CN108265036B - 一种沉默t1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用 - Google Patents

一种沉默t1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用，属于生物医药技术领域。首先设计合成沉默T1蛋白的shRNA并将其导入病毒载体中，然后包装制得沉默T1蛋白的重组病毒。所述重组病毒能在小鼠体内高效感染主动脉内皮并在主动脉内皮细胞中长期表达，能保护动脉粥样硬化模型小鼠内皮屏障完整和促进内皮钙粘蛋白的表达，能显著抑制动脉粥样硬化的发展。本发明的沉默T1蛋白的重组病毒有望成为治疗动脉粥样硬化相关疾病的基因药物。

Description

一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
心血管疾病是仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，是造成死亡的主要原因之一。心血管疾病主要指冠状动脉硬化性心脏病，即冠心病。动脉粥样硬化是冠心病的主要病理基础，表现为大动脉及中动脉的血管内壁出现脂质沉积，形成分散或成片的粥样斑块，造成动脉管腔狭窄，随后斑块破裂出血，可在狭窄的动脉内形成血栓，血栓如出现在大脑中或脑动脉硬化破裂，便可造成大脑局部缺血坏死，就是中风；血栓如发生在心脏，则造成心脏局部缺血坏死，发生心肌梗塞。心血管疾病发展到后期，由于心脏长期泵血不良，全身器官都有可能缺氧而遭到不同程度的损害。如肺部感染，肝硬化，高血压肾衰等又反过来加重心血管疾病病情。
内皮功能异常是动脉粥样硬化的始动因素而且贯穿动脉粥样硬化的整个发生发展过程。内皮屏障功能是血管内皮的主要功能之一。正常情况下，内皮细胞通过内皮间连接的结构严格限制血液中生物大分子的通过而发挥其屏障作用，但在某些生理或病理情况下通透性可以大幅度增加，即细胞间隙形成等。一旦内皮通透性增加，随后将发生一系列反应，如血浆内的脂质成分通过内皮间隙进入内膜，单核细胞和平滑肌细胞迁移至内膜，进一步损伤血管和促进动脉粥样硬化斑块的形成。
酪氨酸激酶受体B(TrkB)是脑源性神经营养因子的高亲和力受体，近来研究发现该通路除了在中枢和外周神经元的生存、生长和维持中发挥重要作用外，也在心血管***中表达和发挥作用，研究表明该通路能促进心肌存活，促进胚胎发育中的血管生成以及成年心梗后的心肌内血管生成。T1蛋白是体内神经酪氨酸激酶受体2(NTRK2)的截短表达形式，是脑源性神经营养因子的另一种受体。T1与TrkB拥有相同的胞外域，但是却有不同的胞内域，缺少TrkB的胞内激酶区，因此能与TrkB竞争结合细胞外的脑源性神经营养因子，却不能活化细胞内分子通路，T1与TrkB同时在血管内皮细胞表达。我们的前期研究发现TrkB表达于主动脉内皮，在动脉粥样硬化模型小鼠中内皮TrkB的表达降低，进一步研究发现TrkB能保护内皮完整，防止动脉粥样硬化的发生和发展。但我们的前期研究在使用表达TrkB全长的病毒进行动脉粥样硬化治疗时发现：由于TrkB的翻译区较长，将其导入病毒载体后，不容易得到高滴度的病毒，而且体内表达水平较低，严重影响TrkB用于治疗动脉粥样硬化的治疗效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用。本发明针对T1的mRNA设计并合成shRNA序列用于沉默T1蛋白，减少T1蛋白与TrkB的竞争，进而增加TrkB的活化机会，而且沉默T1蛋白的shRNA序列片段很小，能在体内高水平表达。
术语说明：
T1蛋白：T1蛋白是体内神经酪氨酸激酶受体2(NTRK2)基因的截短表达形式，是脑源性神经营养因子的另一种受体。
本发明的技术方案如下：
一种沉默T1蛋白的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据T1的mRNA设计并合成shRNA序列，其中shRNA的上游核苷酸序列mT1-shRNA-F如SEQ ID NO.1所示，shRNA的下游核苷酸序列mT1-shRNA-R如SEQ ID NO.2所示；
(2)将步骤(1)中mT1-shRNA-F和mT1-shRNA-R经退火处理，得mT1-shRNA退火产物；
(3)限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA，纯化回收6000bp大片段得pAAV-ZsGreen酶切产物；
(4)将步骤(2)的mT1-shRNA退火产物与步骤(3)的pAAV-ZsGreen酶切产物连接，连接产物转化感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，抽提阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1；
