CN105754999B - 一种抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列、重组腺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列、重组腺病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抑制hsa‑miR‑221‑3p的寡核苷酸序列，为如下序列中的一种：序列1：(GAAACCCAGCTGACAATGTAGCTAAGA)n≧5序列2：(GAAACCCAGCCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5；序列3：(GAAACCCAGCGGACAATGTAGCTAAGA)n≧5；序列4：(GAAACCCAGCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5其中，四种序列中AAGA部分可用其他序列代替，在胞内进行DNA同源重组法制备获得重组腺病毒(Ad‑s‑miR‑221‑3p)，并进一步提供了所述重组腺病毒在治疗非酒精性脂肪肝方面的应用，包括降低肝脏甘油三酯水平，降低血甘油三酯水平，改善高脂血症，增加机体胰岛素敏感性，为改善非酒精性脂肪肝提供了新的解决思路。

Description

一种抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列、重组腺病毒及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程、生物医疗技术领域，特别是涉及一种利用寡核苷酸串联法制备抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列、重组腺病毒及其降低肝脏及血甘油三酯的应用。
背景技术
肝脏是调节机体代谢的中央器官，如脂代谢，包括脂合成、脂蛋白吸收和分泌，脂肪酸氧化等。非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和堆积为特征的临床综合症，是最常见的肝脏疾病，在我国发病率约为25％到40％。随着我国国民生活水平的不断提高，饮食结构不断改变，高热量、高脂饮食非常流行。此外，随着生活节奏的加快，工作压力的增加，很多人缺少运动等，导致该病呈快速增长趋势，如不加以控制，容易发展成为肝纤维化及肝癌。
肝脏脂代谢调控网络非常复杂，大量与肝脂代谢直接或间接相关的基因已被发现，如脂肪酸合成相关的基因：SCD-1、SREBP-1C、ACC等，与甘油三酯合成相关的基因：PPARγ、LXRα、DGAT1、DGAT2等，与脂肪酸氧化相关的基因：PPARα、CPT1、MCAD、LCAD、UCP2等，与脂肪酸吸收相关的基因：CD36、PPARδ等。
miRNA是一类18到25个核苷酸的内源性非蛋白编码RNA，在哺乳动物及人类细胞中通过结合到靶基因mRNA的3’非翻译区，抑制靶蛋白的翻译。hsa-miR-221-3p最初被发现在人肝癌细胞中过度表达，与肝细胞增殖及肝再生密切相关。研究表明，在肥胖病人脂肪细胞中，miR-221呈现过度表达。此外，在肌肉分化以及胰岛素抵抗过程中，miR-221也扮演了重要角色。
目前，尚未见通过抑制hsa-miR-221-3p来有效治疗非酒精性脂肪肝及高脂血症、胰岛素抵抗等的相关研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种抑制肝细胞hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列、重组腺病毒及其制备方法，以及降低肝脏和血甘油三酯的应用，改善非酒精性脂肪肝患者脂代谢异常及增加胰岛素敏感性。
本发明第一方面提供了一种抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列为如下序列中的一种：
序列1：(GAAACCCAGCTGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列2：(GAAACCCAGCCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列3：(GAAACCCAGCGGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列4：(GAAACCCAGCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
或以上序列中AAGA部分用其他间隔序列代替所得序列。
本发明第二方面提供了含有上述抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸序列的原核、真核穿梭载体、腺病毒载体。
本发明第三方面提供了含有上述抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸序列的重组腺病毒及其在制备治疗非酒精性脂肪肝产品中的应用。
本发明第四方面提供了含有上述抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸序列的重组腺病毒的制备方法，其步骤包括：
a、合成上述的抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列；
b、根据步骤a所得寡核苷酸序列得到shRNA，并与穿梭载体进行连接，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组穿梭质粒；
c、将步骤b所得重组穿梭质粒线性化，再与腺病毒骨架载体在体外共转化到感受态细胞中，通过同源重组获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒载体；
