CN105744954B - 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中提供的是抗RSPO抗体(特别是抗RSPO2抗体和/或抗RSPO3抗体)及其使用方法。

Description

抗RSPO2和/或抗RSPO3抗体及其用途
对相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119要求2013年10月18日提交的美国临时申请No.61/893,141和2014年9月26日提交的美国临时申请No.62/056,324的权益，据此通过述及完整收录其内容。
序列表
本申请含有序列表，已经经EFS-Web提交且据此通过述及将其完整收录。所述ASCII拷贝(在2014年10月14日创建)命名为P5719R1-WO_SequenceListing.txt，并且大小为124950字节。
发明领域
本文中提供了抗RSPO抗体(特别是抗RSPO2抗体和/或抗RSPO3抗体)及其使用方法。
发明背景
R-spondin(RSPO)家族是一小组，四种分泌型蛋白质(RSPO1至RSPO4)，在脊椎动物胚胎和成体中广泛表达。通过强烈增强Wnt途径激活，RSPO具有发育和干细胞生长中的多效功能(Kazanskaya et al.，Dev.Cell 7：525-534(2004)；Kim et al.，Cell Cycle 5：23-26(2006)；WO 2005/040418)。哺乳动物RSPO1至RSPO4分享40％-60％氨基酸序列同一性，而且由一个信号肽，两个相邻的弗林蛋白酶样富半胱氨酸域(FU-CRD)，接着是一个血小板反应蛋白型I重复(TSR)域，和一个带正电荷的C端区组成。两个FU-CRD对于促进Wnt/β-联蛋白信号传导是必要且充分的(Kazanskaya et al.，Dev.Cell 7：525-534(2004)；WO 2005/040418)。
LGR4(含富亮氨酸重复[LRR]的G蛋白偶联受体[GPCR]4)，LGR5，和LGR6(Hsu etal.，Mol.Endocrinol.12：1830-1845(1998)；Hsu et al.，Mol.Endocinol.14：1257-1271(2000))是RSPO的受体。LGR4/5/6受体的一项共同特征是它们在独特类型的成体干细胞中的表达。LGR5早已描述为Wnt依赖性隔室(包括小肠，结肠，胃，和毛囊)中的驻留干细胞的一种标志物(Barker and Clevers，Gastroenterology 138：1681-1696(2010)；Seshagiri etal.，Nature 488：660-664(2012))。LGR6还充当表皮中的多效干细胞的一种标志物(Snippert et al.，Science 327：1385-1389(2010))。LGR4在正在增殖的细胞中广泛表达(Van Schoore et al.，Histochem Cell Biol.124：35-50(2005))，而且它的敲除小鼠显示许多器官(包括骨，肾，睾丸，皮肤，和胆囊)中的发育缺陷(Mustata et al.，EMBO Rep 12：558-564(2011))。LGR4/5/6受体具有胞外域中17个LRR的中央排列，N和C端二者侧翼为富半胱氨酸序列，之后是7个跨膜螺旋，而且胞外域对于与RSPO的高亲和力结合是必要且充分的(de Lau et al.，Genome Biol.13：242(2011)；Wang et al.，Genes&Dev.27：1339-1344(2013))。
LGR4/5/6受体可以在RSPO识别后在物理上与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)相互作用，并且由此RSPO和Wnt配体一起作用来激活Wnt/β-联蛋白信号传导(deLau et al.，Genome Biol.13：242(2011)；Carmon et al.，Proc Natl Acad Sci 108：11452-11457(2012))。通过稳定Frizzled和LRP5/6受体，RSPO还有能力促进Wnt/β-联蛋白信号传导(Hao et al.，Nature 485：195-200(2012))。锌和RING指3(ZNRF3)及其同系物RING指43(RNF43)是跨膜E3遍在蛋白连接酶，它促进细胞表面上的Frizzled和LRP6受体周转(Hao et al.，Nature 485：195-200(2012)；Koo et al.，Nature 488：665-669(2012))。通过与LGR4/5/6和ZNRF3/RNF43的胞外域相互作用，RSPO可诱导自膜清除ZNRF3，这稳定Frizzled和LRP6受体以增强Wnt/β-联蛋白信号传导(Hao et al.，Nature 485：195-200(2012))。
通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。
发明概述
本发明提供抗RSPO抗体(特别是结合RSPO2，RSPO3，和/或RSPO2和RSPO3二者的抗体)及其使用方法。
本文中提供的是结合RSPO2的分离的抗体，其中该抗体抑制RSPO2与跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些实施方案中，该跨膜E3遍在蛋白酶为ZNRF3和/或RNF43。
在一些实施方案中，该抗体不抑制RSPO2与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO2与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用)。例如，本文中提供的是结合RSPO2的分离的抗体，其中该抗体包含(a)轻链可变域(VL)，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的高变区-L1(HVR-L1)，(ii)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3，和(b)重链可变域(VH)，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含(a)SEQ ID NO：105的VL序列和SEQ ID NO：106的VH序列。
在一些实施方案中，该抗体抑制RSPO2与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。例如，本文中提供的是结合RSPO2的分离的抗体，其中该抗体包含：(a)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ IDNO：62的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3；(b)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3；或(c)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该分离的抗体包含(a)SEQ ID NO：107的VL序列和SEQ ID NO：108的VH序列；(b)SEQ ID NO：109的VL序列和SEQ ID NO：110的VH序列；或(c)SEQ ID NO：111的VL序列和SEQ ID NO：112的VH序列。
本文中还提供的是结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体抑制RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些实施方案中，该跨膜E3遍在蛋白酶为ZNRF3和/或RNF43。
在一些实施方案中，该抗体不抑制RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO3对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。
在一些实施方案中，该抗体抑制RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。例如，本文中提供的是结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体包含：(a)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(b)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3；(c)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)VL，该VL包含(i)包含SEQID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3；(e)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3；(f)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3；或(g)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。进一步地，本文中提供的是结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体包含(a)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：188的氨基酸序列的HVR-H3；或(b)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该结合RSPO的分离的抗体包含VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该结合RSPO的分离的抗体包含VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：188的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该结合RSPO的分离的抗体包含VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，该抗体包含(a)SEQ ID NO：89的VL序列和SEQ ID NO：90的VH序列；(b)SEQ ID NO：91的VL序列和SEQ ID NO：92的VH序列；(c)SEQ ID NO：93的VL序列和SEQ ID NO：94的VH序列；(d)SEQ ID NO：95的VL序列和SEQ ID NO：96的VH序列；(e)SEQ IDNO：97的VL序列和SEQ ID NO：98的VH序列；(f)SEQ ID NO：99的VL序列和SEQ ID NO：100的VH序列；或(g)SEQ ID NO：101的VL序列和SEQ ID NO：102的VH序列。在一些实施方案中，该结合RSPO3的分离的抗体包含(a)SEQ ID NO：208的VL序列和SEQ ID NO：209的VH序列，(b)SEQ ID NO：212的VL序列和SEQ ID NO：213的VH序列，或(c)SEQ ID NO：214的VL序列和SEQID NO：205的VH序列。在一些实施方案中，该结合RSPO3的分离的抗体包含(a)SEQ ID NO：208的VL序列和SEQ ID NO：209的VH序列。在一些实施方案中，该结合RSPO3的分离的抗体包含(a)SEQ ID NO：212的VL序列和SEQ ID NO：213的VH序列。在一些实施方案中，该结合RSPO3的分离的抗体包含(a)SEQ ID NO：214的VL序列和SEQ ID NO：215的VH序列。
本文中提供的是结合RSPO2和RSPO3的分离的抗体(抗RSPO2/3抗体)。在一些实施方案中，该抗体抑制RSPO2和RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些实施方案中，该跨膜E3遍在蛋白酶为ZNRF3和/或RNF43。在一些实施方案中，该抗体抑制RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。在一些实施方案中，该抗体不抑制RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO3对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。在一些实施方案中，该抗体抑制RSPO2与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。在一些实施方案中，该抗体不抑制RSPO2与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO2对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。
例如，本文中提供的是结合RSPO2和RSPO3的抗体，其中该抗体包含：(a)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L3；和(b)VH，该VH包含(i)包含SEQID NO：50的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含(a)SEQ ID NO：103的VL序列和SEQ ID NO：104的VH序列。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗体包含第一可变域和第二可变域，其中该第一可变域包含第一套6种HVR且该第二可变域包含第二套6种HVR，且其中该第一套和第二套6种HVR是相同的。在一些实施方案中，该第一套6种HVR和该第二套6种HVR是26E11的6种HVR。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗体包含第一可变域和第二可变域，其中该第一可变域包含第一套6种HVR且该第二可变域包含第二套6种HVR，且其中该第一套和第二套6种HVR是不同的。在一些实施方案中，该第一套6种HVR是4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，和21C2中任一项的6种HVR且该第二套6种HVR是1A1，11F11，36D2，和49G5中任一项的6种HVR。在一些实施方案中，该第一套6种HVR是4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，和21C2中任一项的6种HVR且该第二套6种HVR是1A1的6种HVR。
本文中还提供的是结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体包含：(a)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ IDNO：80的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3；或(b)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3。本文中还提供的是结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体包含：(a)VL，该VL包含(i)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)包含SEQ IDNO：80的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的HVR-H3。
本文中还提供的是结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体结合RSPO3的氨基酸47-108内的一个区域(例如49-108)。
本文中还提供的是结合RSPO3表位的分离的抗体，而且在任何抗体的一些实施方案中，其中该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸：Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Lys94，和Lys97。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108。
本文中还提供的是结合RSPO3表位的分离的抗体，而且在任何抗体的一些实施方案中，其中该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸：Thr47，Leu55，Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸：Thr47，Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys97。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108。
本文中还提供的是结合RSPO3表位的分离的抗体，而且在任何抗体的一些实施方案中，其中该RSPO3表位包含选自RSPO3的Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys108的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys108。
本文中还提供的是结合RSPO3表位的分离的抗体，而且在任何抗体的一些实施方案中，其中该RSPO3表位包含选自RSPO3的Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108。
本文中还提供的是结合RSPO3表位的分离的抗体，其中该RSPO3表位包含选自RSPO3的Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，该RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108。
在任何抗体的一些实施方案中，该抗体抑制RSPO2和RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。在一些实施方案中，该跨膜E3遍在蛋白酶为ZNRF3和/或RNF43。在一些实施方案中，该抗体抑制RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。
在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体抑制RSPO2和/或RSPO3介导的wnt信号传导。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体为结合RSPO2和/或RSPO3的抗体片段。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体片段抑制RSPO2和/或RSPO3介导的wnt信号传导。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体抑制癌干细胞生长。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体诱导和/或促进癌细胞(例如癌干细胞)分化(例如终末分化和/或分化成祖细胞)。
在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体为单克隆抗体。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体为人，人源化，或嵌合抗体。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体为全长IgG1抗体。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体具有降低的或消减的效应器功能。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗RSPO抗体在依照EU编号规则的氨基酸位置297处包含工程化改造的丙氨酸。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗RSPO抗体在依照EU编号规则的氨基酸位置265处包含工程化改造的丙氨酸。
在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体用作药物。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体用于治疗癌症。在一些实施方案中，该癌症为胃肠癌，胃癌，结肠癌，结直肠癌，或直肠癌。在一些实施方案中，该癌症特征在于一种或多种RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)与参照相比升高的表达。在一些实施方案中，该癌症特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。在任何抗RSPO抗体的一些实施方案中，该抗体用于抑制wnt信号传导，抑制血管发生和/或血管形成，和/或抑制细胞增殖。
本文中还提供的是编码本文所述抗体的分离的核酸。本文中进一步提供的是包含本文所述抗体的核酸的宿主细胞。本文中提供的是生产本文所述抗体的方法，其包括培养包含本文所述抗体的核酸的宿主细胞，使得该抗体生成。在一些实施方案中，该生产方法进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
本文中提供的是包含本文所述抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。