(5)复苏293AAV细胞，将步骤(4)的阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1和辅助质粒pAAV9、pHelper共同转染复苏的293AAV细胞，转染后收集上清，浓缩纯化，获得沉默T1蛋白的重组病毒。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中shRNA序列的5’端引入一个BamHI酶切位点，3’端引入一个HindⅢ酶切位点。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中的酶切体系为：质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA2.5μg，10×Buffer 5μL，10×BSA 5μL，HindⅢ2.5μL，BamHⅠ2.5μL，ddH2O补足至50μL，反应条件：37℃水浴反应2h。
根据本发明优选的，上述步骤(4)中连接时mT1-shRNA退火产物与pAAV-ZsGreen酶切产物的质量比为1:1000。
根据本发明优选的，上述步骤(4)中的连接体系为：pAAV-ZsGreen酶切产物2μL，mT1-shRNA退火产物2μL，10×DNA Ligase Buffer 2μL，T4DNA Ligase 2μL，ddH2O补足至20μL，反应条件：37℃水浴反应过夜。
根据本发明优选的，上述步骤(5)中阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1、辅助质粒pAAV9、辅助质粒pHelper的质量比为1:1:1。
根据本发明优选的，上述步骤(5)中293AAV细胞的复苏包括以下步骤：将293AAV细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞生长成均匀单层细胞并达95％以上聚集度时传代，传代2次后再行转染；用胰酶消化收集细胞，以完全培养基稀释细胞至1～5×106个/ml，接种8～10mL细胞稀释液至10cm培养皿，培养箱中孵育10～15h，转染前1h换液，得复苏的293AAV细胞。
根据本发明优选的，上述步骤(5)中293AAV细胞的转染包括以下步骤：应用HETKit转染293AAV细胞，转染5～7h后换液，换液46～50h后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000～4000rpm离心10～15min，收集上清。
根据本发明的上述方法所构建的沉默T1蛋白的重组病毒。
根据本发明，所制备的沉默T1蛋白的重组病毒在制备改善内皮功能和减缓动脉粥样硬化的基因药物中的应用。
有益效果：
1、本发明通过设计合成shRNA(短发夹RNA)特异沉默内皮细胞中T1蛋白的表达，减少T1蛋白与TrkB的竞争，实现TrkB的高活化，解决TrkB过大难于表达的难题。
2、本发明所述重组病毒能高效感染主动脉内皮，效率大于90％；而且特异感染主动脉内皮，却不感染平滑肌，避免了对平滑肌功能的影响，增加了靶向性；腺相关病毒能够整合到组织细胞中，随细胞基因一起持续表达，因此作用时间长，本发明所述病毒的报告基因在血管内皮持续表达超过16周；主动脉内皮T1蛋白表达被高效抑制达80％；通过尾静脉注射病毒无创伤；越来越多的研究发现腺相关病毒相对安全，不会引起大的副作用，而且已经有越来越多的腺相关病毒被用于临床基因治疗。因此本发明为体内研究血管内皮基因的功能提供了一个高效、持久、无创、安全的实验方法。
3、本发明所述重组病毒能保护动脉粥样硬化模型小鼠内皮屏障完整；促进内皮钙粘蛋白的表达，显著抑制斑块面积及斑块内脂质和巨噬细胞含量，减缓动脉粥样硬化的发展。本发明的沉默T1蛋白的重组病毒可用于制备治疗动脉粥样硬化相关疾病的基因药物。
附图说明
图1为重组质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1的酶切鉴定结果；
其中，M为DNA Maker，条带大小从上到下依次为(bp)：8000，5000，3000，2000，1000，750，500，250，100；1～4分别为不同菌落的质粒样品；
图2为报告基因ZsGreen在主动脉内皮的表达情况；
图3为不同重组病毒感染主动脉内皮后T1蛋白的表达水平；
图4为不同重组病毒感染后主动脉中伊文思蓝的沉积情况；
图5为不同重组病毒感染后主动脉的斑块面积；
图6为不同重组病毒感染后主动脉根横切片中的斑块内脂质沉积情况；
图7为不同重组病毒感染后主动脉根横切片中的斑块内巨噬细胞沉积情况；
