CN106591247A - 不依赖于car的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法和应用，属于涉及生物基因工程技术领域。本发明通过人工合成DNA寡核苷酸片段制作成多克隆位点接头，基于膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒EIA基因的表达，并在UPII启动子上游******干细胞抗原增强子PSCAE以增强UPII启引子的活性，构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p‑PSCAE‑UPII‑E1A，其能显著抑制CAR低表达的膀胱癌细胞的增殖，具有膀胱癌特异性复制能力，并呈剂量及时间依赖性。

Description

不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法和应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿***最常见的恶性肿瘤之一，其有两种不同的类型：非浸润性(浅表性)膀胱癌和浸润性膀胱癌，两者无论在形成的分子机制和来源，以及治疗和愈后等方面都完全不同。目前临床治疗***多采用以手术为主，辅以放疗、化疗和膀胱灌注等方法的综合治疗，但其治愈率远未令人满意。传统的化疗和放疗存在抗肿瘤能力较低、杀伤指数较小、副作用大等缺点。膀胱癌尤其是肌肉浸润性膀胱癌，对多种化疗药物存在耐药，治疗效果远远不能令人满意。因此，探索新的治疗理念、策略和途径，以提高膀胱癌的疗效就显得非常迫切。随着分子生物学、病毒学研究的进展，肿瘤的病毒基因疗法成为近年来肿瘤生物治疗的研究热点。国内外学者通过大量的体外和体内实验研究膀胱癌的基因治疗，结果证实以腺病毒为载体的基因治疗对膀胱癌具有显著的疗效。科萨奇-腺病毒受体(coxsackieand adenovirus receptor，CAR)在肿瘤腺病毒载体基因治疗过程中起着关键性的作用。另外，利用膀胱与体外相通的解剖学特点，将手术、化疗、放疗与膀胱腔内灌注溶瘤腺病毒结合来治疗膀胱癌，是一种非常有前景的综合治疗策略。
溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus)又称条件复制型腺病毒(Conditionallvreplicative adenovirus.CRAd)，是通过对腺病毒的基因进行改造，使病毒能选择性地在肿瘤细胞内复制、增殖，具有肿瘤特异性，而对正常细胞几乎没有影响，这使其在具有良好疗效的同时保证了安全性。溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内复制、增殖，并导致肿瘤细胞裂解，同时释放出子代病毒，子代病毒产生级联放大效应，进而感染周围的肿瘤细胞，最终消灭全部肿瘤。传统的5型腺病毒是通过特异性的CAR受体介导的胞吞作用进入宿主细胞的，这种受体是一种分子量为46kDa的具有典型细胞间粘附分子和免疫球蛋白样结构的跨膜蛋白。然而CAR在低分化或者恶性程度高的肿瘤细胞往往表达较低，这限制了5型腺病毒转染肿瘤细胞的效率。Ad11腺病毒属于B族腺病毒，病毒受体为CD46分子而不是CAR，构造含Ad5和Ad11杂合纤维顶球的嵌合型腺病毒载体Ad5/F11p转染***细胞可以克服上述问题。因而，我们构建了新的不依赖CAR的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，可以实现有效杀伤CAR表达阳性和阴性的***细胞，实现针对各类膀胱癌基因治疗的有效性，进一步揭示提高放化疗的有效途径，提高膀胱癌生物治疗的水准，为其它肿瘤治疗提供了理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A及构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒，是利用膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒EIA基因的表达，并在UPII启动子上游******干细胞抗原增强子(PSCAE)以增强UPII启引子的活性，构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A。
所述不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)穿梭质粒的构建
①多克隆位点接头(MCS Linker)的制作：合成DNA寡核苷酸片段RO-301及RO-302，RO-301的序列如SEQ ID NO.1所示，RO-302的序列如SEQ ID NO.2所示；
②将RO-301和RO-302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；
③在限制性内切酶BamHI-NotI间把MCS接头***RpS-TOAD质粒构建新的RpS-FROG质粒，从RpS-TOAD-PSE-PBN-EIA质粒中酶切得EIA片段，在Sall-NotI间把E1A片段***RpS-FROG质粒构建新的pCRAd质粒，用引物RO-311和RO-312从质粒CPll31中扩增hUPII启动子片段，在NheI-BamHI间把hUPII启动子片段***pCRAd质粒构建新的Rp-UPII-EIA质粒；所述引物RO-311的序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物RO-312的序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒质粒
