CN108441515B - 含有靶向dhcr24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体及其降血脂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体及其在降血脂中的应用。DHCR24是胆固醇内源性合成中最后一步的酶，重组腺病毒干扰载体Ad‑SiDHCR24能够靶向DHCR24基因，干扰其表达，从而降低细胞胆固醇的生物合成。本发明表明，Ad‑SiDHCR24在细胞和动物水平干扰其靶基因DHCR24的表达，不仅能够在细胞水平降低胆固醇，还能够在动物实验的小鼠高血脂模型中发挥显著的降血脂效果。

Description

含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体 及其降血脂中的应用
技术领域
本发明涉及含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-SiDHCR24，以及使用该重组腺病毒干扰载体制备防治高血脂疾病的药物中的应用。
背景技术
高血脂症状表现为血液中胆固醇、低密度脂蛋白固醇、甘油三酯水平高于正常值，而高密度脂蛋白固醇低于正常值，这些因子是动脉粥样硬化以及心血管疾病的重要风险评估因素。因此，降胆固醇一直是这一类疾病的主要治疗手段。
低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)是一个独立的高血脂评估风险因素，LDL将肝脏或者肠道中的胆固醇运输到组织。由于LDL含有高水平的胆固醇，当血浆中LDL水平增加时，其可能在动脉壁堆积，导致冠状动脉疾病和心脏病发病风险增加。因此LDL被认为是“有害的胆固醇”。
他汀类药物是传统经典的降胆固醇药物，它是胆固醇合成过程中限速酶HMG-COA还原酶的抑制剂，通过阻断底物HMG-COA转化为甲羟戊酸途径从而降低胆固醇的合成。尽管他汀类药物已经在世界范围显示出降低心血管疾病发生的风险，但仍有一部分病人不能达到理想的LDL-C(LDL胆固醇)水平或者由于副作用而停止治疗。另一方面，传统的非他汀类药物如烟酸、胆酸螯合剂、贝特类药物和Ω-3脂肪酸由于缺乏强有力的降低心血管疾病的风险证据，其降血脂治疗广受争议。因此开发新型降胆固醇的药物需求仍然很迫切。
SiRNA(Small interfering RNA)是一种小RNA分子，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的活性核酸内切酶)加工而成。siRNA与之互补的目标mRNA结合，导致靶基因沉默。利用siRNA干扰其同源靶基因的理论，siRNA的互补DNA序列经常被用来当做工具或药物，通过干扰其同源基因下调其表达实现治疗某些疾病的目的。但是siRNA单独针对其靶基因的单一的RNA靶点序列，容易造成RNA干扰的脱靶效应。
体外制备siRNAs有三种方法，化学合成、体外转录和用RNaseIII消化长片段dsRNA制备siRNA。化学合成方法适用于已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究，但由于价格比较高和定制周期长，不适用于筛选siRNA等长时间的研究。体外转录方法以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。此方法得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。
以上三种体外制备方法都需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体可以从转染到细胞的DNA模板中在体内转录得到siRNAs，不需要直接操作RNA。多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括人们熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串(3-6个)U来终止转录。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究-带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。
腺病毒(Adenovirus,AV)是双链DNA病毒，约36kb的一种大分子。经过改造的复制缺陷型腺病毒可以作为基因转移载体，通过受体介导的内吞作用进入细胞，其基因组被转移到细胞核中，保持在染色体内，而不整合到宿主细胞的基因组中。重组腺病毒作为基因转移载体具有多种优点，如：病毒载体容量较大，不整合到染色体；与人类基因同源；导入基因效率高，对人体安全。因而，重组腺病毒载体也经常用来作为产生靶向特定目的序列的siRNA干扰序列的载体。
发明内容
24-脱氢胆固醇还原酶(3β-hydroxysterol△24-reductase,DHCR24)是胆固醇生物合成中最后一步所需的酶。DHCR24催化还原所有的羊毛甾醇和链甾醇中间体△24位键的还原，特别是将羊毛甾醇还原成二氢羊毛醇，链甾醇还原为胆固醇。因此，干扰DHCR24的表达，会使内源性胆固醇合成减少，从而降低血浆中胆固醇水平，达到预防和治疗高血脂的效果。