图8为不同重组病毒感染后主动脉根横切片中的斑块内皮钙粘蛋白表达水平。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案进行进一步说明，其中采用的实验方法若无特殊说明均为常规方法。
实施例中使用的试剂均为普通市售产品。其中，琼脂糖凝胶回收试剂盒，货号：D2500(Omega)；cycle pure回收试剂盒，货号：D6492(Omega)；DNA引物合成(美国invitrogen公司)；DNA测序(美国invitrogen公司)；限制性内切酶BglⅡ(美国NEB公司)；限制性内切酶BamHⅠ(美国NEB公司)；限制性内切酶HindⅢ(美国NEB公司)；T4DNA Ligase，货号：M0202L(美国NEB公司)；Qiagen质粒抽提试剂盒(德国Qiagen公司)；HET kit，货号：BW11002(深圳百恩维公司)；Apo-/-E，C57小鼠及饲料(北京联通利华公司)；核蛋白提取试剂盒(美国Thermo公司)；质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA(深圳百恩维公司)；ZsGreen抗体(美国BD公司)；T1抗体(美国santa cruz公司)；moma-2和内皮钙粘蛋白抗体(美国Abcam公司)。
实施例1：构建一种沉默T1蛋白的重组病毒
1、根据小鼠T1的mRNA(NM_008745)设计并合成shRNA序列，并在5’端引入一个BamHI酶切位点，3’端引入一个HindⅢ酶切位点，序列如下：
mT1-shRNA-F(SEQ ID NO.1，下划线为HindⅢ酶切位点)：
5'-GATCCGCAGTTCTCTAGTGTGAATAGTTCAAGAGACTATTCACACTAGAGAACTGCTTTTTTAGATCTA-3',
mT1-shRNA-R(SEQ ID NO.2，下划线为BamHI酶切位点)：
5'-AGCTTAGATCTAAAAAAGCAGTTCTCTAGTGTGAATAGTCTCTTGAACTATTCACACTAGAGAACTGCG-3'；
2、将步骤1中的mT1-shRNA-F和mT1-shRNA-R片段分别充分溶解于100μL退火Buffer中，各取5μL溶解液加入到5μL的10×退火Buffer中，加灭菌水至50μL，充分混匀，100℃退火2min自然冷却至室温，用无菌水稀释100倍得mT1-shRNA退火产物；
3、限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA，酶切反应在37℃水浴反应2h，酶切体系如下：
Figure BDA0001559989470000041
将上述反应后产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，切胶回收6000bp酶切大片段，得pAAV-ZsGreen酶切产物；
4、将步骤2的mT1-shRNA退火产物与步骤3的pAAV-ZsGreen酶切产物连接，mT1-shRNA退火产物与pAAV-ZsGreen酶切产物的质量比为1：1000，22℃水浴反应过夜，连接反应体系如下：
Figure BDA0001559989470000042
Figure BDA0001559989470000051
取10μL上述过夜连接产物转化100μL JM109感受态细胞，Ampicillin抗性培养后，用小量质粒抽提试剂盒抽提预期质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1，并分别用BglⅡ做酶切鉴定，酶切反应在37℃水浴反应2h，酶切体系如下：
Figure BDA0001559989470000052
酶切鉴定图谱如图1所示，其中，出现900bp左右条带的为阳性克隆，经测序验证后，提取测序结果正确的阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1，用于构建重组病毒；
5、复苏293AAV细胞，加入DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养，待细胞生长成均匀单层细胞并达95％以上聚集度时传代，传代2次后再行转染；用胰酶消化收集细胞，以完全培养基稀释细胞至2×106个/mL，接种10mL细胞稀释液至10cm培养皿，培养箱中孵育12h，转染前1h换液；
将步骤4中提取的阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1和辅助质粒pAAV9、辅助质粒pHelper，三者的质量比为1:1:1,应用HET Kit，共同转染293AAV细胞；
转染6h后换液，换液48小时后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000rpm离心10min，收集上清，浓缩，获得沉默T1蛋白的重组病毒。