d、将步骤c所得载体线性化后用脂质体转染293A细胞，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒。
本发明的有益效果是：本发明提供了抑制has-miR-221-3p的重组腺病毒(Ad-s-miR-221-3p)在非酒精性脂肪肝治疗方面的应用，针对has-miR-221-3p成熟体序列，设计了包含至少5个以上重复序列的寡核苷酸，采用胞内DNA同源重组法制得可以抑制has-miR-221-3p的腺病毒。本发明制备的抑制has-miR-221-3p的重组腺病毒滴度可以达到1011pfu/ml。本发明制备的抑制has-miR-221-3p的重组腺病毒在治疗非酒精性脂肪肝方面的应用包括降低肝脏甘油三酯水平，降低血甘油三酯水平，改善高脂血症，增加机体胰岛素敏感性。通过尾静脉给予Ad-s-miR-221-3p治疗db/db或DIO模型小鼠实验，可以观察到:Ad-s-miR-221-3p治疗可以显著改善高脂血症，改善脂代谢紊乱，降低模型小鼠肝脏甘油三酯水平，降低血甘油三酯水平，增加小鼠胰岛素敏感性。Ad-s-miR-221-3p在降低肝脏及血甘油三酯方面有非常明显的效果及作用，本发明发现了新的潜在靶点，为改善非酒精性脂肪肝及高脂血症、胰岛素抵抗提供了新的解决思路。
附图说明
图1为重组腺病毒治疗前后db/db小鼠肝脏hsa-miR-221-3p表达水平。
图2为重组腺病毒治疗前后DIO小鼠肝脏hsa-miR-221-3p表达水平。
图3为重组腺病毒治疗前后DIO小鼠肝脏及血甘油三酯水平。
图4为重组腺病毒治疗前后db/db小鼠肝脏及血甘油三酯水平。
图5为重组腺病毒治疗前后DIO小鼠胰岛素耐受曲线。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列为如下序列中的一种：
序列1：(GAAACCCAGCTGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列2：(GAAACCCAGCCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列3：(GAAACCCAGCGGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列4：(GAAACCCAGCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
其中，四种序列中AAGA部分为间隔序列，故以上序列中AAGA部分用其他间隔序列代替所得序列也具有等同效果。
上述抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列通过设计5个以上针对hsa-miR-221-3p成熟体序列串联，并引入间隔序列(AAGA)制备获得，并在胞内进行DNA同源重组法制备获得重组腺病毒。
本发明第二方面提供了含有上述抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸序列的原核、真核穿梭载体、重组腺病毒载体。
本发明第三方面提供了含有上述抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸序列的重组腺病毒及其在制备治疗非酒精性脂肪肝产品中的应用。
更加详细的，所述治疗非酒精性脂肪肝产品为降低肝脏甘油三酯水平、降低血甘油三酯水平，增加机体胰岛素敏感性的产品。
本发明第四方面提供了含有上述抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸序列的重组腺病毒的制备方法，其步骤包括：
a、合成上述的抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列；
b、根据步骤a所得寡核苷酸序列得到shRNA，并与穿梭载体进行连接，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组穿梭质粒；
c、将步骤b所得重组穿梭质粒线性化，再与腺病毒骨架载体在体外共转化到感受态细胞中，通过同源重组获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒载体；
d、将步骤c所得载体线性化后用脂质体转染293A细胞，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒。
更加详细的，步骤a所述shRNA两端分别引入BgL2和HindIII酶切位点，退火形成双链结构，该双链结构与经BgL2和HindIII酶切过的Track-U6穿梭载体进行连接。
得到步骤d所述的重组腺病毒后，在293A细胞中进行扩大培养，并采用氯化铯密度梯度离心进行纯化和浓缩。纯化后得到的重组腺病毒纯度高、滴度高，符合国家相关标准。
下面将结合具体实施例对本发明提供的一种抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒在非酒精性脂肪肝治疗方面的应用予以进一步说明。
本发明设计了4种针对hsa-miR-221-3p的抑制寡核苷酸序列，如下：
序列1：(GAAACCCAGCTGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列2：(GAAACCCAGCCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列3：(GAAACCCAGCGGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
序列4：(GAAACCCAGCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5