①把大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞和电穿孔小杯置于冰上，每管感受态细胞是20μl；用Pme I酶切穿梭质粒Rp-PSCAE-UP II-E1A使其线性化，酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，重悬于6μl的Millipore H2O中，把Pme I酶切的穿梭质粒Rp-PSCAE-UP II-E1A和1μl的100ng/μl的Ad5/F11p载体加入20μl的J5183的电转化感受态细胞中；
②把感受态BJ5183转移到2.0mm电穿孔小杯中，避免形成气泡，电转化在2.0mm小杯中进行，电转化仪设定条件为输出电压2500伏特、电阻200欧姆、电容25uF，重悬转化物到0.5ml LB培养基中，37℃振荡10-20分钟；
③在3-5个卡那霉素LB平板上涂板，37℃培养16-20小时，挑选10-20个小克隆，在2ml含有卡那霉素的LB培养基中培10-15小时，常规碱裂解法小量提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用pAdEasy-1作对照；
④用Pac I酶切提取的质粒DNA，把正确的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中保存。
本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
本发明通过人工合成DNA寡核苷酸片段制作成多克隆位点接头，基于膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒EIA基因的表达，并在UPII启动子上游******干细胞抗原增强子PSCAE以增强UPII启引子的活性，构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，其能显著抑制CAR低表达的膀胱癌细胞的增殖，具有膀胱癌特异性复制能力，并呈剂量及时间依赖性。
附图说明
图1是本发明构建的Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A质粒的结构示意图(a)；PCR鉴定重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A的结果图(b)。
图2是Ad5-PSCAE-UPII-E1A及Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染膀胱癌细胞后Hexon及E1A蛋白表达的比较。
具体实施方式
下面以实施例结合附图说明进一步对本发明作详细的阐述，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
1.穿梭质粒的构建
合成DNA寡核苷酸片段RO-301及RO-302，RO-301的序列如SEQ ID NO.1所示，RO-302的序列如SEQ ID NO.2所示；将RO-301和RO-302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；在限制性内切酶BamHI-NotI间把MCS接头***RpS-TOAD质粒构建新的RpS-FROG质粒，从RpS-TOAD-PSE-PBN-EIA质粒中酶切得EIA片段，在Sall-NotI间把E1A片段***RpS-FROG质粒构建新的pCRAd质粒，用引物RO-311和RO-312从质粒CPll31中扩增hUPII启动子片段，在NheI-BamHI间把hUPII启动子片段***pCRAd质粒构建新的Rp-UPII-EIA质粒；从Rp-UPII-E1A质粒中切除EIA片段构建新的Rp-UPII-Null质粒，从pBK-CMV-Luc质粒中酶切得到Luc片段，在BamHI-NotI间把Luc片段***切掉EIA片段的Rp-UPII-E1A质粒中，构建新的Rp-UPII-Luc质粒；所述引物RO-311的序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物RO-312的序列如SEQ ID NO.4所示；
2、在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒质粒
1)把大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞和电穿孔小杯置于冰上。每管感受态细胞是20μl；
2)用PmeI酶切穿梭质粒使其线性化，酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，重悬于6μl的Millipore H2O中。把Pme I酶切的穿梭质粒和1μl的100ng/μl的Ad5/F11p载体加入20μl的BJ5183的电转化感受态细胞中；
3)把感受态BJ5183转移到2.0mm电穿孔小杯中，避免形成气泡，电转化在2.0mm小杯中进行，2500伏特，200欧姆和25uF；
4)重悬转化物到0.5ml LB培养基中，37℃振荡10-20分钟，在3-5个卡那霉素LB平板上涂板，37℃培养16-20小时；
5)挑选10-20个小克隆，在2ml含有卡那霉素的LB培养基中培10-15小时，碱裂解法小量提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用pAdEasy-1作对照；