本文中进一步提供的是包含本文所述抗体和药学可接受载剂的药物配制剂。在一些实施方案中，该药物配制剂进一步包含别的治疗剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为紫杉烷。在一些实施方案中，该紫杉烷为帕利他赛或多西他赛。在一些实施方案中，该别的治疗剂为铂剂。在一些实施方案中，该铂剂为卡铂，奥沙利铂，和/或顺铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为拓扑异构酶抑制剂。在一些实施方案中，该拓扑异构酶抑制剂为伊立替康(irinotecan)，托泊替康(topotecan)，依托泊苷(etoposide)，和/或米托蒽醌(mitoxantrone)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为亚叶酸(folinic acid)(例如Leucovorin)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为核苷代谢抑制剂。在一些实施方案中，该核苷代谢抑制剂为氟尿嘧啶(fluorouracil)，卡培他滨(capecitabine)，和/或吉西他滨(gemcitabine)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为亚叶酸，5-氟尿嘧啶，和/或奥沙利铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些实施方案中，该别的治疗剂为紫杉烷和铂剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为帕利他赛和卡铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为培美曲塞(pemetrexate)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为hedgehog抑制剂(例如维莫德吉(vismodegib))。
本文中提供的是本文所述抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，该癌症为胃肠癌，胃癌，结肠癌，结直肠癌，或直肠癌。在一些实施方案中，该癌症为肺癌。在一些实施方案中，该癌症特征在于一种或多种RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)与参照相比升高的表达。在一些实施方案中，该癌症特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。进一步，本文中提供的是本文所述抗体在制备用于抑制wnt信号传导，抑制血管发生和/或血管形成，和/或抑制细胞增殖的药物中的用途。在一些实施方案中，该抗RSPO抗体与别的治疗剂组合使用(例如顺序或并行施用)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为紫杉烷。在一些实施方案中，该紫杉烷为帕利他赛或多西他赛。在一些实施方案中，该别的治疗剂为铂剂。在一些实施方案中，该铂剂为卡铂，奥沙利铂，和/或顺铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为拓扑异构酶抑制剂。在一些实施方案中，该拓扑异构酶抑制剂为伊立替康，托泊替康，依托泊苷，和/或米托蒽醌。在一些实施方案中，该别的治疗剂为亚叶酸(例如Leucovorin)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为核苷代谢抑制剂。在一些实施方案中，该核苷代谢抑制剂为氟尿嘧啶，卡培他滨，和/或吉西他滨。在一些实施方案中，该别的治疗剂为亚叶酸，5-氟尿嘧啶，和/或奥沙利铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些实施方案中，该别的治疗剂为紫杉烷和铂剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为帕利他赛和卡铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为培美曲塞。在一些实施方案中，该别的治疗剂为hedgehog抑制剂(例如维莫德吉)。
本文中提供的是治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述抗体。在一些实施方案中，该癌症为胃肠癌，胃癌，结肠癌，结直肠癌，或直肠癌。在一些实施方案中，该癌症为肺癌。在一些实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用别的治疗剂。在一些实施方案中，该癌症特征在于一种或多种RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)与参照相比升高的表达。在一些实施方案中，该癌症特征在于RSPO易位(例如RSPO2易位和/或RSPO3易位)。本文中还提供的是在个体中抑制wnt信号传导，抑制血管发生和/或血管形成，和/或抑制细胞增殖的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述抗体以抑制wnt信号传导，抑制血管发生和/或血管形成，和/或抑制细胞增殖。在一些实施方案中，该方法包括施用别的治疗剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为紫杉烷。在一些实施方案中，该紫杉烷为帕利他赛或多西他赛。在一些实施方案中，该别的治疗剂为铂剂。在一些实施方案中，该铂剂为卡铂，奥沙利铂，和/或顺铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为拓扑异构酶抑制剂。在一些实施方案中，该拓扑异构酶抑制剂为伊立替康，托泊替康，依托泊苷，和/或米托蒽醌。在一些实施方案中，该别的治疗剂为亚叶酸(例如Leucovorin)。在一些实施方案中，该别的治疗剂为核苷代谢抑制剂。在一些实施方案中，该核苷代谢抑制剂为氟尿嘧啶，卡培他滨，和/或吉西他滨。在一些实施方案中，该别的治疗剂为亚叶酸，5-氟尿嘧啶，和/或奥沙利铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为5-氟尿嘧啶和伊立替康。在一些实施方案中，该别的治疗剂为紫杉烷和铂剂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为帕利他赛和卡铂。在一些实施方案中，该别的治疗剂为培美曲塞。在一些实施方案中，该别的治疗剂为hedgehog抑制剂(例如维莫德吉)。
附图简述
图1A-B。对一组抗RSPO2和抗RSPO3抗体测试阻断重组人(rh)RSPO2刺激的(A)和/或rhRSPO3刺激的(B)WNT报告物活性的能力。一个子集的抗体阻断rhRSPO2和/或rhRSPO3刺激的WNT报告物活性。用10ng/ml重组小鼠(rm)Wnt3a，50pM rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)，和渐增浓度的所示抗体克隆刺激WNT报告细胞。将数据针对在抗体缺失下存在的刺激的量标准化。
图2A-I。对一组抗RSPO2和抗RSPO3抗体测试对表达RSPO3的细胞团粒(A-C)，表达RSPO2的细胞团粒(D-F)，表达RSPO1的细胞团粒(G)，表达RSPO4的细胞团粒(H)，和不表达RSPO1-4的细胞(293细胞)(I)的IHC反应性。如图2所示，如通过IHC反应性测定的，抗体49G5识别表达RSPO2的细胞团粒，但不识别表达RSPO3的，表达RSPO1的，表达RSPO4的，和不表达RSPO1-4的细胞团粒。表4显示了测试IHC反应性的抗体的完整列表。如通过IHC反应性测定的，表4中测试的所有抗体均不识别表达RSPO1的，表达RSPO4的，和不表达RSPO1-4的细胞团粒。
图3A-D。对一组抗RSPO2和抗RSPO3抗体测试抑制rhRSPO2(A)，重组食蟹猴(rcyno)RSPO2(B)，小鼠(m)RSPO2(C)，和rhRSPO2 L186P变体(D)刺激wnt报告物活性的能力。用10ng/ml rmWnt3a，50pM rhRSPO2(A)，8pM rcynoRSPO2(Genentech)(B)，90pM mRSPO2(R&DSystems)(C)，或38pM rhRSPO2 L186P(Genentech)(D)任一和渐增浓度的所示抗体克隆刺激WNT报告细胞。
图4A-D。对一组抗RSPO2和抗RSPO3抗体测试抑制由rhRSPO3(A)，rcynoRSPO3(B)，mRSPO3(C)，和PTPRK融合-RSPO3(D)刺激的WNT报告物活性的能力。用10ng/ml rmWnt3a，50pM rhRSPO3(A)，13pM cynoRSPO3(Genentech)(B)，或17pM mRSPO3(R&D Systems)(C)任一和渐增浓度的所示抗体克隆刺激WNT报告细胞。在图4D中，在5ug/ml抗RSPO3缺失或存在下用10ng/ml rmWNT3a，自经所示DNA转染的293T细胞制备的条件化培养基刺激WNT报告细胞。
图5。9个抗RSPO2和抗RSPO3克隆的亲和力和IC50测量。所示克隆的Fab对所示重组(r)RSPO2和rRSPO3的亲和力是通过表面等离振子共振测定的。所示克隆的IC50测量是通过用EC50的所示rRSPO和渐增浓度的每一种抗体刺激WNT报告物测定法而测定的。H，人；C，食蟹猴；M，小鼠；-，无结合或IC50＞500nM。
图6A-B。对一组抗RSPO2和抗RSPO3抗体测试它们抑制LGR4结合rhRSPO2(A)和rhRSPO3(B)的能力。通过竞争性结合ELISA对抗体克隆个体测试抑制LGR4-ECD结合rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)的能力。对LGR5看到相似的结果(未显示的数据)。结果的汇总见表5。
图7A-B。对一组抗RSPO2和抗RSPO3抗体测试它们抑制RNF43结合rhRSPO2(A)和rhRSPO3(B)的能力。通过竞争性结合ELISA对抗体克隆个体测试抑制RNF43-ECD结合rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)的能力。对LGR5看到相似的结果(未显示的数据)。结果的汇总见表5。
图8A-B。结晶的与Fab 26E11复合的RSPO3(33-210)的模型(A)。(B)中显示Fab26E11/RSPO3相互作用的放大。
图9A-B。5D6，26E11，4H1，5C2，5E11，4D4，6E9和21C2的可变轻链区序列(A)和可变重链区序列(B)的比对。依照Kabat定义的CDR序列标有下划线。
图10A-B。11F11，1A1，36D2，和49G5的可变轻链区序列(A)和可变重链区序列(B)的比对。依照Kabat定义的CDR序列标有下划线。
图11A-D。用30mg/kg抗RSPO3抗体(5D6)或抗豚草抗体(对照)处理后4种结直肠癌患者衍生的模型(A-D)中均值肿瘤体积(mm3)的变化。图11D还显示用抗RSPO3抗体(5D6)与伊立替康(100mg/kg，第0天和第3天)的组合或抗豚草抗体(对照)和伊立替康(100mg/kg，第0天和第3天)处理后CRCD结直肠癌患者衍生的模型中均值肿瘤体积(mm3)的变化。
图12A-D。用抗豚草抗体(对照)或抗RSPO3抗体(5D6)(30mg/kg)处理的结直肠癌患者衍生的模型肿瘤在最后一剂后2-3周用苏木精和曙红染剂(H&E染剂)(A和C)和AlcianBlue染剂(B和D)进行的染色。用抗RSPO3处理的肿瘤具有独特的组织病理学，特别是粘液与抗豚草抗体对照相比显著增多，如通过Alcian Blue染色所示的。
图13A-C。(A)显示用(i)抗RSPO3抗体(5D6)，(ii)抗豚草抗体(对照)，(iii)抗RSPO3抗体(5D6)与伊立替康(100mg/kg，第0天)的组合，或抗豚草抗体(对照)和伊立替康(100mg/kg，第0天)处理后CRCC结直肠癌患者衍生的模型的均值肿瘤体积(mm3)。(B-C)显示连续移植实验，其中结直肠癌患者衍生的模型(a)用抗RSPO3抗体(5D6)或抗豚草抗体(对照；30mg/kg)处理，(b)移植并用抗RSPO3抗体(5D6)或抗豚草抗体(对照)处理。(B)显示最初或在连续移植时用抗RSPO3抗体(5D6)处理后连续移植的肿瘤的百分比肿瘤(移植物)植入率的实质性降低。(C)显示最初或在连续移植时用抗RSPO3抗体(5D6)处理后连续移植的肿瘤的变化均值肿瘤体积的显著降低。
图14A-B。5D6，5D6v1，5D6v2.1，5D6v2.2，5D6v2.3，5D6v2.4，5D6v2.8，5D6v2.10，5D6v3.2，5D6v3.3，5D6v4.1，5D6v4.3，5D6v5.1，和5D6v5.2的可变轻链区序列(A)和可变重链区序列(B)的比对。依照Kabat定义的CDR序列标有下划线。
发明详述
I.定义
如本文中使用的，术语“R-spondin”和“RSPO”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然RSPO(例如RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4)，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的RSPO以及因细胞中的加工所致的任何形式的RSPO。该术语还涵盖RSPO的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO的氨基酸序列为RSPO1，例如显示于SEQ ID NO：3。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO的氨基酸序列为RSPO2，例如显示于SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO的氨基酸序列为RSPO3，例如显示于SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO的氨基酸序列为RSPO4，例如显示于SEQ ID NO：4。
如本文中使用的，术语“R-spondin 2”和“RSPO2”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然RSPO2，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的RSPO2以及因细胞中的加工所致的任何形式的RSPO2。该术语还涵盖RSPO2的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO2的氨基酸序列为截止2013年10月18日的UNIPROT Q6UXX9-1。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO2的氨基酸序列为截止2013年10月18日的UNIPROT Q6UXX9-2。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO2的氨基酸序列为截止2013年10月18日的UNIPROT Q6UXX9-3。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。
如本文中使用的，术语“R-spondin 3”和“RSPO3”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然RSPO3，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的RSPO3以及因细胞中的加工所致的任何形式的RSPO3。该术语还涵盖RSPO3的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO2的氨基酸序列为截止2013年10月18日的UNIPROT Q9BXY4-1。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO2的氨基酸序列为截止2013年10月18日的UNIPROT Q9BXY4-2。在一些实施方案中，一种例示性人RSPO3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗RSPO2抗体”和“结合RSPO2的抗体”指能够以足够亲和力结合RSPO2，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向RSPO2的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗RSPO2抗体结合非RSPO2的蛋白质的程度小于该抗体对RSPO2的结合的约10％。在某些实施方案中，结合RSPO2的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗RSPO2抗体结合在来自不同物种的RSPO2中保守的RSPO2表位。
术语“抗RSPO3抗体”和“结合RSPO3的抗体”指能够以足够亲和力结合RSPO3，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向RSPO3的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗RSPO3抗体结合非RSPO3的蛋白质的程度小于该抗体对RSPO3的结合的约10％。在某些实施方案中，结合RSPO3的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗RSPO3抗体结合在来自不同物种的RSPO3中保守的RSPO3表位。
术语“抗RSPO2/3抗体”和“结合RSPO2和RSPO3的抗体”指能够以足够亲和力结合RSPO2和RSPO3，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向RSPO2和RSPO3的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗RSPO2/3抗体结合非RSPO2或非RSPO3的蛋白质的程度小于该抗体对RSPO2和RSPO3的结合的约10％。在某些实施方案中，结合RSPO2和RSPO3的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗RSPO2/3抗体结合在来自不同物种的RSPO2和/或RSPO3中保守的RSPO2和/或RSPO3表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“竞争结合的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号***，也称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。通常，抗体包含6个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。本文中的例示性HVR包括：
(a)高变环，存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)CDR，存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)抗原接触，存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)，和93-101(H3)(MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
在一个实施方案中，HVR残基包含图9A-B和/或图10A-B或说明书中其它部分中鉴定的那些。
除非另有说明，HVR残基及可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是依照Kabat等，见上文编号的。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(见例如Kindt等，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman andCo.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的一种成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的一种成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色***置不同的染色***置处存在。
“编码抗RSPO2抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
“编码抗RSPO3抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech，Inc.(South San Francisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作***(包括数码UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“R-spondin易位”和“RSPO易位”在本文中指如下的R-spondin，其中断裂染色体包括例如R-spondin，其变体，或片段或第二基因，其变体，或片段的一部分重附着于不同的染色***置，例如与R-spondin天然位置不同的染色***置或R-spondin天然位置之中和/或周围与第二基因天然位置不同的染色***置。R-spondin易位可以是RSPO1易位，RSPO2易位，RSPO3易位，和/或RSPO4易位。
术语“R-spondin易位融合多核苷酸”和“RSPO易位融合多核苷酸”在本文中指R-spondin易位基因产物或融合多核苷酸的核酸序列。R-spondin易位融合多核苷酸可以是RSPO1易位融合多核苷酸，RSPO2易位融合多核苷酸，RSPO3易位融合多核苷酸，和/或RSPO4易位融合多核苷酸。术语“R-spondin易位融合多肽”和“RSPO易位融合多肽”在本文中指R-spondin易位基因产物或融合多核苷酸的氨基酸序列。R-spondin易位融合多肽可以是RSPO1易位融合多肽，RSPO2易位融合多肽，RSPO3易位融合多肽，和/或RSPO4易位融合多肽。
术语“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