实施例2：验证重组病毒的体内感染效率及沉默效率
选用8周龄的C57BL/6小鼠60只，分为2组，对照组用一次性注射器经小鼠尾静脉注射含有乱序shRNA(rAAV9-ZsGreen-ShRNA-mScramble)的重组病毒，实验组用一次性注射器经小鼠尾静脉注射实施例1构建的沉默T1蛋白的重组病毒，注射剂量为7×1010vg/g体重和20μL/g体重，普通饮食喂养16周；
取材小鼠主动脉制备冷冻切片
免疫荧光染色，观察报告基因ZsGreen的表达，验证感染效率；检测T1蛋白的表达，验证沉默效率：主动脉根的冷冻切片用4％多聚甲醛固定，PBS浸洗后，血清封闭，然后分别用ZsGreen及T1抗体孵育4℃过夜，浸洗后用FITC或TRITC标记的荧光二抗孵育，浸洗，再用DAPI染色5分钟，浸洗后封片，荧光显微镜下观察拍照。
结果显示，两组重组病毒携带的报告基因ZsGreen均在主动脉内皮高效表达，表明本发明所述重组病毒能高效感染主动脉内皮，效率大于90％，而且特异感染主动脉内皮，却不感染平滑肌，避免了对平滑肌功能的影响，增加了靶向性(图2)；与对照组相比，本发明所述病毒高效抑制主动脉内皮T1蛋白表达高达80％(图3)。
实施例3：重组病毒在改善动脉粥样硬化小鼠的内皮功能中的应用
建立内皮损伤动物模型：选取8周龄ApoE敲除小鼠60只，分为2组，普通喂养16周；
小鼠在开始造模时，同时用一次性注射器经小鼠尾静脉注射重组病毒，对照组注射含有乱序shRNA(rAAV9-ZsGreen-ShRNA-mScramble)的重组病毒，实验组注射实施例1构建的沉默T1蛋白的重组病毒，注射剂量均为7×1010vg/g体重和20μL/g体重；
普通喂养16周后，将伊文思兰按照剂量20mg/kg体重溶于0.2ml PBS中，经小鼠尾静脉注射，45分钟后腹腔注射0.08％戊巴比妥钠麻醉，剪开皮肤肌肉，暴露心脏，经左心室灌注10mL PBS历时3分钟，然后分离主动脉拍照；
定量分析是将主动脉置于80℃干燥18h后称干重，然后将主动脉在0.15毫升的甲酰胺中60℃浸泡24h分离伊文思蓝，随后用分光光度计检测620nm处的吸光度，根据标准曲线计算出伊文思蓝的量再用主动脉的干重校正。
结果如图4所示，与对照组相比，本发明所述重组病毒组主动脉伊文斯兰沉积减少50％，表明本发明所述靶向沉默T1蛋白的重组病毒能有效改善动脉粥样硬化小鼠的内皮屏障损伤。
实施例4：重组病毒在减缓动脉粥样硬化中的应用
建立动脉粥样硬化动物模型：选取8周龄ApoE敲除小鼠60只，分为2组，高脂喂养16周；
小鼠在开始造模时，同时用一次性注射器经小鼠尾静脉注射重组病毒，对照组注射含有乱序shRNA(rAAV9-ZsGreen-ShRNA-mScramble)的重组病毒，实验组注射实施例1构建的沉默T1蛋白的重组病毒，注射剂量均为7×1010vg/g体重和20μL/g体重；
高脂喂养16周后，取材主动脉根，制冷冻切片，主动脉用于大体油红O染色检测动脉粥样硬化斑块面积：先用4％多聚甲醛固定，PBS浸洗后，将主动脉纵向剪开固定于黑色表面，然后主动脉用油红O染色，PBS浸洗，甘油封片后，显微镜下观察及拍照，斑块面积的定量计算应用ImagePro-Plus软件。
油红O染色检测动脉粥样硬化斑块内脂质沉积：主动脉根的横断切片先用4％多聚甲醛固定，PBS浸洗后，用油红O染色，PBS浸洗，甘油封片后，显微镜下观察及拍照。
免疫荧光染色检测斑块内巨噬细胞的表达及内皮钙粘蛋白的表达：主动脉根的冷冻切片用4％多聚甲醛固定，PBS浸洗后，血清封闭，然后分别用moma-2及内皮钙粘蛋白抗体孵育4℃过夜，浸洗后用FITC或TRITC标记的荧光二抗孵育，浸洗，再用DAPI染色5分钟，浸洗后封片，荧光显微镜下观察拍照。
大体油红O染色显示，与对照组相比本发明所述重组病毒组斑块面积明显降低达60％(图5)，斑块内脂质沉积也明显降低50％(图6)，斑块内巨噬细胞沉积也明显降低60％(图7)，内皮钙粘蛋白的表达也明显增高2倍，进一步证实该通路是通过影响钙粘蛋白表达调控内皮完整(图8)。
本发明的应用结果表明所述重组病毒能保护动脉粥样硬化模型小鼠内皮屏障完整；促进内皮钙粘蛋白的表达，显著抑制斑块面积及斑块内脂质和巨噬细胞含量，减缓动脉粥样硬化的发展。本发明的沉默T1蛋白的重组病毒有望成为治疗动脉粥样硬化相关疾病的基因药物。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatccgcagt tctctagtgt gaatagttca agagactatt cacactagag aactgctttt 60
ttagatcta 69