6)用Pac I酶切提取的质粒DNA，把正确的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中保存；
3、重组质粒转染HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A
1)用Pac I酶切5-6μg的重组腺病毒质粒DNA
40μl酶切反应体系如下：
37℃水浴至少2-4小时；
2)反应管中加入60μl H2O，总体积为100μl，按体积比1∶1加入酚、氯仿缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；
3)转移上清液，按体积比24∶1加入氯仿、异戊醇缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；
4)转移上清液，加入pH7.0、l/10体积的3mol/l NaAc和2.5倍体积的95％乙醇，-20℃沉淀30分钟后，12000rpm离心10分钟；
5)弃上清，用700μl 70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心10分钟，弃上清，置于37℃恒温箱中20分钟；
6)待线性质粒DNA干燥后，溶于20μl Millipore水中，将15μl线性化质粒DNA加入250μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和，除菌过滤，10μl Lipofectamine 2000加入2501μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和后等5分钟。30分钟内混合上述DNA和脂质体，DNA加入脂质体中，混合后适温孵育20分钟，混合物可能会变浑；
7)6孔板中达到90-95％汇合度的HEK293细胞，用无抗生素无血清的DMEM培养基换液，每孔加入600μl，将混合物加入培养孔中，轻轻混合，次日观察，并加入1ml 10％FBS的DMEM培养基；
8)7天后收获病毒，蚀斑纯化后，用HEK293细胞增殖，按照标准方法用CsCl梯度离心纯化病毒，用260nm吸光度法检测腺病毒颗粒滴度，用HEK293细胞检测病毒感染滴度，用PCR检测重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A病毒的正确性；
4、重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A的扩增和纯化
1)培养HEK293细胞在10-15个75cm2培养瓶中，待细胞铺满培养瓶底80％时，弃去培养液，加入腺病毒上清液，每15-20min缓慢左右、前后晃动培养瓶一次，连续3次，放于37℃5％CO2培养箱中2-3h，之后加入含5％血清DMEM培养基8ml，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养，每天观察细胞变化，当90％的细胞出现细胞圆缩、甚至脱壁等细胞病变效应时，即可吹打细胞，使细胞完全脱壁，并收集于50ml离心管中，按照氯化铯纯化试剂盒说明书进行重组腺病毒的纯化；
2)细胞冻融后离心，4℃12000g×10min，取上清；
3)每50ml上清中加入5ml 50％PEG 8000/2.5M NaCl，混匀后冰浴lhr；
4)离心，4℃12500g×30min，弃上清；
5)收集沉淀，溶于5ml 1.1g×/ml CsCl中；
6)离心，4℃8000g×5min，取上清；
7)制备不连续CsCl梯度：依次加入2ml 1.4g×/ml CsCI、3ml 1.3g×/ml CsCI、5ml上清；
8)离心，20℃60000g×2小时，吸出病毒带；
9)转入透析袋，4℃透析过夜后分装保存；
5、重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A滴度的测定
1)细胞准备：收集一瓶生长状态良好，汇合率80％的HEK293细胞，胰酶消化制成细胞悬液，计数；含2％血清DMEM培养基准备20ml，细胞数为105个/ml；用排枪在2块96孔板中每孔加入100μl细胞悬液；
2)准备稀释病毒液；准备数个eppendorf管，第1管中加入0.45ml含2％血清DMEM培养基，其余加入0.9ml，再向第1管中加入0.05ml病毒保存液，上下吹打5次，使其混匀，换用新枪头，从第1管中吸取0.1ml加入第2管中，反复稀释至最高稀释度，用同一管病毒保存液进行第2轮稀释，最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml含2％血清DMEM培养基监测细胞存活情况，加样时从最高稀释度开始；
3)置于37℃，5％CO2培养箱中培养10d，10d后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数，只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，计算每一排中出现阳性的孔数，如果无法确定，可与阴性对照比较，如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100％阳性而最高稀释度100％阴性，则本测试即为有效；
4)按照以下公式计算滴度
TTCID50＝10-[L-d(s-0.5)]+1
T(pfu/ml)＝10logTTCID50-0.7
注：L为最高稀释度的对数，d为稀释对数之间的差，s为阳性孔比率总和；