如本文中使用的，术语“生物标志物”指可在样品中检测的指示物，例如预测性，诊断性和/或预后性的指示物。生物标志物可以充当由特定的分子，病理学，组织学和/或临床特征表征的特定疾病或病症(例如癌症)亚型的指示物。在一些实施方案中，生物标志物是一种基因。在一些实施方案中，生物标志物是基因的一种变异(例如突变和/或多态性)。在一些实施方案中，生物标志物是易位。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA)，多肽，多肽和多核苷酸修饰(例如翻译后修饰)，碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。
生物标志物与个体增加的临床益处有关的“存在”，“量”或“水平”是样品中的可检测水平。这些可通过本领域技术人员已知的及本文中公开的方法来测量。所评估的生物标志物的表达水平或量可用于确定对治疗的响应。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，一般指样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码的和/或表观遗传的)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA)。
“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如没有罹患疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。
“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如没有罹患疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。
术语“持家型生物标志物”指通常相似地存在于所有细胞类型中的一种生物标志物或一组生物标志物(例如多核苷酸和/或多肽)。在一些实施方案中，持家型生物标志物是“持家基因”。“持家基因”在本文中指一种基因或一组基因，其编码活性对于细胞功能维持而言必要的蛋白质，且通常相似地存在于所有细胞类型中。
如本文中使用的，“扩增”一般指生成多拷贝的期望序列的过程。“多拷贝”指至少2个拷贝。“拷贝”不必然意味着与模板序列有完全的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物诸如脱氧肌苷，有意的序列变化(诸如经由包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列变化)和/或扩增期间发生的序列错误。
术语“诊断”在本文中用于指对分子或病理学状态，疾病或疾患(例如癌症)的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指特定癌症类型的鉴定。“诊断”还可以指特定癌症亚型的分类，例如通过组织病理学标准或分子特征(例如由一种或一组生物标志物(例如特定基因或由所述基因编码的蛋白质)的表达表征的亚型)。
样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清液，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液(follicular fluid)，***，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液(tissue culture medium)，组织提取物诸如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。
如本文中使用的，“参照样品”，“参照细胞”，“参照组织”，“对照样品”，“对照细胞”或“对照组织”指用于比较目的的样品，细胞，组织，标准品，或水平。在一个实施方案中，参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织自同一受试者或个体的健康和/或无疾病身体部位(例如组织或细胞)获得。例如，临近于患病细胞或组织的健康和/或无疾病细胞或组织(例如临近肿瘤的细胞或组织)。在另一个实施方案中，参照样品自同一受试者或个体的身体的未治疗组织和/或细胞获得。在还有另一个实施方案中，参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织自不是该受试者或个体的个体的健康和/或无疾病身体部位(例如组织或细胞)获得。在甚至另一个实施方案中，参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织自不是该受试者或个体的个体的身体的未治疗组织和/或细胞获得。
如本文中使用的，短语“基本上相似”表示两个数值之间足够高的相似程度(通常一个与分子有关，另一个与参照/比较分子有关)，以致本领域技术人员会认为在用所述数值(例如Kd值)测量的生物学特征背景内两个数值之间的差异没有统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异可以例如小于约20％，小于约10％，和/或小于约5％。
如本文中使用的，短语“实质性不同”表示两个数值之间足够高的差异程度(通常一个与分子有关，另一个与参照/比较分子有关)，以致本领域技术人员会认为在用所述数值(例如Kd值)测量的生物学特征背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子值的函数，所述两个数值之间的差异可以例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamycin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)
Figure BDA0000990669020000251
磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)，
Figure BDA0000990669020000252
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
Figure BDA0000990669020000253
CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure BDA0000990669020000254
)，乙酰喜树碱，东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou等，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomycin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(anthramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括
Figure BDA0000990669020000261
吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星，盐酸多柔比星脂质体注射剂
Figure BDA0000990669020000262
脂质体多柔比星TLCD-99
Figure BDA0000990669020000263
PEG化脂质体多柔比星
Figure BDA0000990669020000264
和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolicacid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤，吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0000990669020000265
替加氟(tegafur)
Figure BDA0000990669020000266
卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0000990669020000267
埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0000990669020000271
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2′-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verrucarin)A，杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)
Figure BDA0000990669020000272
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)
Figure BDA0000990669020000273
清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)
Figure BDA0000990669020000274
苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)(例如
Figure BDA0000990669020000275
)和卡铂(carboplatin)；长***类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)
Figure BDA0000990669020000276
长春新碱(vincristine)
Figure BDA0000990669020000277
长春地辛(vindesine)
Figure BDA0000990669020000278
和长春瑞滨(vinorelbine)
Figure BDA0000990669020000279
依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)
Figure BDA0000990669020000281
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
Figure BDA0000990669020000282
或
Figure BDA0000990669020000283
)，依替膦酸钠(etidronate)
Figure BDA0000990669020000284
NE-58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)
Figure BDA0000990669020000285
阿伦膦酸盐(alendronate)
Figure BDA0000990669020000286
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA0000990669020000287
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA0000990669020000288
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA0000990669020000289
以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α，Raf，H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA00009906690200002810
疫苗和基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00009906690200002811
疫苗，
Figure BDA00009906690200002812
疫苗和
Figure BDA00009906690200002813
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如
Figure BDA00009906690200002814
)；rmRH(例如
Figure BDA00009906690200002815
)；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(sunitinib，
Figure BDA00009906690200002816
Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib
Figure BDA00009906690200002817
CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodium
Figure BDA00009906690200002818
pixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus，
Figure BDA00009906690200002819
)；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH 6636，SARASARTM)；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和***龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
如本文中定义的化疗剂包括起调节，降低，阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗***类，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)，4-羟基他莫昔芬，托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA00009906690200002820
艾多昔芬(idoxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，雷洛昔芬(raloxifene)
Figure BDA00009906690200002821
曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，和选择性***受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗***类，诸如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA00009906690200002822
和EM800(此类药剂可阻断***受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，提高ER周转，和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)
Figure BDA0000990669020000291
和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole)
Figure BDA0000990669020000292
来曲唑(letrozole)
Figure BDA0000990669020000293
和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)
Figure BDA0000990669020000294
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA0000990669020000295
法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)(
Figure BDA0000990669020000296
和
Figure BDA0000990669020000297
)，戈舍瑞林(goserelin)，布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，***类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟***(fluoxymesterone)，全反式视黄酸(all transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合。
术语“细胞抑制剂”指在体外或在体内阻滞细胞生长的化合物或组合物。如此，细胞抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。细胞抑制剂的其它的例子包括通过诱导G0/G1停滞或M期停滞来阻断细胞周期行进的药剂。人源化抗Her2抗体曲妥珠单抗
Figure BDA0000990669020000298
是诱导G0/G1阻滞的细胞抑制剂的一个例子。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。某些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)，***(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《The Molecular Basis of Cancer》，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等，W.B.Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(
Figure BDA0000990669020000299
Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(
Figure BDA00009906690200002910
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。
如本文中所使用的，术语“EGFR抑制剂”指结合EGFR或以其它方式与EGFR直接相互作用，并且阻止或降低其信号传导活性的化合物，并且或者称为“EGFR拮抗剂”。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括单抗579(ATCC CRL HB8506)，单抗455(ATCC CRL HB8507)，单抗225(ATCC CRL 8508)，单抗528(ATCC CRL 8509)(见美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，诸如嵌合化的225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab)；
Figure BDA0000990669020000301
)和重构人225(H225)(见WO96/40210，Imclone SystemsInc.)；IMC-11F8，即一种完全人的，EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化的和嵌合的抗体，如记载于美国专利No.5,891,996的；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等，Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗(matuzumab))，即一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α两者竞争EGFR结合(EMD/Merck)；人EGFR抗体HuMax-EGFR(GenMab)；称为E1.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.11，E6.3和E7.6.3并记载于US 6,235,883的完全人抗体；MDX-447(MedarexInc)；及单抗806或人源化单抗806(Johns等，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。可以将抗EGFR抗体与细胞毒剂缀合，如此生成免疫缀合物(见例如EP659，439A2，MerckPatent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子诸如记载于美国专利No：5,616,582，5,457,105，5,475,001，5,654,307，5,679,683，6,084,095，6,265,410，6,455,534，6,521,620，6,596,726，6,713,484，5,770,599，6,140,332，5,866,572，6,399,602，6,344,459，6,602,863，6,391,874，6,344,455，5,760,041，6,002,008和5,747,498，及下列PCT公开文本：WO98/14451，WO98/50038，WO99/09016和WO99/24037的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，
Figure BDA0000990669020000302
Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD183805(CI 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替尼(gefitinib)(IRESSATM，4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180(6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼(
Figure BDA0000990669020000311
GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2-甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；Glaxo-SmithKline)。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤(例如何杰金(Hodgkin)氏和非何杰金氏淋巴瘤)，母细胞瘤，肉瘤，和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，肺的鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胰腺癌，胶质瘤，***，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌(liver cancer)，***癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)，白血病和其它淋巴增殖性病症，及各种类型的头和颈癌。
术语“结肠肿瘤”或“结肠癌”指结肠(自盲肠至直肠的大肠)的任何肿瘤或癌症。
术语“结直肠肿瘤”或“结直肠癌”指大肠(包括结肠(自盲肠至直肠的大肠)和直肠)的任何肿瘤或癌症，包括例如腺癌和不太普遍的形式，诸如淋巴瘤和鳞状细胞癌。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的其它成分的制剂。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分以外，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
“降低”或“抑制”指引起20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更大的总体降低的能力。在一些实施方案中，降低或抑制可以指与参照(生物学活性(例如wnt信号传导)或结合的参照水平)相比的相对降低。在一些实施方案中，降低或抑制可以指所治疗的病症的症状，转移的存在或大小，或原发性肿瘤的大小。
如本领域技术人员理解的，本文中提述“约”某值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提述“约X”的描述包括对“X”的描述。
理解的是，本文所述发明的方面和实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由.....组成”的方面和实施方案。如本文中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“所述/该”包括复数提及物，除非另有指示。
II.组合物和方法
本文中提供的是抗RSPO抗体及其用途。在某些实施方案中，提供结合RSPO2和/或RSPO3的抗体。所提供的抗体例如对于癌症(诸如结直肠癌)的诊断或治疗是有用的。
在一些方面，本文中提供的是一组抗RSPO抗体。该组抗体特征在于多种特性，其(包括但不限于)基于结合RSPO2和/或RSPO3的能力，通过IHC检测RSPO2和/或RSPO3的能力，抑制RSPO2和/或RSPO3和LGR多肽(例如LGR4和/或LGR5)的相互作用的能力，抑制RSPO2和/或RSPO3和E3遍在蛋白酶多肽(例如RNF43和/或ZNRF3)的相互作用的能力，和抑制由RSPO2，RSPO3，RSPO2多态性，和/或RSPO2易位产物刺激的wnt信号传导的能力，并鉴定了子集。
在一个方面，本文中提供的是结合RSPO2和/或RSPO3的分离的抗体。在一些实施方案中，该抗体结合RSPO2。在一些实施方案中，该抗体结合RSPO2且并非显著结合RSPO3。在一些实施方案中，该抗体结合RSPO3。在一些实施方案中，该抗体结合RSPO3且并非显著结合RSPO2。在一些实施方案中，该抗体结合RSPO2和RSPO3二者。在一些实施方案中，该抗体为多特异性抗体。在一些实施方案中，该多特异性抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该双特异性抗体包含结合RSPO2的第一可变域和结合RSPO3的第二可变域。
在某些实施方案中，该结合RSPO2和/或RSPO3的抗体为结合RSPO2的抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合RSPO2，其中该RSPO2具有SEQ ID NO：1所列序列。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合RSPO2，其中该RSPO2缺乏信号传导肽序列(例如结合SEQ IDNO：1的氨基酸22-243内的氨基酸)。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合RSPO2的一个或多个弗林蛋白酶样富半胱氨酸域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合SEQ ID NO：1的氨基酸34至134内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合SEQ ID NO：1的氨基酸39至134内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合SEQ ID NO：1的氨基酸34至84内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合SEQ ID NO：1的氨基酸90至134内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体不结合RSPO2的血小板反应蛋白(thrombospondin)1型域(例如不结合SEQ ID NO：1的氨基酸144-204内的一个区域)。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合RSPO2的血小板反应蛋白1型域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体结合SEQ ID NO：1的氨基酸144-204内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制wnt信号传导。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体在具有RSPO2多态性(例如RSPO2 L186P多态性)的个体和/或癌症中抑制wnt信号传导。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制RSPO2和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体不抑制RSPO2和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO2对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制RSPO2和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制RSPO2与黏结蛋白聚糖(syndecan)(例如Sdc4)的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制RSPO2和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用且抑制RSPO2和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用(例如11F11，36D2，49G5，和/或26E11)。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制RSPO2和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用且不抑制RSPO2和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO2对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)(例如1A1)。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体抑制癌干细胞生长。在一些实施方案中，该抗RSPO2抗体诱导和/或促进癌细胞(例如癌干细胞)分化(例如终末分化和/或分化成祖细胞)。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体诱导和/或促进癌细胞(例如癌干细胞)分化成肠细胞，杯形细胞，和/或肠内分泌细胞。
在某些实施方案中，该结合RSPO2和/或RSPO3的抗体为结合RSPO3的抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合RSPO3，其中该RSPO3具有SEQ ID NO：2所列序列。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合RSPO3，其中该RSPO3缺乏信号传导肽序列(例如结合SEQ IDNO：2的氨基酸22-272内的氨基酸)。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合RSPO3的一个或多个弗林蛋白酶样富半胱氨酸域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合SEQ ID NO：2的氨基酸35至135内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合SEQ ID NO：2的氨基酸35至86内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合SEQ ID NO：2的氨基酸92至135内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体不结合RSPO3的血小板反应蛋白1型域(例如不结合SEQ ID NO：2的氨基酸147-207内的氨基酸)。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合RSPO3的血小板反应蛋白1型域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合SEQID NO：2的氨基酸147-207内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体抑制wnt信号传导。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体抑制RSPO3和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体不抑制RSPO3和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO3对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体抑制RSPO3和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体抑制RSPO3与黏结蛋白聚糖(例如Sdc4)的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体抑制RSPO3和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用且抑制RSPO3和跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体抑制癌干细胞生长。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体诱导和/或促进癌细胞(例如癌干细胞)分化(例如终末分化和/或分化成祖细胞)。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体诱导和/或促进癌细胞(例如癌干细胞)分化成过渡扩增细胞(transit-amplifying cell)。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体诱导和/或促进癌细胞(例如癌干细胞)分化成肠细胞，杯形细胞，和/或肠内分泌细胞。
在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合SEQ ID NO：2的氨基酸49至108内的一个区域。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含一个或多个选自RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lysl08的氨基酸的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys108的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys108的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含一个或多个选自RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108的氨基酸的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的一个或多个氨基酸Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys108为4埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys108为4埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的一个或多个氨基酸Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108为4埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108为4埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的一个或多个氨基酸Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Lys94，和Lys97为3.5埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Lys94，和Lys97为3.5埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的一个或多个氨基酸Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94为3埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94为3埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离上文提供的一个或多个氨基酸为约4，3.75，3.5，3.25，或3埃任一。在一些实施方案中，该一个或多个氨基酸和/或该一个或多个氨基酸残基为约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，和/或12个氨基酸和/或氨基酸残基任一。在一些实施方案中，该表位是通过结晶学(例如实施例中描述的结晶学方法)测定的。
在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合SEQ ID NO：2的氨基酸47至108内的氨基酸。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含选自RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108的一个或多个氨基酸的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体结合包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸残基：Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108的表位。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的一个或多个氨基酸Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108为4埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸残基：Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108为4埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的一个或多个氨基酸Thr47，Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys97为3.5埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸Thr47，Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys97为3.5埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ IDNO：2)的一个或多个氨基酸Thr47，Leu55，Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94为3埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离RSPO3(例如SEQ ID NO：2)的氨基酸Thr47，Leu55，Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94为3埃或更少。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体在结合RSPO3时距离上文提供的一个或多个氨基酸为约4，3.75，3.5，3.25，或3埃任一。在一些实施方案中，该一个或多个氨基酸和/或该一个或多个氨基酸残基为约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，和/或12个氨基酸和/或氨基酸残基任一。在一些实施方案中，该抗RSPO3抗体还结合RSPO2。在一些实施方案中，该表位是通过结晶学(例如实施例中描述的结晶学方法)测定的。
在一些实施方案中，该通过结晶学测定的表位是使用RSPO3的氨基酸M33-E210测定的。在一些实施方案中，该通过结晶学测定的表位是如下实施的，即使用Labcyte Echo液体操作器使用100nL坐滴(sitting drop)设置数个稀疏矩阵晶体筛。将筛保存于18℃。在一些实施方案中，可以在含有100mM MIB pH 9和25％PEG 1500作为母液的一滴中获得晶体。在一些实施方案中，可以在含有200mM甲酸钠和20％(w/y)PEG 3,350作为母液的一滴中获得晶体。在一些实施方案中，可以收获晶体，在防冻剂溶液中浸泡10秒，并在液氮中闪冻。在一些实施方案中，该防冻剂溶液可以通过混合1μL 70％甘油与1.8μL储备溶液来生成。在一些实施方案中，该晶体可以在基于PEG的条件中生长，例如约20-25％PEG 3,350。在一些实施方案中，该晶体可以在约20％PEG 6,000，约20-25％PEG 4,000，和约25％PEG 1,500中生长。在一些实施方案中，该pH的范围可以是约3.5-9，例如介于约7和约8之间。在一些实施方案中，该盐浓度为约200mM。
在某些实施方案中，该结合RSPO2和/或RSPO3的抗体为结合RSPO2和RSPO3的抗体(例如抗RSPO2/3抗体)。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体结合RSPO2(其中该RSPO2具有SEQ ID NO：1所列序列)且结合RSPO3(其中该RSPO3具有SEQ ID NO：2所列序列)。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体抑制wnt信号传导。
在一些方面，抗体鉴定为有能力与RSPO2和RSPO3二者交叉反应。这些抗RSPO2/3抗体的活性的一种非限制性例子可以包括结合RSPO2和RSPO3，通过IHC检测RSPO2和RSPO3，抑制RSPO2和RSPO3和LGR多肽(例如LGR4和/或LGR5)的相互作用，抑制RSPO2和RSPO3和E3遍在蛋白酶多肽(例如RNF43和/或ZNRF3)的相互作用，和/或抑制由RSPO2，RSPO3，RSPO2多态性，和RSPO2易位产物刺激的wnt信号传导的能力。