上述四种序列中的间隔序列AAGA部分可以用其他序列代替。
本实施例中，根据以上设计拷贝数的不同，合成以下4类寡核苷酸，共计16种核苷酸序列，具体如下：
第一类：
Sponge1-5：如SEQ NO.1所示；
Sponge1-6：如SEQ NO.2所示；
Sponge1-7：如SEQ NO.3所示；
Sponge1-8：如SEQ NO.4所示；
第二类：
Sponge2-5：如SEQ NO.5所示；
Sponge2-6：如SEQ NO.6所示；
Sponge2-7：如SEQ NO.7所示；
Sponge2-8：如SEQ NO.8所示；
第三类：
Sponge3-5：如SEQ NO.9所示；
Sponge3-6：如SEQ NO.10所示；
Sponge3-7：如SEQ NO.11所示；
Sponge3-8：如SEQ NO.12所示；
第四类：
Sponge4-5：如SEQ NO.13所示；
Sponge4-6：如SEQ NO.14所示；
Sponge4-7：如SEQ NO.15所示；
Sponge4-8：如SEQ NO.16所示。
根据上述16种DNA序列，设计shRNA，在shRNA两端分别引入BgL2和HindIII酶切位点，退火形成双链结构，该双链结构直接与经BgL2和HindIII酶切过的Track-U6穿梭载体进行连接，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组穿梭质粒。
在以上基础上，构建重组腺病毒，并扩大培养，浓缩纯化。技术方案如下：将上述构建的穿梭载体，用PmeI进行线性化，再与腺病毒骨架载体在体外通过电穿孔共转化到感受态细胞中，通过同源重组获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒载体。将该载体用PacI线性化后用脂质体转染293A细胞，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒。重组腺病毒在293A细胞中进行大量扩增，并采用氯化铯密度梯度离心进行纯化和浓缩，得到的重组腺病毒纯度高、滴度高，符合国家相关标准。
本实施例的具体操作如下：
一、抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸片段的设计与亚克隆
1.根据上述设计的4类16种miRNA sponge，在两端引入BgL2和HindIII酶切位点，合成寡核苷酸片段，加入到煮沸的退火缓冲液中，放到4度冰箱自然冷却过夜。
2.取2微克Track-U6载体，同时加入10个单位的BgL2和HindIII内切酶，并加入适量缓冲液，37度酶切5小时。凝胶电泳后进行切胶回收。
3.取1微升回收产物，加入7微升退火产物，1微升T4DNA连接酶及缓冲液，16度连接过夜。
取10微升连接产物，转化感受态细胞，培养过夜后，挑取单克隆，送公司测序。测序结果与设计序列均完全一致。
二、抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸片段构建重组腺病毒
1.将包含抑制hsa-miR-221-3p寡核苷酸片段的穿梭载体通过转化、扩大培养，大量提取质粒DNA后，取5微克高纯度穿梭质粒，加入25个单位的PmeI酶切5小时。凝胶电泳后切胶回收。
2.取6微升回收产物，加入100纳克腺病毒骨架载体，混匀后加入到20微升BJ5183感受态细胞中，2500V，200Ohms，25μF条件下进行电穿孔。然后用500μl预热37度的LB培养基重悬菌体到无菌EP管，37度保温3到5分钟。取100μl涂布含卡那霉素的LB抗性平板，37度恒温培养16个小时。
3.提取重组质粒，转化后进行质粒大量制备，经PacI酶切线性化，再用脂质体将线性化产物转染到293A细胞中，获得重组腺病毒。
4.重组腺病毒在293A细胞中进行扩增后，采用氯化铯密度梯度进行离心纯化和浓缩，最后测定病毒滴度，可以达到1011pfu/ml。
三、重组腺病毒抑制hsa-miR-221-3p降低db/db及DIO模型小鼠肝脏及血甘油三酯的应用
1.实验动物模型准备
db/db小鼠，4-6周龄，雌性，普通饲料喂养，自由饮水，隔天测定体重，8到9周龄，体重约28克时开始尾静脉注射重组腺病毒。
DIO(饮食诱导的肥胖小鼠)小鼠模型构建：3周龄C57BL/6雌性小鼠，用D12492高脂饮食进行喂养，8到9周龄，选择体重高于正常对照组20％的个体用于治疗实验。
2.动物模型的降脂治疗
雌性db/db或DIO小鼠分别分为两组，每组7到8只，单次计量尾静脉分别注射Ad-GFP(1×1010pfu/0.2ml，生理盐水配制)和重组腺病毒(1×1010pfu/0.2ml，生理盐水配制)。
注射7天后，进行胰岛素耐受实验，第八天眼眶取血检测血甘油三酯水平，处死小鼠，检测肝脏甘油三酯水平。
其中，眼眶取血采用摘眼球的方法，3000rpm离心10分钟分离血清，样品送医院检验科检测甘油三酯水平。
肝脏称重后取肝组织，用裂解液进行匀浆处理，3000rpm离心10分钟，取200微升送医院测定甘油三酯水平。
实验结果
1.DIO及db/db小鼠肝脏hsa-miR-221-3p表达水平显著高于C57BL6对照小鼠。
2.重组腺病毒治疗前后db/db小鼠肝脏hsa-miR-221-3p表达水平如附图1所示，重组腺病毒治疗前后DIO小鼠肝脏hsa-miR-221-3p表达水平如附图2所示。两种小鼠模型中，注射抑制hsa-miR-221-3p重组腺病毒组与注射Ad-GFP组相比，肝脏hsa-miR-221-3p表达水平均降低70％左右。
3.重组腺病毒治疗前后DIO小鼠肝脏及血甘油三酯水平如附图3所示，重组腺病毒治疗前后db/db小鼠肝脏及血甘油三酯水平如附图4所示。两种小鼠模型中，注射抑制hsa-miR-221-3p重组腺病毒组与注射Ad-GFP组相比，肝脏甘油三酯及血甘油三酯水平均显著降低。