6、重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A的鉴定
通过PCR检测PSCAE、UPII、E1A基因的表达来鉴定腺病毒，鉴定结果如图1所示；
1)引物的设计与合成
E1A primers：上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
hUPII promoter primers：上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；
PSCAE primers：上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ IDNO.10所示；
2)在25ul反应体系进行，其构成如下：
3)PCR反应共循环30次，循环条件为：94℃变性60秒，56℃退火60秒，72℃延伸1分钟10秒，循环结束后72℃延伸7分钟，PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离。
构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A能显著抑制CAR低表达的膀胱癌细胞的增殖，具有膀胱癌特异性复制能力(图2)。

Claims (2)

1.一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)穿梭质粒的构建
1)多克隆位点接头(MCS Linker)的制作：合成DNA寡核苷酸片段RO-301及RO-302，RO-301的序列如SEQ ID NO.1所示，RO-302的序列如SEQ ID NO.2所示；
2)将RO-301和RO-302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；
3)在限制性内切酶BamHI-NotI间把MCS接头***RpS-TOAD质粒构建新的RpS-FROG质粒，从RpS-TOAD-PSE-PBN-EIA质粒中酶切得EIA片段，在Sall-NotI间把E1A片段***RpS-FROG质粒构建新的pCRAd质粒，用引物RO-311和RO-312从质粒CPll31中扩增hUPII启动子片段，在NheI-BamHI间把hUPII启动子片段***pCRAd质粒构建新的Rp-UPII-EIA质粒；从Rp-UPII-E1A质粒中切除EIA片段构建新的Rp-UPII-Null质粒，从pBK-CMV-Luc质粒中酶切得到Luc片段，在BamHI-NotI间把Luc片段***切掉EIA片段的Rp-UPII-E1A质粒中，构建新的Rp-UPII-Luc质粒；所述引物RO-311的序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物RO-312的序列如SEQID NO.4所示；
(2)在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒质粒
1)把大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞和电穿孔小杯置于冰上。每管感受态细胞是20μl；
2)用Pme I酶切穿梭质粒使其线性化，酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，重悬于6μl的Millipore H2O中。把Pme I酶切的穿梭质粒和1μl的100ng/μl的Ad5/F11p载体加入20μl的BJ5183的电转化感受态细胞中；
3)把感受态BJ5183转移到2.0mm电穿孔小杯中，避免形成气泡，电转化在2.0mm小杯中进行，2500伏特，200欧姆和25uF；
4)重悬转化物到0.5ml LB培养基中，37℃振荡10-20分钟，在3-5个卡那霉素LB平板上涂板，37℃培养16-20小时；
5)挑选10-20个小克隆，在2ml含有卡那霉素的LB培养基中培10-15小时，碱裂解法小量提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用pAdEasy-1作对照；
6)用Pac I酶切提取的质粒DNA，把正确的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中保存；
(3)重组质粒转染HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A
1)用Pac I酶切5-6μg的重组腺病毒质粒DNA
40μl酶切反应体系如下：
37℃水浴至少2-4小时；
2)反应管中加入60μl H20，总体积为100μl，按体积比1∶1加入酚、氯仿缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；
3)转移上清液，按体积比24∶1加入氯仿、异戊醇缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；
4)转移上清液，加入pH7.0l/10体积的3mol/l NaAc和2.5倍体积的95％乙醇，-20℃沉淀30分钟后，12000rpm离心10分钟；
5)弃上清，用700μl 70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心10分钟，弃上清，置于37℃恒温箱中20分钟；