本领域技术人员会进一步领会，在一些实施方案中，可以将任何抗RSPO2抗体和/或抗RSPO3抗体工程化改造成某种抗体型式，特别是双特异性型式，其会容许与RSPO2和RSPO3二者的反应性。这些有能力的抗RSPO2/3双特异性抗体可以包括结合RSPO2和RSPO3，通过IHC检测RSPO2和RSPO3，抑制RSPO2和RSPO3和LGR多肽(例如LGR4和/或LGR5)的相互作用，抑制RSPO2和RSPO3和E3遍在蛋白酶多肽(例如RNF43和/或ZNRF3)的相互作用，和/或抑制由RSPO2，RSPO3，RSPO2多态性，和RSPO2易位产物刺激的wnt信号传导的能力。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体抑制RSPO2和RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。在一些实施方案中，该抗体为双臂抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含第一和第二可变域，在每个可变域上包含26E11的6种HVR。在一些实施方案中，该抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含包含5D6或5E11的6种HVR的第一可变域和包含36D2的6种HVR的第二可变域。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体抑制RSPO3和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用且不抑制RSPO2和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO2对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。在一些实施方案中，该抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含包含5D6或5E11的6种HVR的第一可变域和包含1A1的6种HVR的第二可变域。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体抑制RSPO2和RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用。在一些实施方案中，该抗体为双臂抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含第一和第二可变域，在每个可变域上包含26E11的6种HVR。在一些实施方案中，该抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含包含5D6或5E11的6种HVR的第一可变域和包含36D2或1A1的6种HVR的第二可变域。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体抑制RSPO2和RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项和RSPO2的相互作用且抑制RSPO2和RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用。在一些实施方案中，该抗体为双臂抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含第一和第二可变域，在每个可变域上包含26E11的6种HVR。在一些实施方案中，该抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含包含5D6或5E11的6种HVR的第一可变域和包含36D2的6种HVR的第二可变域。
在任何抗RSPO2/3抗体的一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体抑制RSPO3和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项和RSPO2的相互作用且抑制RSPO2和RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43中一项或多项)的相互作用且不抑制RSPO2和LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用(例如增强RSPO2对LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的结合)。在一些实施方案中，该抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，该抗RSPO2/3抗体包含包含5D6或5E11的6种HVR的第一可变域和包含1A1的6种HVR的第二可变域。
在一个方面，本文中提供的是与抗体4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，21C2，和/或26E11中一项或多项结合相同或交叠表位的抗RSPO3抗体。进一步地，在一个方面，本文中提供的是与抗体4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，21C2，和/或26E11中一项或多项竞争结合RSPO3的抗RSPO3抗体。在一个方面，本文中提供的是与抗体IA1，11F11，26E11，36D2，和/或49G5中一项或多项结合相同或交叠表位的抗RSPO2抗体。进一步地，在一个方面，本文中提供的是与抗体IA1，11F11，26E11，36D2，和/或49G5中一项或多项竞争结合RSPO2的抗RSPO2抗体。在一个方面，本文中提供的是与1A1结合相同或交叠表位的抗RSPO2抗体。进一步地，在一个方面，本文中提供的是与IA1竞争结合RSPO2的抗RSPO2抗体。在一些实施方案中，根据BIACORE，竞争性ELISA，和/或本文所述和本领域已知的任何其它方法，该抗体与另一种抗体竞争结合。测定表位的方法是本领域已知的且本文中有描述。在一些实施方案中，该表位为线性表位。在一些实施方案中，该表位为构象表位。在一些实施方案中，该表位是通过抗体结合肽片段而测定的。在一些实施方案中，该表位是通过质谱术测定的。在一些实施方案中，该表位是通过结晶学(例如晶体结构分析)测定的。
单克隆抗体4H1和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：7的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：9的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：7的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：89和SEQ ID NO：90中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体4D4和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：91和SEQ ID NO：92中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体5C2和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：19的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：21的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：19的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：93和SEQ ID NO：94中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体5D6和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQ ID NO：189的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQID NO：189的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQID NO：188的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQ ID NO：189的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ IDNO：189的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188的氨基酸序列。在一些实施方案中，HVR-H3包含SEQID NO：189的氨基酸序列。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：95和SEQ ID NO：96中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在任何上述实施方案中，抗RSPO3抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗RSPO3抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，该人受体框架为人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，该人受体框架为包含任一下述突变的人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。
在另一个方面，抗RSPO3抗体包含与SEQ ID NO：191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，或215的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，或215的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，***，或删除，但是包含该序列的抗RSPO3抗体保留结合RSPO3的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，或215中替代，***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，或215中替代，***和/或删除了总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，替代，***，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，该抗RSPO3抗体包含SEQ ID NO：191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，或215的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：188，或SEQ ID NO：189的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO：190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，或214的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，或214的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，***，或删除，但是包含该序列的抗RSPO3抗体保留结合RSPO3的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，或214中替代，***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，或214中替代，***和/或删除了总共1至5个氨基酸。在某些实施方案中，替代，***，或删除发生在HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，该抗RSPO3抗体包含SEQ ID NO：190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，或214的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。
在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：192和SEQ ID NO：193中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：194和SEQ ID NO：195中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：196和SEQ ID NO：197中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：203中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：205中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：206和SEQ ID NO：207中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：213中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO：214和SEQ ID NO：215中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在又一个方面，本文中提供的是与本文中提供的抗RSPO3抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO：191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，或215的VH序列和SEQ ID NO：190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，或214的VL序列的抗RSPO3抗体结合相同表位的抗体。在一些实施方案中，该表位是通过结晶学测定的。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗RSPO3抗体是单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗RSPO3抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是基本上全长抗体，例如IgG1抗体，IgG2a抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
单克隆抗体5E11和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：97和SEQ ID NO：98中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体6E9和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：37的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：37的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：99和SEQ ID NO：100中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体21C2和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：45的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：43的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：101和SEQ ID NO：102中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体26E11和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO2/3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：51的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO2/3抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQID NO：103和SEQ ID NO：104中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
抗RSPO3单克隆抗体和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：79的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：81的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：79的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO3抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：85的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：87的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：85的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-L3。
单克隆抗体1A1和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO2抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：55的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：57的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：55的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO2抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：105和SEQ ID NO：106中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体11F11和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO2抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：61的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：63的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：61的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO2抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：107和SEQ ID NO：108中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体36D2和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO2抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：67的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：69的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：67的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO2抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：109和SEQ ID NO：110中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
单克隆抗体49G5和某些其它抗体实施方案
在一个方面，本发明提供一种抗RSPO2抗体，其包含至少1，2，3，4，5，或6种选自下述的HVR：(a)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ IDNO：73的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：75的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：73的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗RSPO2抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ IDNO：111和SEQ ID NO：112中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在任何上述实施方案中，抗RSPO抗体是人源化的，例如任何上述抗RSPO抗体的人源化形式。在一个实施方案中，抗RSPO抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗RSPO抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗RSPO抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG2a抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗RSPO抗体可单一地或组合地掺入下文1-7节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量Kd。在一个实施方案中，用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施RIA。例如，通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将
Figure BDA0000990669020000631
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20