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agcttagatc taaaaaagca gttctctagt gtgaatagtc tcttgaacta ttcacactag 60
agaactgcg 69

Claims (10)

1.一种沉默T1蛋白的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据T1的mRNA设计并合成shRNA序列，其中shRNA的上游核苷酸序列mT1-shRNA-F如SEQ ID NO.1所示，shRNA的下游核苷酸序列mT1-shRNA-R如SEQ ID NO.2所示；
(2)将步骤(1)中mT1-shRNA-F和mT1-shRNA-R经退火处理，得mT1-shRNA退火产物；
(3)限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA，纯化回收6000bp大片段得pAAV-ZsGreen酶切产物；
(4)将步骤(2)的mT1-shRNA退火产物与步骤(3)的pAAV-ZsGreen酶切产物连接，连接产物转化感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，抽提阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1；
(5)复苏293AAV细胞，将步骤(4)的阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1和辅助质粒pAAV9、pHelper共同转染复苏的293AAV细胞，转染后收集上清，浓缩纯化，获得沉默T1蛋白的重组病毒；
其中，所述T1蛋白是体内神经酪氨酸激酶受体2(NTRK2)基因的截短表达形式，是脑源性神经营养因子的另一种受体，所述T1的mRNA在NCBI的登录号为NM_008745。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中shRNA序列的5’端引入一个BamHI酶切位点，3’端引入一个HindⅢ酶切位点。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的酶切体系为：质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA 2.5μg，10×Buffer 5μL，10×BSA 5μL，HindⅢ 2.5μL，BamH Ⅰ 2.5μL，ddH2O补足至50μL，反应条件：37℃水浴反应2h。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中连接时mT1-shRNA退火产物与pAAV-ZsGreen酶切产物的质量比为1:1000。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中的连接体系为：pAAV-ZsGreen酶切产物2μL，mT1-shRNA退火产物2μL，10×DNA Ligase Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 2μL，ddH2O补足至20μL，反应条件：37℃水浴反应过夜。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1、辅助质粒pAAV9、辅助质粒pHelper的质量比为1:1:1。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中293AAV细胞的复苏包括以下步骤：将293AAV细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞生长成均匀单层细胞并达95％以上聚集度时传代，传代2次后再行转染；用胰酶消化收集细胞，以完全培养基稀释细胞至1～5×106个/ml，接种8～10mL细胞稀释液至10cm培养皿，培养箱中孵育10～15h，转染前1h换液，得复苏的293AAV细胞。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中293AAV细胞的转染包括以下步骤：应用HET Kit转染293AAV细胞，转染5～7h后换液，换液46～50h后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000～4000rpm离心10～15min，收集上清。
9.根据权利要求1所述的方法所构建的沉默T1蛋白的重组病毒。
10.权利要求9所述的沉默T1蛋白的重组病毒在制备改善内皮功能和减缓动脉粥样硬化的基因药物中的应用。
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