4.重组腺病毒治疗前后DIO小鼠胰岛素耐受曲线如附图5所示，胰岛素耐受实验结果显示，注射抑制hsa-miR-221-3p重组腺病毒组，与注射Ad-GFP组相比，胰岛素耐受明显改善。
本实施例提供的重组腺病毒在改善脂代谢紊乱方面的应用，通过尾静脉注射db/db或DIO小鼠模型，可以观察到，本发明设计的重组腺病毒可以显著降低上述两种模型小鼠的肝脏及血甘油三酯水平，增加胰岛素敏感性。因此可以证明，本发明设计的抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒在降低肝脏及血甘油三酯、改善胰岛素敏感性方面有积极、有效、可靠的作用，为治疗非酒精性脂肪肝及高脂血症、胰岛素抵抗提供了新的解决思路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000939152550000011
Figure IDA0000939152550000021
Figure IDA0000939152550000031
Figure IDA0000939152550000041
Figure IDA0000939152550000051

Claims (5)

1.含有抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列的重组腺病毒的应用，其特征在于，所述重组腺病毒在制备治疗非酒精性脂肪肝产品中的应用，所述抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列为如下序列中的一种：
序列1：(GAAACCCAGCTGACAATGTAGCTAAGA)n≧5；
序列2：(GAAACCCAGCCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5；
序列3：(GAAACCCAGCGGACAATGTAGCTAAGA)n≧5；
序列4：(GAAACCCAGCGACAATGTAGCTAAGA)n≧5；
或以上序列中AAGA部分用其他间隔序列代替所得序列。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒的应用，其特征在于：所述治疗非酒精性脂肪肝产品为降低肝脏甘油三酯水平，降低血甘油三酯水平，增加机体胰岛素敏感性的产品。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒的应用，其特征在于，所述重组腺病毒的制备方法包括以下步骤：
a、合成权利要求1所述的抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列；
b、根据步骤a所得寡核苷酸序列得到shRNA，并与穿梭载体进行连接，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组穿梭质粒；
c、将步骤b所得重组穿梭质粒线性化，再与腺病毒骨架载体在体外共转化到感受态细胞中，通过同源重组获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒载体；
d、将步骤c所得载体线性化后用脂质体转染293A细胞，获得抑制hsa-miR-221-3p的重组腺病毒。
4.如权利要求3所述的重组腺病毒的应用，其特征在于：步骤a所述shRNA两端分别引入BgL2和HindIII酶切位点，退火形成双链结构，该双链结构与经BgL2和HindIII酶切过的Track-U6穿梭载体进行连接。
5.如权利要求4所述的重组腺病毒的应用，其特征在于：得到步骤d所述的重组腺病毒后，在293A细胞中进行扩大培养，并采用氯化铯密度梯度离心进行纯化和浓缩。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136224B (zh) * 2018-08-21 2022-03-18 上海交通大学医学院附属瑞金医院 miR-221/222及其抑制剂用于制备调控肝脂肪沉积、肝纤维化和肝细胞癌的药物
CN114231626A (zh) * 2021-10-14 2022-03-25 杭州师范大学 一种miRNA联合标志物在制备诊断检测早期肝癌的试剂盒中的应用
CN115354032A (zh) * 2022-05-05 2022-11-18 陈龙 一种hsa-miR-130b抑制的A549稳转细胞株及其构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effect of miR-34a in regulating steatosis by targeting PPARα expression in nonalcoholic fatty liver disease;Jiexia Ding et al;《Scientific Reports》;20150902;摘要 *
ROLES OF microRNAs IN FATTY LIVER LIPID ACCUMULATION;GENG WEI;《NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE》;20121231;第vi、20、46、60-61、70-72、79-81页 *
共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化;闫继红等;《中国组织工程研究》;20151231;第19卷;摘要以及正文1.3.2部分 *
闫继红等.共沉默miR-221-3p/222-3p表达抑制骨髓间充质干细胞增殖及促成软骨分化.《中国组织工程研究》.2015,第19卷摘要以及正文1.3.2部分. *

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