Figure BDA0000990669020000632
洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，使用
Figure BDA0000990669020000633
表面等离振子共振测定法来测量Kd。例如，于25℃使用固定化抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)使用
Figure BDA0000990669020000644
-2000或
Figure BDA0000990669020000645
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)实施测定法。在一个实施方案中，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(
Figure BDA0000990669020000643
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(Kd)。见例如Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)；还可见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；见例如美国专利No.6,248,516)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，7,527,791，6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36：25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等，Methods 36：43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等，J.Immunol.151：2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Diik和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA0000990669020000661
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA0000990669020000662
技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了
Figure BDA0000990669020000663
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein，Histologyand Histopathology，20(3)：927-937(2005)及Vollmers和Brandlein，Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等，于Methods in MolecularBiology 178：1-37(0’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ，2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等，Nature 348：552-554；Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，于Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合RSPO的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的细胞。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)结合RSPO2和RSPO3。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含包含5E11的HVR的第一可变域和包含36D2的HVR的第二可变域。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含包含5D6的HVR的第一可变域和包含36D2的HVR的第二可变域。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含包含5E11的HVR的第一可变域和包含1A1的HVR的第二可变域。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含包含5D6的HVR的第一可变域和包含1A1的HVR的第二可变域。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983)，WO 93/08829，和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))，和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731，168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980，及Brennan等，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994))；及如例如Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合多种RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或***和/或替代。可以进行删除，***，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
a)替代，***，和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更多实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0000990669020000691
Figure BDA0000990669020000701
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文中所描述的那些技术)来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或接触抗原的残基做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，***，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085所描述的。在此方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此很可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI，Fc(RII和Fc(RIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)和CytoTox
Figure BDA0000990669020000731
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.等，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova，S.B.等，Int’1.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。在一些实施方案中，抗体在依照EU编号规则的氨基酸位置265处包含工程化改造的丙氨酸。在一些实施方案中，抗体在依照EU编号规则的氨基酸位置297处包含工程化改造的丙氨酸。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312；及Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298，333，和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO 99/51642，及Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.l17：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。还可见Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧杂环戊环，聚-1，3，6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗RSPO抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗RSPO抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗RSPO抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237，5,789,199和5,840,523(还可见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，及Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或如记载于例如Graham等，J.Gen Viroi.36：59(1977)的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)的)；猴肾细胞(CVl)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗RSPO抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知方法，诸如ELISA，Western印迹，等。
测定结合亲和力的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，可以依照本文实施例1所述
Figure BDA0000990669020000771
测定法来测定结合亲和力。具体地，在一些实施方案中，可以使用
Figure BDA0000990669020000772
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)使用表面等离振子共振测定法来测量Kd。
测定抗RSPO抗体破坏和/或抑制RSPO对LGR(例如LGR4，5，和/或6)，黏结蛋白聚糖(例如SDC4)，和/或E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43)的结合的能力的方法是本领域已知的。参见例如WO2011/076932；WO2013012747；Lau等，Nature 476：293-297(2011)；Hao等，Nature 485：195-200(2012)，据此通过援引将其完整收录。在一些实施方案中，可以通过流式细胞术，BIAcore测定法，和/或ELISA(例如竞争性结合ELISA)来测定抗RSPO抗体显著破坏R-spondin(RSPO)对LGR，黏结蛋白聚糖和/或E3遍在蛋白酶的结合的能力。在一些实施方案中，可以依照本文实施例1所述竞争性结合ELISA来测定抗RSPO抗体破坏和/或抑制RSPO对LGR(例如LGR4，5，和/或6)，黏结蛋白聚糖(SDC4)，和/或an E3遍在蛋白酶(例如ZNRF3和/或RNF43)的结合的能力。
在另一个方面，可以使用竞争测定法来鉴定与4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，21C2，26E11，1A1，11F11，36D2，和/或49G5竞争结合RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的抗体。
测定抗体竞争的方法是本领域已知的。在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)，例如4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，21C2，26E11，1A1，11F11，36D2，和/或49G5)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的结合的能力)的溶液中温育固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)。在允许第一抗体结合RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对RSPO(例如RSPO2和/或RSPO3)的结合。参见HarloW and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)。
实施例1中描述了对于表位分仓和/或测定两种抗体是否竞争结合有用的另一种例示性竞争测定法。在一些实施方案中，可以依照本文实施例1所述
Figure BDA0000990669020000781
测定法来测定表位分仓和/或测定两种抗体是否竞争结合。
在某些实施方案中，抗体结合4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，6E9，21C2，26E11，1A1，11F11，36D2，和/或49G5所结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细例示性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols，”in Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)。在一些实施方案中，通过肽竞争来测定表位。在一些实施方案中，通过质谱术来测定表位。在一些实施方案中，通过结晶学来测定表位。实施例1中描述了一种例示性结晶学方法。
2.活性测定法
在一个方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗RSPO抗体的测定法。生物学活性可以包括例如抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
测定抗RSPO抗体破坏wnt/β-联蛋白信号传导的能力的方法是本领域已知的。参见例如WO2005/040418和WO2013/012747，据此通过援引将其完整收录。在一些实施方案中，可以使用报告基因测定法来测定抗RSPO抗体显著破坏wnt/β-联蛋白信号传导的能力。在一些实施方案中，例如，可以将包含在wnt/β-联蛋白响应性启动子(诸如例如包含多聚化TCF/LEF DNA结合位点的启动子)控制下的报告基因(诸如例如萤光素酶基因)的报告构建物转染入细胞中。然后在RSPO抗体存在和缺失下使细胞接触Wnt配体(诸如Wnt3a)和RSPO(诸如RSPO1，RSPO2，RSPO3，和/或RSPO4)，并测量萤光素酶表达。
测定抗RSPO抗体抑制血管发生和/或血管形成的能力的方法是本领域已知的。参见例如WO2008/046649，据此通过援引将其完整收录。测定法的例子包括体内Matrigel栓和角膜新血管形成测定法，体内/体外小鸡绒毛膜***(CAM)测定法，体外细胞(增殖，迁移，管形成)和器官型(主动脉环)测定法，小鸡主动脉弓测定法，和Matrigel海绵测定法。
测定抗RSPO抗体诱导干细胞分化和/或癌干细胞消减的能力的方法是本领域已知的。参见例如WO2013/036867，据此通过援引将其完整收录。在一些实施方案中，可以通过测定在抗RSPO抗体存在和缺失下隐窝基底柱状细胞(CBC)(它是小肠中快速循环的干细胞)分化成例如肠细胞，杯形细胞，和/或肠内分泌细胞的能力来测定干细胞分化。
在某些实施方案中，通过本文中及WO2005/040418；WO2008/046649；WO2011/076932；WO2013/012747；WO2013/054307；Lau等，Nature 476：293-297(2011)；Hao等，Nature 485：195-200(2012)(据此通过援引将其完整收录)中描述的测定法对本发明的抗体测试此类生物学活性和/或结合相互作用。
在一些实施方案中，通过结晶学来测定表位。在一些实施方案中，该通过结晶学测定的表位是使用RSPO3的氨基酸M33-E210测定的。在一些实施方案中，该通过结晶学测定的表位是如下实施的，即使用100nL坐滴(sitting drop)使用Labcyte Echo液体操作器设置数个稀疏矩阵晶体筛。将筛保存于18℃。在一些实施方案中，可以在含有100mM MIB pH 9和25％PEG 1500作为母液的一滴中获得晶体。在一些实施方案中，可以在含有200mM甲酸钠和20％(w/v)PEG 3，350作为母液的一滴中获得晶体。在一些实施方案中，可以收获晶体，在防冻剂溶液中浸泡10秒，并在液氮中闪冻。在一些实施方案中，该防冻剂溶液可以通过混合1μL 70％甘油与1.8μL储备溶液来生成。在一些实施方案中，该晶体可以在基于PEG的条件中生长，例如约20-25％PEG 3，350。在一些实施方案中，该晶体可以在约20％PEG 6,000，约20-25％PEG 4,000，和约25％PEG 1,500中生长。在一些实施方案中，该pH的范围可以是约3.5-9，例如介于约7和约8之间。在一些实施方案中，该盐浓度为约200mM。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂或化疗药物，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合的本文中的抗RSPO抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞司他汀(auristatin)诸如单甲基奥瑞司他汀药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001和5,877,296；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等，CurrentMed.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)，帕利他塞(paclitaxel)，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CCl065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211，I131，I125，y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如Tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，MRI)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头，肽酶敏感性接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Res 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗RSPO抗体可用于检测样品中RSPO的存在。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，样品包含细胞或组织，诸如胃肠，胃，食道，结肠，直肠，和/或结直肠组织。在一些实施方案中，样品包含细胞或组织，诸如肾上腺，膀胱，脑，乳腺，宫颈，结肠，头和颈，肾，白血病，肝，肺，淋巴样，卵巢，胰腺，***，直肠，皮肤，胃，甲状腺，和/或子宫组织。在一些实施方案中，样品包含细胞或组织，诸如肺，卵巢，乳腺，肝，或多发性骨髓瘤组织。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗RSPO抗体。在又一方面，提供了检测样品中RSPO的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗RSPO抗体结合RSPO的条件下使样品与如本文中所描述的抗RSPO抗体接触，并检测是否在抗RSPO抗体与RSPO之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗RSPO抗体来选择适合用抗RSPO抗体治疗的受试者，例如其中RSPO是一种用于选择患者的生物标志物。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO2。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO3。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO2和RSPO3。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有升高的一种或多种干细胞生物标志物表达。在一些实施方案中，该干细胞生物标志物包含Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有降低的一种或多种分化生物标志物表达。在一些实施方案中，该分化生物标志物包含CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYT15，CA4，TFF1，和/或KRT20。
例如，本文中提供的是在个体中治疗癌症的方法，其中该癌症包含一种或多种生物标志物，该方法包括对该个体施用有效量的抗RSPO抗体。本文中还提供的是在个体中治疗癌症的方法，其包括对该个体施用有效量的抗RSPO抗体，其中治疗基于该个体具有包含一种或多种生物标志物的癌症。
易位是异常有力的癌症突变，因为它们常常对靶基因具有多重影响：在单一“突变”中，它们能显著改变蛋白质的表达，去除蛋白质的调节域，推动蛋白质的寡聚化，改变蛋白质的亚细胞定位或将蛋白质连接至新的结合域。这在临床上反映为如下事实，即一些瘤依照特定融合基因的存在来分类或管理。在任何方法的一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含表2中所列一种或多种基因的易位(例如染色体内易位，染色体间易位，重排和/或融合)。