本发明的目的是提供靶向DHCR24基因的四种SiRNA重组腺病毒，以干扰DHCR24的表达。
本发明采用的技术方案是：含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体，是将干扰片段序列通过基因工程技术，包装到Ad5复制缺陷型腺病毒中，构建重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24；所述的干扰片段序列包括DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4。
所述的DHCR24干扰片段序列1的序列为：
正义链：AGCACAGGCATCGAGTCATCTTTT
反义链：AGATGACTCGATGCCTGTGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列2的序列为：
正义链：AGCACGGGTTCCAAATGTTATTTT
反义链：ATAACATTTGGAACCCGTGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列3的序列为：
正义链：AGCGCCTGGGTGGTGTTCAATTTT
反义链：ATTGAACACCACCCAGGCGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列4的序列为：
正义链：AACTCAGACTGTTCTATGCTTTT
反义链：AGCATAGAACAGTCTGAGTTTTT。
上述的含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体，所述的Ad5复制缺陷型腺病毒是AD293细胞。
上述的含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体的制备方法，包括如下步骤：
1)分别将上述的DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4的正义链和反义链退火后，用T4连接酶分别与穿梭质粒载体pSES1连接，分别获得四种pSES1-DHCR24siRNA重组质粒；
2)分别将四种pSES1-DHCR24siRNA重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选测序验证无突变的pSES1-DHCR24siRNA，扩增并提纯后，用Pme1酶切，分别得到四种线性化的重组质粒；
3)将四种线性化的重组质粒分别通过热击法转化到BJ5183感受态细胞中，挑取阳性质粒，用Pac1酶单酶切重组质粒，获得完全线性化质粒，将完全线性化质粒依次进行乙醇沉淀，ddH2O溶解，然后将完全线性化质粒DNA和Lipofectamine 2000，混合均匀，于室温下静置30min，加入AD293细胞的无血清培养转染；将Lipofectamine-DNA混合物加入到培养瓶中，轻轻摇动培养瓶混匀，细胞在37℃5％CO2条件下保温5h，后添加完全培养基继续培养，转染7d后，收集细胞沉淀，离心后收集上清保存于-80℃，用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，分别获得四种含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1、Ad-siDHCR24-2、Ad-siDHCR24-3和Ad-siDHCR24-4。
上述的含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体在制备治疗高血脂药物中的应用。
优选的，四种含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1、Ad-siDHCR24-2、Ad-siDHCR24-3和Ad-siDHCR24-4单用或联合在制备治疗高血脂药物中的应用。
更优选的，四种含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1、Ad-siDHCR24-2、Ad-siDHCR24-3和Ad-siDHCR24-4按病毒滴度比1:1:1:1混合后在制备治疗高血脂药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供的四种含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒载体干扰载体，即其所含有的DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4干扰DHCR24基因的不同位点。本发明发现，四种腺病毒分别或者以1:1:1:1混合的Mix方式转染细胞均可以达到干扰DHCR24基因表达的目的，其中以按照1:1:1:1比例混合使用可以达到最佳效果。另一方面，本发明采用四种针对不同靶点的siRNA的联合使用，共同发挥大于单一使用任何一种siRNA下调靶基因表达的作用，解决了RNA干扰的脱靶效应的缺点。本发明提供的重组腺病毒转染HepG2细胞后，细胞内胆固醇水平下降，实现了对于内源性胆固醇的下调。
附图说明