6)待线性质粒DNA干燥后，溶于20μl Millipore水中，将15μl线性化质粒DNA加入250μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和，除菌过滤，10μl Lipofectamine 2000加入2501μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和后等5分钟。30分钟内混合上述DNA和脂质体，DNA加入脂质体中，混合后适温孵育20分钟，混合物可能会变浑；
7)6孔板中达到90-95％汇合度的HEK293细胞，用无抗生素无血清的DMEM培养基换液，每孔加入600μl，将混合物加入培养孔中，轻轻混合，次日观察，并加入1ml 10％FBS的DMEM培养基；
8)7天后收获病毒，蚀斑纯化后，用HEK293细胞增殖，按照标准方法用CsCl梯度离心纯化病毒，用260nm吸光度法检测腺病毒颗粒滴度，用HEK293细胞检测病毒感染滴度，用PCR检测重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A病毒的正确性；
(4)重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A的扩增和纯化
1)培养HEK293细胞在10-15个75cm2培养瓶中，待细胞铺满培养瓶底80％时，弃去培养液，加入腺病毒上清液，每15-20min缓慢左右、前后晃动培养瓶一次，连续3次，放于37℃5％CO2培养箱中2-3h，之后加入含5％血清DMEM培养基8ml，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养，每天观察细胞变化，当90％的细胞出现细胞圆缩、甚至脱壁等细胞病变效应时，即可吹打细胞，使细胞完全脱壁，并收集于50ml离心管中，按照氯化铯纯化试剂盒说明书进行重组腺病毒的纯化；
2)细胞冻融后离心，4℃ 12000g×10min，取上清；
3)每50ml上清中加入5ml 50％PEG 8000/2.5M NaCl，混匀后冰浴1hr；
4)离心，4℃ 12500g×30min，弃上清；
5)收集沉淀，溶于5ml 1.1g×/ml CsCl中；
6)离心，4℃ 8000g×5min，取上清；
7)制备不连续CsCl梯度：依次加入2ml 1.4g×/ml CsCI、3ml 1.3g×/ml CsCI、5ml上清；
8)离心，20℃ 60000g×2小时，吸出病毒带；
9)转入透析袋，4℃透析过夜后分装保存；
(5)重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A滴度的测定
1)细胞准备：收集一瓶生长状态良好，汇合率80％的HEK293细胞，胰酶消化制成细胞悬液，计数；含2％血清DMEM培养基准备20ml，细胞数为105个/ml；用排枪在2块96孔板中每孔加入100μl细胞悬液；
2)准备稀释病毒液；准备数个eppendorf管，第1管中加入0.45ml含2％血清DMEM培养基，其余加入0.9ml，再向第1管中加入0.05ml病毒保存液，上下吹打5次，使其混匀，换用新枪头，从第1管中吸取0.1ml加入第2管中，反复稀释至最高稀释度，用同一管病毒保存液进行第2轮稀释，最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml含2％血清DMEM培养基监测细胞存活情况，加样时从最高稀释度开始；
3)置于37℃，5％CO2培养箱中培养10d，10d后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数，只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，计算每一排中出现阳性的孔数，如果无法确定，可与阴性对照比较，如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100％阳性而最高稀释度100％阴性，则本测试即为有效；
4)按照以下公式计算滴度
TTCID50＝10-[L-d(s-0.5)]+1
T(pfu/ml)＝10logTTCID50-0.7
注：L为最高稀释度的对数，d为稀释对数之间的差，s为阳性孔比率总和；
(6)重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UP II-E1A的鉴定
通过PCR检测PSCAE、UPII、E1A基因的表达来鉴定腺病毒；
1)引物的设计与合成
E1A primers：上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
hUPII promoter primers：上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ IDNO.8所示；
PSCAE primers：上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；
2)在25ul反应体系进行，其构成如下：
3)PCR反应共循环30次，循环条件为：94℃变性60秒，56℃退火60秒，72℃延伸1分钟10秒，循环结束后72℃延伸7分钟，PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离。
2.一种如权利要求1所述的不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
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