttctactttt ctctcaatct catcatcaac 120
atcttatcct ccaaataatt tgatgatgca aatgcaaact tgttctccat cttttaattt 180
tcaagtggat aattcagcta ggttgatcaa taatagcatt tcttcttttt ctagcaaagt 240
ggaccatcaa catgctactt gcacctccat tgatgataac ggtc 284

Claims (4)

1.一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用，其特征在于：所述PALM1基因是蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述对PALM1基因进行RNAi的方法是：设计引物，其中正向引物序列为CTTCCTACAATAGTTCTAGTCCT、反向引物序列为TTGGTGTTGGCTTGTTCCC，通过RT-PCR技术从紫花苜蓿中克隆PALM1基因；并为了避开该基因保守结构域，在其C端设计RNAi引物，其中所述正向引物序列为TGGATTGTGCCTTCTTTACCAT、反向引物序列为CATGACCGTTATCATCAA，扩增紫花苜蓿PALM1基因中如SEQ ID No.2所示的284bp的基因片段，命名为PALM1-C-RNAi，并将该片段转入RNAi载体pANDA35HK构建得到RNAi重组载体，命名为MsPALM1-RNAi；将构建的MsPALM1-RNAi载体进行遗传转化野生型紫花苜蓿野生型(SY4D)实验，通过愈伤再生的方式获得转基因MsPALM1-RNAi株系，实现提高豆科牧草小叶数量。
2.根据权利要求1所述对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用，其特征在于：所述豆科牧草是苜蓿、紫花苜蓿或三叶草。
3.一种提高豆科牧草小叶数量的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是MsPALM1-RNAi，其中含有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的提高豆科牧草小叶数量的植物表达载体，其特征在于：所述豆科牧草是苜蓿、紫花苜蓿或三叶草。
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