图1是重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24的构建及包装流程图。
图2是重组腺病毒干扰载体分别在相差显微镜和荧光显微镜下的观察结果图；
其中，a:正常AD293细胞相差显微镜观察结果图；b:正常AD293细胞荧光显微镜观察结果图；c:转染了线性化pAdEasy-1-SES-DHCR24siRNA-1的293细胞腺病毒包装组相差显微镜图；d:转染了线性化pAdEasy-1-SES-DHCR24siRNA-1的293细胞腺病毒包装组荧光显微镜观察结果图。
图3是不同Ad-siDHCR24下调HepG2细胞中DHCR24效率检测；
其中，Mix：四种重组腺病毒按病毒滴度比1:1:1:1混合；No.1：Ad-siDHCR24-1；No.2：Ad-siDHCR24-2；No.3：Ad-siDHCR24-3；No.4：Ad-siDHCR24-4。
图4A是细胞胆固醇荧光染色法(Filipin法)检验Ad-siDHCR24降胆固醇的胆固醇染色荧光图。
图4B是细胞胆固醇荧光染色法(Filipin法)检验Ad-siDHCR24降胆固醇染色图的荧光强度分析。
图4C是细胞胆固醇荧光染色法(Filipin法)检验Ad-siDHCR24降胆固醇Mix组红色荧光强度与蓝色荧光强度负相关图。
图5A是高效液相色谱法检测胆甾醇标准品(1.0mg/mL)。
图5B是高效液相色谱法检测胆固醇标准品(1.0mg/mL)。
图5C是高效液相色谱法检测胆甾醇与胆固醇1：1混合。
图5D是高效液相色谱法检测Control组。
图5E是高效液相色谱法检测Mix组。
图5F是高效液相色谱法检测单位细胞内胆固醇含量。
图6A是Ad-siDHCR24注射降低C57BL/6J高血脂症模型小鼠血清中总胆固醇水平。
图6B是Ad-siDHCR24注射降低C57BL/6J高血脂症模型小鼠血清中甘油三酯水平。
图6C是Ad-siDHCR24注射降低C57BL/6J高血脂症模型小鼠的低密度脂蛋白固醇水平。
图6D是Ad-siDHCR24注射降低C57BL/6J高血脂症模型小鼠血清中高密度脂蛋白固醇水平。
图7是Ad-siDHCR24注射改善C57BL/6J高血脂症模型小鼠肝脏组织脂质空泡化的免疫组织化学结果。
具体实施方式
实施例1构建含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体
靶向DHCR24基因的干扰片段序列，包括DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4。
所述的DHCR24干扰片段序列1的序列为：
正义链：AGCACAGGCATCGAGTCATCTTTT
反义链：AGATGACTCGATGCCTGTGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列2的序列为：
正义链：AGCACGGGTTCCAAATGTTATTTT
反义链：ATAACATTTGGAACCCGTGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列3的序列为：
正义链：AGCGCCTGGGTGGTGTTCAATTTT
反义链：ATTGAACACCACCCAGGCGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列4的序列为：
正义链：AACTCAGACTGTTCTATGCTTTT
反义链：AGCATAGAACAGTCTGAGTTTTT。
1)分别人工合成DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4。
2)分别将DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4的单链的DNA正义链和反义链片段退火后，用T4连接酶分别与穿梭质粒载体pSES1连接，分别获得四种pSES1-DHCR24siRNA重组质粒。pSES1载体为用于siRNA表达的腺病毒穿梭载体，***外源DNA片段的多克隆位点两侧分别有H1和U6启动子序列，可以实现***DNA片段的细胞内短发夹RNA的转录。
3)分别将四种pSES1-DHCR24siRNA重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，将转化后的菌株接种到含有青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取菌株克隆并扩增，提取质粒DNA，经ECOR V酶切验证为阳性的克隆质粒测序。挑选测序验证无突变的克隆pSES1-DHCR24siRNA，扩增并提纯后，用Pme1酶切，产物进行回收，分别得到四种线性化的重组质粒。