在任何方法的一些实施方案中，该易位为PVT1。在一些实施方案中，该PVT1易位包含PVT1和MYC。在一些实施方案中，该RSPO2易位包含PVT1和IncDNA。在任何方法的一些实施方案中，该易位为R-spondin易位。在一些实施方案中，该R-spondin易位为RSPO1易位。在一些实施方案中，该R-spondin易位为RSPO2。在一些实施方案中，该RSPO2易位包含EMC2和RSPO2。在一些实施方案中，该RSPO2易位包含EIF3E和RSPO2。在一些实施方案中，该RSPO2易位包含EIF3E外显子1和RSPO2外显子2。在一些实施方案中，该RSPO2易位包含EIF3E外显子1和RSPO2外显子3。在一些实施方案中，该RSPO2易位包含SEQ ID NO：71。在一些实施方案中，该RSPO2易位是包括SEQ ID NO：114，143，和/或145的引物可检测的。在一些实施方案中，该RSPO2易位是由EIF3E启动子驱动的。在一些实施方案中，该RSPO2易位是由RSPO2启动子驱动的。在一些实施方案中，该R-spondin易位为RSPO3易位。在一些实施方案中，该RSPO3易位包含PTPRK和RSPO3。在一些实施方案中，该RSPO3易位包含PTPRK外显子1和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，该RSPO3易位包含PTPRK外显子7和RSPO3外显子2。在一些实施方案中，该RSPO3易位包含SEQ ID NO：171和/或SEQ ID NO：172。在一些实施方案中，该RSPO3易位是包括SEQ ID NO：115，116，145，和/或146的引物可检测的。在一些实施方案中，该RSPO3易位是由PTPRK启动子驱动的。在一些实施方案中，该RSPO3易位是由RSPO3启动子驱动的。在一些实施方案中，该RSPO3易位包含PTPRK分泌信号序列(和/或不包含RSPO3分泌信号序列)。
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Figure BDA0000990669020000861
在一些实施方案中，该R-spondin易位为RSPO4易位。在一些实施方案中，该R-spondin易位导致R-spondin的表达水平升高(例如与没有该R-spondin易位的参照相比)。在一些实施方案中，该R-spondin易位导致R-spondin的活性和/或激活升高(例如与没有该R-spondin易位的参照相比)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的存在包含R-spondin易位，诸如表2中的易位，和KRAS和/或BRAF。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的存在为R-spondin易位(例如重排和/或融合)，诸如表2中的易位，和KRAS和/或BRAF中的变异(例如多态性或突变)的存在。在一些实施方案中，该个体和/或癌症包含KRAS和/或BRAF中的变异(多态性或突变)。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物的存在为R-spondin易位，诸如表2中的易位的存在，而且一种或多种生物标志物的缺失为CTNNB1和/或APC中的变异(例如多态性或突变)的缺失。
在任何易位(例如染色体内易位，染色体间易位，重排和/或融合)的一些实施方案中，该易位(例如染色体内易位，染色体间易位，重排和/或融合)为体细胞易位(例如染色体内易位，染色体间易位，重排和/或融合)。在一些实施方案中，该易位为染色体内易位。在一些实施方案中，该易位为染色体间易位。在一些实施方案中，该易位为倒位。在一些实施方案中，该易位为删除。在一些实施方案中，该易位为功能性易位融合多核苷酸(例如功能性R-spondin易位融合多核苷酸)和/或功能性易位融合多肽(例如功能性R-spondin易位融合多肽)。在一些实施方案中，该功能性易位融合多肽(例如功能性R-spondin易位融合多肽)激活已知受到易位基因之一调控的途径(例如wnt信号传导途径)。在一些实施方案中，该途径为规范wnt信号传导途径。在一些实施方案中，该途径为非规范wnt信号传导途径。在一些实施方案中，测定途径激活的方法是本领域已知的，而且包括本文所述萤光素酶报告物测定法。在一些实施方案中，该方法为Seshagiri等，Nature 488：660-664(2012)和/或WO2013/120056中描述的一种或多种方法，通过援引将其完整收录。
可以使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括肿瘤，细胞增殖性病症，癌症，胃肠癌，胃癌，结直肠癌，结肠癌，和/或直肠癌。可以使用本发明的抗体来诊断的例示性病症进一步包括肾上腺癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，***，结肠癌，头和颈癌，肾癌，白血病，肝癌，肺癌(例如NSCLC)，淋巴样癌，卵巢癌，胰腺癌，***癌，直肠癌，皮肤癌(例如黑素瘤)，胃癌，甲状腺癌，和/或子宫癌。可以使用本发明的抗体来诊断的例示性病症还包括肺癌(例如NSCLC)，卵巢癌，乳腺癌，肝癌，或多发性骨髓瘤。
样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清液，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，***，羊水，乳，全血，血液衍生细胞，尿液，脑脊液，唾液，痰液，泪液，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物诸如匀浆组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。在一些实施方案中，该样品为来自胃肠，胃，食道，结肠，直肠，和/或结直肠组织的样品。在一些实施方案中，该样品为来自肾上腺，膀胱，脑，乳腺，宫颈，结肠，头和颈，肾，白血病，肝，肺，淋巴样，卵巢，胰腺，***，直肠，皮肤，胃，甲状腺，和/或子宫组织的样品。在一些实施方案中，该样品为来自肺，卵巢，乳腺，肝，或多发性骨髓瘤组织的样品。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗RSPO抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32p，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
在任何方法的一些实施方案中，升高的表达指生物标志物(例如蛋白质或核酸(例如基因或mRNA))水平中相比于参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织的任意的约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的总体增加，其通过标准的本领域已知方法诸如本文中描述的那些检测。在某些实施方案中，升高的表达指样品中生物标志物的表达水平/量的增加，其中所述增加是参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织中相应生物标志物表达水平/量的任意的至少约1.5倍，1.75倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，25倍，50倍，75倍或100倍。在一些实施方案中，升高的表达指相比参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞，对照组织或内部对照(例如持家基因)高约1.5倍，约1.75倍，约2倍，约2.25倍，约2.5倍，约2.75倍，约3.0倍或约3.25倍的总体增加。
在任何方法的一些实施方案中，降低的表达指生物标志物(例如蛋白质或核酸(例如基因或mRNA))水平中相比于参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织的任意的约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的总体降低，其通过标准的本领域已知方法诸如本文中描述的那些检测。在某些实施方案中，降低的表达指样品中生物标志物的表达水平/量的降低，其中所述降低是参照样品，参照细胞，参照组织，对照样品，对照细胞或对照组织中相应生物标志物表达水平/量的任意的至少约0.9倍，0.8倍，0.7倍，0.6倍，0.5倍，0.4倍，0.3倍，0.2倍，0.1倍，0.05倍或0.01倍。
可通过许多方法学来分析样品中各种生物标志物的存在和/或表达水平/量，其中许多是本领域中已知且熟练技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)，Western印迹分析，免疫沉淀，分子结合测定法，ELISA，ELIFA，荧光激活细胞分选(“FACS”)，MassARRAY，蛋白组学，基于血液的定量测定法(如例如血清ELISA)，生化酶活性测定法，原位杂交，Southern分析，Northern分析，全基因组测序，聚合酶链式反应(“PCR”)(包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增类型检测方法，如例如分支的DNA，SISBA，TMA等)，RNA-Seq，FISH，微阵列分析，基因表达概况分析，和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可通过蛋白质，基因和/或组织阵列分析实施的许多种测定法中的任一种。用于评估基因和基因产物状态的典型方案见于例如Ausubel等，eds.，1995，Current Protocols In MolecularBiology，Units 2(Northern Blotting)，4(Southern Blotting)，15(Immunoblotting)和18(PCR Analysis)。还可使用多重免疫测定法如那些可从Rules Based Medicine或MesoScale Discovery(“MSD”)获得的。
在一些实施方案中，使用包括以下的方法测定生物标志物的存在和/或表达水平/量：(a)在样品(如患者癌症样品)上实施基因表达概况分析，PCR(诸如rtPCR)，RNA-seq，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，或FISH；并(b)测定生物标志物在样品中的存在和/或表达水平/量。在一些实施方案中，微阵列方法包括使用微阵列芯片，其具有一种或多种能在严格条件下与编码上文所述基因的核酸分子杂交的核酸分子或具有一种或多种能与一种或多种由上文所述基因编码的蛋白质结合的多肽(诸如肽或抗体)。在一个实施方案中，PCR方法是qRT-PCR。在一个实施方案中，PCR方法是多重PCR。在一些实施方案中，通过微阵列测量基因表达。在一些实施方案中，通过qRT-PCR测量基因表达。在一些实施方案中，通过多重PCR来测量表达。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗RSPO抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
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Baxter International，Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种其它的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递***中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗RSPO抗体。
在一个方面，提供作为药物使用的抗RSPO抗体。在又一些方面，提供在***，细胞增殖性病症，和/或癌症中使用的抗RSPO抗体。在一些实施方案中，提供在促进细胞分化(包括癌细胞终末分化)中使用的抗RSPO抗体。在某些实施方案中，提供在治疗方法中使用的抗RSPO抗体。在某些实施方案中，本发明提供在治疗具有肿瘤，细胞增殖性病症，和/或癌症的个体的方法中使用的抗RSPO抗体，该方法包括对该个体施用有效量的抗RSPO抗体。在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文所述。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO2。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO3。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO2和RSPO3。在又一些实施方案中，本发明提供在抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞中使用的抗RSPO抗体。在某些实施方案中，本发明提供在个体中抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞的方法中使用的抗RSPO抗体，该方法包括对该个体施用有效量的抗RSPO抗体以抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO易位。在一些实施方案中，该RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有升高的一种或多种生物标志物表达。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO，例如RSPO2和/或RSPO3。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含干细胞生物标志物。在一些实施方案中，该干细胞生物标志物包含Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有降低的一种或多种分化生物标志物表达。在一些实施方案中，该分化生物标志物包含CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗降低一种或多种干细胞生物标志物(例如Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2)的表达。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗提高一种或多种分化生物标志物(例如CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20)的表达。在一些实施方案中，该癌症为肾上腺癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，***，结肠癌，头和颈癌，肾癌，白血病，肝癌，肺癌症(例如NSCLC)，淋巴样癌，卵巢癌，胰腺癌症，***癌，直肠癌，皮肤癌(例如黑素瘤)，胃癌，甲状腺癌，和/或子宫癌。在一些实施方案中，该癌症为肺癌(例如NSCLC)，卵巢癌，乳腺癌，肝癌，或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌。
在又一个方面，本发明提供抗RSPO抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于***，细胞增殖性病症，和/或癌症。在又一个实施方案中，该药物用于***，细胞增殖性病症，和/或癌症的方法，该方法包括对具有肿瘤，细胞增殖性病症，和/或癌症的个体施用有效量的该药物。在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文所述。在又一个实施方案中，该药物用于抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞。在又一个实施方案中，该药物用于在个体中抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞的方法，其包括对该个体施用有效量的该药物以抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO易位。在一些实施方案中，该RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有升高的一种或多种生物标志物表达。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO，例如RSPO2和/或RSPO3。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含干细胞生物标志物。在一些实施方案中，该干细胞生物标志物包含Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有降低的一种或多种分化生物标志物表达。在一些实施方案中，该分化生物标志物包含CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗降低一种或多种干细胞生物标志物(例如Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2)的表达。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗提高一种或多种分化生物标志物(例如CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFFl，和/或KRT20)的表达。在一些实施方案中，该癌症为肾上腺癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，***，结肠癌，头和颈癌，肾癌，白血病，肝癌，肺癌(例如NSCLC)，淋巴样癌，卵巢癌，胰腺癌，***癌，直肠癌，皮肤癌(例如黑素瘤)，胃癌症，甲状腺癌，和/或子宫癌。在一些实施方案中，该癌症为肺癌(例如NSCLC)，卵巢癌，乳腺癌，肝癌，或多发性骨髓瘤。
在又一个方面，本发明提供***，细胞增殖性病症，和/或癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有此类肿瘤，细胞增殖性病症，和/或癌症的个体施用有效量的抗RSPO抗体。在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所述。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO易位。在一些实施方案中，该RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有升高的一种或多种生物标志物表达。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO，例如RSPO2和/或RSPO3。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含干细胞生物标志物。在一些实施方案中，该干细胞生物标志物包含Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有降低的一种或多种分化生物标志物表达。在一些实施方案中，该分化生物标志物包含CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗降低一种或多种干细胞生物标志物(例如Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2)的表达。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗提高一种或多种分化生物标志物(例如CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20)的表达。在一些实施方案中，该癌症为肾上腺癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，***，结肠癌，头和颈癌，肾癌，白血病，肝癌，肺癌(例如NSCLC)，淋巴样癌，卵巢癌，胰腺癌，***癌，直肠癌，皮肤癌(例如黑素瘤)，胃癌症，甲状腺癌，和/或子宫癌。在一些实施方案中，该癌症为肺癌(例如NSCLC)，卵巢癌，乳腺癌，肝癌，或多发性骨髓瘤。
在又一个方面，本发明提供在个体中抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的抗RSPO抗体以抑制wnt信号传导，抑制血管发生，抑制细胞增殖，抑制癌干细胞增殖，和/或消减癌干细胞。在一个实施方案中，“个体”为人。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO易位。在一些实施方案中，该RSPO易位包含RSPO2和/或RSPO3易位。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有升高的一种或多种生物标志物表达。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO，例如RSPO2和/或RSPO3。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含干细胞生物标志物。在一些实施方案中，该干细胞生物标志物包含Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有降低的一种或多种分化生物标志物表达。在一些实施方案中，该分化生物标志物包含CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFFl，和/或KRT20。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗降低一种或多种干细胞生物标志物(例如Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2)的表达。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗提高一种或多种分化生物标志物(例如CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20)的表达。在一些实施方案中，该癌症为肾上腺癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，***，结肠癌，头和颈癌，肾癌，白血病，肝癌，肺癌(例如NSCLC)，淋巴样癌，卵巢癌，胰腺癌，***癌，直肠癌，皮肤癌(例如黑素瘤)，胃癌，甲状腺癌，和/或子宫癌症。在一些实施方案中，该癌症为肺癌(例如NSCLC)，卵巢癌，乳腺癌，肝癌，或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌。