4)分别将四种线性化的重组质粒热击法转化到BJ5183感受态细胞中，将菌液涂布于kana霉素抗性平板，37℃培养。挑取平板上长出的单菌落，将单个菌落接种于LB培养基中，摇床上过夜培养。提取质粒，用Pac1酶酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳验证，出现约30kb的大条带和4.5kb或3kb小条带，确定是阳性质粒。用Pac1酶单酶切重组腺病毒质粒，待质粒完全线性化，将完全线性化质粒进行乙醇沉淀，用ddH2O将其溶解。完全线性化质粒DNA和Lipofectamine 2000，混合均匀，于室温下静置30min，加入AD293细胞的无血清培养转染。将Lipofectamine-DNA混合物加入到培养瓶中，轻轻摇动培养瓶混匀。细胞在37℃5％CO2条件下保温5h，后添加完全培养基继续培养。转染7d后，收集细胞沉淀，离心后收集上清保存于-80℃。将上清液继续转染其他293细胞，实现扩增，并用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，最后获得四种靶向DHCR24基因不同位置的siRNA重组腺病毒干扰载体，即重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1、Ad-siDHCR24-2、Ad-siDHCR24-3和Ad-siDHCR24-4。
图1为重组腺病毒Ad-siDHCR24的构建及包装流程图。
图2为Ad-siDHCR24-1重组腺病毒包装组以及阴性对照组分别在相差显微镜和荧光显微镜下的观察结果图。a为未进行线性化质粒转染的正常AD293细胞的阴性对照组的相差显微镜照片，b图的荧光显微镜观察显示没有红色荧光的RFP表达，c与d为转染了线性化pAdEasy-1-SES-DHCR24siRNA-1的293细胞腺病毒包装组即Ad-siDHCR24-1，d图的荧光显微镜的镜下可以观察到多于90％的细胞的细胞质内出现强烈的红色荧光信号，暗示红色荧光蛋白的成功表达。这一结果证明含有DHCR24siRNA序列的线性重组质粒在293细胞中成功实现了腺病毒的包装，并实现了腺病毒的初步扩增。
实施例2含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体的应用
分别将构建的四种含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1(No.1)、Ad-siDHCR24-2(No.2)、Ad-siDHCR24-3(No.3)和Ad-siDHCR24-4(No.4)分别或以一定比例混合后转染HepG2细胞或者C57BL/6J小鼠，处理相应的时间，然后用不同的技术手段进行相应的检测，并进行结果分析。
(一)Ad-siDHCR24下调DHCR24效率检测，确定最佳干扰效率毒株和配比
对生长状态良好的HepG2细胞转染四种Ad-siDHCR24和Ad-siControl，提取RNA，realtime PCR检测DHCR24表达情况。四种重组腺病毒100moi转染HepG2细胞，转染3天后收集细胞，Trizol法提取总RNA，去除基因组DNA，逆转录成cDNA并通过RealtimePCR检测DHCR24mRNA水平的表达。空白组(-)为未转染重组腺病毒的对照组，Ad-siControl为腺病毒对照组，GAPDH为内参基因。结果如图3(n＝3mean+SD，*:p<0.05vs.Ad-siControl，**:p<0.01vs.Ad-siControl)。
从图3中可以看出，与Ad-siControl组相比，Ad-siDHCR24No.2组DHCR24mRNA没有明显变化，而Mix组、No.1、No.3和No.4的Ad-siDHCR24感染组的HepG2细胞DHCR24mRNA水平比较低，结果具有明显的统计学差异性，其中以Mix组的DHCR24的mRNA水平最低。这个结果说明Mix、No.1、No.3和No.4的Ad-siDHCR24这四组腺病毒干扰载体都实现了对于靶基因DHCR24的RNA表达水平的干扰，其中Mix组具有最佳干扰表达效果。因而后续实验中主要选用Ad-siDHCR24Mix作为实现干扰DHCR24表达的重组腺病毒干扰载体。
(二)细胞胆固醇荧光染色法(Filipin法)检验Ad-siDHCR24降胆固醇的效果
将生长状态良好的HepG2细胞接种到细胞爬片上，Ad-siDHCR24重组腺病毒100moi转染HepG2细胞，3天后收集细胞，Filipin荧光染料染色，用荧光显微镜观察荧光强度。具体为：对生长状态良好的HepG2细胞转染Mix的Ad-siDHCR24和No.3和No.4腺病毒，进行Filipin荧光染料染色，用荧光显微镜观察蓝色荧光强度，对转染了Ad-siDHCR24及Ad-siControl的HepG2细胞，用蓝色荧光标记胆固醇，红色荧光标记重组腺病毒，结果如图4A-图4C(n＝3mean+SD,*:p<0.05vs.Ad-siControl，**:p<0.01vs.Ad-siControl)。
由图4A-图4C可看到，在感染腺病毒的这四组细胞中，均能观察到红色荧光，证明重组腺病毒的感染成功，且感染效率均可以达到90％以上。观察代表细胞内胆固醇水平的蓝色荧光，结果显示，与Ad-siControl对照组相比，加入Mix、No.3和No.4Ad-siDHCR24细胞的平均蓝色荧光强度与对照组相比均明显偏弱。对三组细胞的荧光强度进行定量分析，发现感染这三组细胞腺病毒的细胞内的细胞平均荧光强度显著低于对照组水平，证明Ad-siDHCR24的感染降低了HepG2细胞内胆固醇水平(图4B)。对Mix腺病毒组的细胞进行荧光灰度的进一步分析发现，红色荧光强度越强的细胞，蓝色荧光越弱，在红色荧光强度和蓝色荧光强度之前呈现负相关(图4C)。这一结果暗示细胞内感染的腺病毒越多，细胞胆固醇的含量就越少，其原因可能是由于腺病毒感染的高MOI数所产生的更高的对DHCR24靶基因表达的干扰效率所造成的。
(三)高效液相色谱法检测Ad-siDHCR24Mix对HepG2细胞胆固醇合成的影响
四种腺病毒按质量比1:1:1:1混合(Mix)后，100moi转染HepG2细胞，转染3天后收集细胞，提取总脂质，N2气干燥，称重记录脂质重量，溶于乙醇，用甲醇为流动相，210nm检测胆固醇色谱峰。具体为：对生长状态良好的HepG2细胞转染Mix的Ad-siDHCR24，收集细胞提取总脂质，N2干燥后溶于无水乙醇，用高效液相检测胆固醇色谱峰。结果如图5A-图5F(n＝3mean+SD，*:p<0.05vs.control，**:p<0.01vs.control.)。图5A：胆甾醇标准品(1.0mg/mL)，图5B：胆固醇标准品(1.0mg/mL)，图5C：胆甾醇与胆固醇1：1混合，图5D：Control组，图5E:Mix组，图5F：单位细胞内胆固醇含量。
由图5A-图5F可知，胆甾醇标准品的色谱峰保留时间为17min，胆固醇标准品的色谱峰保留时间为22min，图5C为两者的混合液的出峰时间，与两者标准品的出峰时间相符。在图5D所显示的Control组中，细胞内存在一定量的胆固醇(红色箭头所示)，而在加入Mix腺病毒组中胆固醇的色谱峰明显小于Control组，暗示加入Ad-siDHCR24腺病毒后细胞内总体胆固醇明显下降。图5F图表示单位细胞内胆固醇的含量，分析可得两组中细胞内胆固醇水平均显示出显著的差异性，此结果也证明了Ad-siDHCR24下调了HepG2细胞内胆固醇水平。但是由于细胞内容物极其复杂，胆甾醇含量又相对于胆固醇含量较少，所以在细胞水平的高效液相实验并没有探测到胆甾醇的色谱峰。
(四)Ad-siDHCR24降低C57BL/6J小鼠血脂
48只C57BL/6J雄性小鼠，随机分配成4组(n＝12)，分别为空白对照组(-)，高脂模型组(High fat model)，腺病毒对照组(Ad-siControl)和Mix腺病毒组(Ad-siDHCR24)。空白对照组小鼠饲喂正常饲养，其余小鼠喂养高脂饲料，持续4周。造模期间每日更换饮用水，每周称量并记录体重。实验4周后，空白对照组和高脂模型组尾静脉注射150ul的生理盐水，Ad-siControl组注射150ul腺病毒液(病毒含量为4.5×108pfu)，Ad-siDHCR24组注射150ul腺病毒液(病毒含量为5×108pfu)，每周记录体重。3三周后，***麻醉小鼠眼眶取血，同时处死小鼠，采集小鼠肝脏并称重。采集的血液与4℃冰箱放置30min，4℃，3000rpm/min离心15min，转移上层血清到新的EP管中，进行测定血脂中TC、TG、LDL-C、HDL-C。血清用南京建成试剂盒检测血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平变化。具体为：通过饲养C57BL/6J小鼠高脂饲料，建立高血脂模型，尾静脉注射Ad-siDHCR24病毒，三周后收集血清，检测血液中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白固醇和高密度脂蛋白固醇指标。结果如图6A-图6D。(-)表示为正常饮食的小鼠，Normal saline表示尾静脉注射生理盐水对照的高血脂模型小鼠，Ad-siControl表示注射Ad-siControl腺病毒的高血脂模型小鼠，Ad-siDHCR24表示注射Ad-siDHCR24腺病毒的高血脂小鼠。
由图6A-图6D可知，与高脂模型组小鼠对比，注射Ad-siDHCR24的高脂小鼠血清中总胆固醇水平显著性下调，甘油三酯水平也呈现出同样的下降趋势，血清中低密度脂蛋白固醇的水平下调同时高密度脂蛋白水平上升。此结果证明了Ad-siDHCR24可以通过干扰DHCR24的表达，降低胆固醇的合成，从而下调高血脂症的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白固醇，减少可以引起心血管疾病的“坏因子”，同时升高高密度脂蛋白固醇，有益于缓解高血脂症，减轻其造成的危害。
(五)Ad-siDHCR24转染C57BL/6J小鼠肝脏HE染色图
腺病毒感染3三周后，***麻醉处死小鼠，收集肝脏并称重。C57BL/6小鼠肝脏一半以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于制作动物组织切片，将脱水的切片放入到苏木精中染色，蒸馏水淋洗，盐酸酒精处理，0.5％-1％伊红溶液染色，95％酒精处理。二甲苯透明处理，中性树胶封片，保存。具体为：正常组和高脂模型组和转染Ad-siControl和Ad-siDHCR24腺病毒的四组小鼠，饲养三周后处死，取其肝脏组织进行石蜡切片，HE染色观察小鼠肝脏细胞的病理变化。结果如图7。
由图7可以看出，从左到右分别表示正常饮食的小鼠、高血脂模型小鼠、感染Ad-siControl和Ad-siDHCR24腺病毒的四组小鼠肝脏切片。从荧光显微镜图片可以看出，注射腺病毒的两个组别中，肝脏切片的细胞中均观察到强烈的红色荧光，证明尾静脉注射的重组腺病毒成功感染至肝脏组织细胞，且细胞感染百分率达到90％以上。光学显微镜观察结果显示，与空白对照组的正常肝脏组织相比，高脂生理盐水组和Ad-siControl组的小鼠肝脏组织学表现为脂质在细胞中聚集，肝细胞变大，同时脂质散布于胞浆中，将细胞核挤到边缘，呈现出明显的空泡化，证明高脂饲料饲养小鼠造模成功。在高脂血症模型鼠的实验组中，与Ad-siControl组相比，感染Ad-siDHCR24小鼠肝脏细胞体积变小，脂质空泡化减少，由于细胞中脂质的减少，部分细胞浆重新被染成正常红色，说明感染Ad-siDHCR24腺病毒可以使高脂小鼠肝脏中脂质减少。

Claims (1)

1.含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体在制备治疗高血脂药物中的应用，其特征在于，四种含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1、Ad-siDHCR24-2、Ad-siDHCR24-3和Ad-siDHCR24-4按病毒滴度比1:1:1:1混合后在制备治疗高血脂药物中的应用；所述重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24-1、Ad-siDHCR24-2、Ad-siDHCR24-3和Ad-siDHCR24-4，是将DHCR24干扰片段序列1、DHCR24干扰片段序列2、DHCR24干扰片段序列3和DHCR24干扰片段序列4通过基因工程技术，包装到Ad5复制缺陷型腺病毒中，构建的重组腺病毒干扰载体；
所述的DHCR24干扰片段序列1的序列为：
正义链：AGCACAGGCATCGAGTCATCTTTT
反义链：AGATGACTCGATGCCTGTGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列2的序列为：
正义链：AGCACGGGTTCCAAATGTTATTTT
反义链： ATAACATTTGGAACCCGTGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列3的序列为：
正义链：AGCGCCTGGGTGGTGTTCAATTTT
反义链： ATTGAACACCACCCAGGCGCTTTT
所述的DHCR24干扰片段序列4的序列为：
正义链：AACTCAGACTGTTCTATGCTTTT
反义链： AGCATAGAACAGTCTGAGTTTTT。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097461A1 (ja) * 2006-02-27 2007-08-30 National University Corporation Kumamoto University Ｃ型肝炎治療用抗体
CN101942436A (zh) * 2010-08-06 2011-01-12 辽宁大学 mDHCR24干扰靶点序列及其应用
CN102787101A (zh) * 2012-04-18 2012-11-21 辽宁大学 组织特异性表达的24-脱氢胆固醇还原酶编码重组腺病毒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097461A1 (ja) * 2006-02-27 2007-08-30 National University Corporation Kumamoto University Ｃ型肝炎治療用抗体
CN101942436A (zh) * 2010-08-06 2011-01-12 辽宁大学 mDHCR24干扰靶点序列及其应用
CN102787101A (zh) * 2012-04-18 2012-11-21 辽宁大学 组织特异性表达的24-脱氢胆固醇还原酶编码重组腺病毒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ad-siDHCR24降胆固醇作用的初步药效学研究;杨晓雄;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20190115(第1期);第E079-383页 *
Cholesterol depletion induced by RNA interference targeting DHCR24 protects cells from liposome-induced cytotoxicity;Baoyu Yang et al.;《PREPARATIVE BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY》;20190321;第49卷(第5期);第453–458页 *
Recombinant adenovirus-mediated overexpression of 3β-hydroxysteroid-Δ24 reductase;Xiuli Lu et al.;《NEURAL REGENERATION RESEARCH》;20140331;第9卷(第5期);第509页图5、第510右栏第4段-511左栏第2段 *

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