在又一个方面，本发明提供药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗RSPO抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗RSPO抗体和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗RSPO抗体和至少一种别的治疗剂，例如下文所述。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO2。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO3。在一些实施方案中，该RSPO为RSPO2和RSPO3。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有升高的一种或多种生物标志物表达。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含RSPO，例如RSPO2和/或RSPO3。在一些实施方案中，该一种或多种生物标志物包含干细胞生物标志物。在一些实施方案中，该干细胞生物标志物包含Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2。在一些实施方案中，该个体和/或癌症具有降低的一种或多种分化生物标志物表达。在一些实施方案中，该分化生物标志物包含CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗降低一种或多种干细胞生物标志物(例如Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2)的表达。在一些实施方案中，抗RSPO抗体治疗提高一种或多种分化生物标志物(例如CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和/或KRT20)的表达。在一些实施方案中，该癌症为肾上腺癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，***，结肠癌，头和颈癌，肾癌，白血病，肝癌，肺癌(例如NSCLC)，淋巴样癌，卵巢癌，胰腺癌，***癌，直肠癌，皮肤癌(例如黑素瘤)，胃癌症，甲状腺癌，和/或子宫癌。在一些实施方案中，该癌症为肺癌(例如NSCLC)，卵巢癌，乳腺癌，肝癌，或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌。
可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，别的治疗剂为细胞毒剂，化疗剂，细胞抑制剂，抗激素剂，和/或EGFR抑制剂。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用一种或多种别的治疗剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。在一个实施方案中，抗RSPO抗体的施用和别的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或约一，两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制，确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症，在治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状态，病因，药物递送部位，给药方法，服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量，所治疗病症的类型，以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型，抗体的种类，疾病的严重性和病程，所给予抗体的预防或治疗目的，之前的治疗，患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换抗RSPO抗体或在抗RSPO抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗，预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含其它的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗RSPO抗体。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
方法
克隆和纯化：通过抗FLAG亲和层析(Genentech)，接着是大小排阻层析(Superdex75，GE Healthcare)来纯化带FLAG标签的RNF43。通过抗FLAG亲和层析，接着是阳离子交换层析(Mono S，GE Healthcare)来纯化带FLAG标签的R-spondin(hRSPO2，hRSPO2 L186，cynoRSPO2，hRSPO3，和cynoRSPO3FLAG)。通过亲和层析(MabSelect SuRe，GE Healthcare)，接着是大小排阻层析(Superdex 200，GE Healthcare)来纯化带人IgG1 Fc标签的LGR胞外域。
WNT报告物测定法：在96孔板中，在90ul补充有2.5％胎牛血清的DMEM中分配每孔4,500个293T细胞。培养16-20小时后，使用Fugene 6(Promega，Madison，WI)在10ul转染混合物中用0.04ug Topbrite 25和0.02ug SV40海肾(Renilla)DNA共转染细胞。另培养16-20小时后，于37℃将细胞用25ul 5X溶液刺激6小时。对于上清液筛选，用补充有50ng/mlrmWNT3a(R&D Systems，Minneapolis，MN)和250pM rhRSPO2或rhRSPO3(R&D Systems，Minneapolis，MN)的杂交瘤上清液刺激细胞。对于使用所克隆的抗体的测定法，添加补充有10％胎牛血清，50ng/ml rmWNT3a，250pM或5X计算EC50 rRSPO(如所示的)和渐增浓度的抗体的DMEM。对于测试条件化培养基的测定法，通过使用Fugene 6依照制造商的说明书(Promega，Madison，WI)用所示基因转染293T来准备培养基。转染后3天收集条件化培养基，补充50ng/ml rnWNT3a+/-抗RSPO抗体，并添加至报告细胞。刺激6小时后，使用PromegaDual-Glo***(Promega，Madison，WI)检测萤光素酶活性。或是作为萤火虫/海肾(RLU WNT报告物)的比或是作为在抗体缺失下的标准化值(有抗体的RLU/无抗体的RLU)来分析数据。通过用EC50的rRSPO及渐增浓度的抗体刺激细胞来测定IC50测量。使用GraphPad Prism将经过对数换算的数据拟合四参数剂量-向应方程。
表达RSPO的细胞团粒的生成：pGCIG是一种基于HIV的自我灭活型慢病毒载体，它是通过用含有CMVie启动子，多克隆位点(MCS)，内部核糖体进入位点(IRES)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的片段替换pGIPZ(Open Biosystems)的ZeoR-CMVie-tGFP-IRES-PuroR-shRNA-WRE内容而创建的。通过PCR在C端用HA表位(YPYDVPDYA)给人R-spondin 1-4可读框(ORF)带上标签，并***pGCIG的MCS中。转染前24小时，在含10％热灭活的FBS的DMEM高葡萄糖中以15x106个细胞/板在15-cm盘上分配HEK-293细胞。如下制备慢病毒上清液，即使用6ug pGCIG-hRSPO，12ug包装载体Δ8.9(Zufferey et al.，1997)，3ug包膜载体pVSV-G(Clontech)和转染试剂Genejuice(Novagen)进行共转染。转染后12小时更换培养基，并在24小时后收集病毒上清液，穿过0.45μm PES滤器(Nalgene)过滤，并于4℃保存直至进一步加工。在含10％热灭活的FBS的DMEM高葡萄糖中以1x106个细胞/板在10-cm盘上分配HEK-293细胞。容许细胞贴壁12小时，之后用10ml病毒上清液更换培养基。将病毒上清液在细胞上保留60小时，之后收获细胞，并通过FACS来分析荧光蛋白表达。设定门来对每种病毒构建体分选出2x105个eGFP表达低，中等和高的细胞。扩充细胞系，并使用HIV-1p24抗原ELISA2.0试剂盒(ZeptoMetrix Corporation)测试复制胜任病毒(RCV)生成的缺失。通过浓缩细胞培养物上清液的抗HA Western印迹来确认人R-spondin的表达和分泌，与eGFP表达水平关联较好。
IHC反应性筛选：以4um将***固定石蜡包埋细胞团粒切片。于99℃将载片用基于柠檬酸盐的pH 6.0缓冲液(Dako产品目录号S1699，Carpinteria，CA)预处理20分钟。10％血清封闭后，以1：250使用抗RSPO血清，并运行杂交瘤上清液。使用1：250的免疫前血清或总浓度10ug/ml的未免疫小鼠IgG1，2a，和2b作为阴性对照。以5ug/ml使用生物素化驴抗小鼠二抗(Jackson Immuno产品目录号715-065-151，West Grove，PA)。使用VECTASTAINElite ABC试剂盒(标准型*)(Vector Labs产品目录号PK-6100)作为检测，并用Pierce金属增强型DAB(Thermo产品目录号34065，Rockford，IL)显现信号。
表位分仓：使用Octet RED384仪器(ForteBio)实施抗RSPO抗体的表位分仓。生物素化重组RSPO(R&D Systems，Minneapolis，MN)，并以10μg/ml捕捉到链霉亲合素生物传感器上达120秒。通过添加10μg/ml达600秒来实现第一抗体的饱和结合。将相同的生物传感器浸入5μg/ml竞争性抗体中，并测量结合达300秒。在饱和性数量的第一抗体存在下第二抗体结合失败指示这两种抗体处于相同的表位仓中。
亲和力测量：使用BIAcoreTM-2000仪器通过表面等离振子共振(SPR)测量抗RSPO抗体的结合亲和力。依照供应商(GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ)的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化CM5生物传感器芯片。将RSPO抗原固定化到生物传感器芯片上以实现大约250个响应单元(RU)，接着用1M乙醇胺封闭。
对于动力学测量，于25℃以30μl/min的流速注射抗RSPO Fab在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)中的两倍连续稀释液。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为koff/kon比计算平衡解离常数(KD)。
竞争性结合ELISA：为了测量抗RSPO抗体在阻断LGR4和LGR5ECD结合RSPO中的活性，将MaxiSorp 384孔微孔板(Thermo Scientific Nunc，Roskilde，Denmark)用25ul/孔50mM碳酸盐缓冲液pH 9.6中的0.5μg/ml hRSPO2或hRSPO3(Genentech)于4℃包被过夜。将板用80ul/孔磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中的0.5％牛血清清蛋白，15ppm Proclin 300封闭1小时。以25ul/孔将测定缓冲液(含0.5％BSA，0.05％聚山梨酯20，15ppm Proclin 300的PBS)中含有0.1μg/ml LGR4-Fc或0.015μg/ml LGR5-Fc的连续稀释的抗RSPO抗体(0.078-10ng/ml，3倍连续稀释液加缓冲液空白)添加至板。温育2小时后，使用过氧化物酶标记的山羊F(ab’)2抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)检测结合至板的LGR4-Fc和LGR5-Fc。温育1小时后，将底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(MOss Inc.，Pasadena，Maryland)添加至板，并通过添加1M磷酸来停止反应。在各步骤之间用含有0.05％Tween 20的PBS，pH7.4清洗板，而且包被步骤之后的所有温育步骤是于室温在定轨摇床上实施的。在Multiskan Ascent读数仪(Thermo Scientific，Hudson，NH)上于450nm读取吸光度。
使用0.5ng/ml生物素化RNF43-Flag(在RSPO2包被板上)或20ng/ml生物素化RNF43-Flag(在RSPO3包被板上)类似地测量抗RSPO抗体在阻断RNF43结合RSPO中的活性。如上所述使用过氧化物酶标记的链霉亲合素(GE Healthcare，Piscataway，NJ)，接着是底物来检测结合的生物素化RNF43-Flag。
抗RSPO3抗体的人源化：如下所述人源化单克隆抗体5D6。残基编号依照Kabat etal.，Sequences of proteins of immunological interest，5th Ed.，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)。
以Fab形式评估5D6人源化期间构建的变体。比对来自鼠5D6的VL和VH域与人VL卡帕I(VLKI)和人VH亚组IV(VH4)共有序列。将来自鼠抗体的高变区工程化改造成VLKI和VHI受体框架。具体地，将来自mu5D6 VL域的位置24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)嫁接入VLKI中，并将来自mu5D6VH域的位置26-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)嫁接入VHI中。还分别将来自mu5D6的所有VL和VH游标位置嫁接至VLK1和VH4。此嫁接物称作v1。
这个部分中的抗体的结合亲和力是通过BIAcoreTM T200型式测定的。简言之，依照供应商的说明书用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。固定化huRSPO3以实现每个流动室中大约50个响应单位(RU)。用1M乙醇胺封闭未反应的偶联基团。对于动力学测量，于25℃以30μl/min的流速注射变体抗体在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005％surfactantP20)中的四倍连续稀释液。使用1：1朗格缪尔结合模型(BIAcoreTM T200EvaluationSoftware version 2.0)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为koff/kon比计算平衡解离常数(Kd)。
结晶学RSPO3(M33-E210)纯化：在用Kifunensine处理的培养基中生长的SF9细胞中共表达含有N端His-MBP标签的RSPO3(M33-E210)与不带标签的EndoH。收获细胞上清液，并通过在清洗缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，20mM咪唑，5％甘油)中预平衡的10mL镍-NTA琼脂糖柱。然后用10个柱体积的清洗缓冲液清洗柱。使用5个柱体积的洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，300mM咪唑，10％甘油)自柱洗脱蛋白质，并浓缩至少于30mL。添加TEV蛋白酶，并于4℃将样品针对透析缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，10mM咪唑，10％甘油)透析过夜。透析后，使样品通过用清洗缓冲液预平衡的5mL HisTrap柱。然后将样品浓缩至少于2mL，并应用于用凝胶过滤缓冲液(25mM Tris-HClpH 7.5，300mM NaCl，5％甘油)预平衡的Superdex 75 16/60柱。合并含有RSPO3(M33-E210)的级分，并浓缩。于-80℃保存等分试样。
结晶学Fab纯化：在大肠杆菌细胞中表达Fab 5D6和26E11。在裂解缓冲液(补充有25mM EDTA和1mM PMSF的PBS)中重悬浮细胞浆，并通过三次穿过微射流仪来裂解细胞。然后将裂解物以12,000rpm旋转1小时，并将经过澄清的裂解物过滤穿过0.8μm滤器。将经过澄清的裂解物直接应用于用补充有25mM EDTA的PBS预平衡的25mL蛋白G柱。用10个柱体积的PBS清洗柱，并用0.58％乙酸洗脱蛋白质。然后将洗脱液加载到用缓冲液A(20mM MES pH 5.5)预平衡的HiTrap SP HP柱上。用10个柱体积的缓冲液A清洗柱，并在缓冲液A至缓冲液B(20mM MES pH 5.5，500mM NaCl)的20个柱体积的线性梯度上洗脱蛋白质。合并含有Fab的级分，浓缩至少于2mL，并应用于用凝胶过滤缓冲液预平衡的Superdex 75 26/60柱。合并含有Fab的级分，并浓缩。于-80℃保存等分试样。
结晶学RSPO3/Fab复合物纯化：为了形成复合物，在800μL含有结合反应的凝胶过滤缓冲液中将1.25倍摩尔过量的RSPO3(M33-E210)添加至150nmol Fab。将结合反应在冰上温育1小时。然后于4℃以13,000rpm旋转反应，并加载到用凝胶过滤缓冲液预平衡的Superdex 75 16/60柱上。合并含有复合物的级分，并浓缩至20mg/mL。于-80℃保存等分试样。
结晶学：对于RSPO3(M33-E210)/Fab 5D6，使用Labcyte Echo液体操作器使用100nL坐滴设置数个稀疏矩阵晶体筛。将筛保存于18℃。在含有100mM MIB pH 9和25％PEG1500作为母液的一滴中获得晶体。通过混合1μL 70％甘油与1.8μL储备溶液来生成防冻剂溶液。收获一粒晶体，在防冻剂溶液中浸泡10秒，并在液氮中闪冻。
对于RSPO3(M33-E210)/Fab 26E11，使用Labcyte Echo液体操作器使用100nL坐滴设置数个稀疏矩阵晶体筛。将筛保存于18℃。在含有200mM甲酸钠和20％(w/v)PEG 3,350作为母液的一滴中获得晶体。通过混合1μL 70％乙二醇与1.8μL储备溶液来生成防冻剂溶液。收获一粒晶体，在防冻剂溶液中浸泡10秒，并在液氮中闪冻。
这两种复合物均在较宽范围的相似条件中结晶。几乎所有晶体在基于PEG的条件中生长，其中最常见的是20-25％PEG 3,350。其它成功的沉淀剂包括20％PEG 6,000，20-25％PEG 4,000，和25％PEG 1,500。pH范围为3.5-9，其中在介于7和8之间看到大多数晶体生长。200mM浓度的多种盐有助于晶体生长。
晶体结构测定和细化：在同步加速器上收集两种RSPO3/Fab复合物的衍射数据。使用XDS和SCALA对数据进行编索引，整合和定标。使用Fab结构作为搜索模型通过分子置换来解析RSPO3/5D6和RSPO3/26E11的晶体结构。使用PHENIX通过溶剂变平和密度修改来改进初始分子置换解析的相。使用迭代轮次的细化和重建来构建RSPO3结构。下文是RSPO3/5D6和RSPO/26E11的结晶学统计量。
表1：数据收集和细化统计量
Figure BDA0000990669020001021
Figure BDA0000990669020001031
括号中显示的是分辨率最高的壳的统计量。
体内功效实验：使RSPO3融合阳性患者衍生的肿瘤在Balbc/裸鼠中皮下生长。一旦肿瘤达到大约200mm3的大小，以30mg/kg用对照抗体或抗RSPO3抗体(5D6)处理小鼠，一周两次，持续3-4周。对于抗RSPO3抗体(5D6)与伊立替康组合使用的实验，抗RSPO3抗体的剂量给药如上所述进行，而伊立替康的剂量给药在第0天或在第0天和第3天以100mg/kg进行。
对于连续移植研究，如上所述用对照抗体或抗RSPO3抗体处理植入有RSPO3融合阳性患者衍生的肿瘤的小鼠。一旦生长曲线开始分开，取出肿瘤碎片，并移植入未免疫Balbc/裸鼠中。然后如上所述用对照或抗RSPO3抗体处理移植有肿瘤碎片的小鼠。
结果
功能阻断性和IHC反应性抗RSPO抗体的生成
为了生成抗RSPO抗体，给小鼠和仓鼠免疫接种重组人RSPO2和/或人RSPO3，并生成了杂交瘤细胞系。首先通过ELISA对来自这些细胞的上清液筛选对hRSPO1，hRSPO2，hRSPO3和hRSPO4的结合。然后对显示hRSPO2和/或hRSPO3结合的上清液测试阻断WNT报告物活性的hRSPO2和hRSPO3刺激的能力。随后克隆，表达并纯化候选者。如图1所示，一个子集的经过纯化的克隆有力地抑制rhRSPO2刺激的WNT报告物活性(图1A)和/或rhRSPO3刺激的WNT报告物活性(图1B)。
另外，筛选上清液以鉴定能用作IHC试剂的抗RSPO抗体。自稳定表达高，中等，或低水平hRSPO2或hRSPO3的293细胞制备***固定石蜡包埋的细胞团粒。另外，自293细胞和稳定表达hRSPO1或hRSPO4的293细胞制备细胞团粒。在制备的细胞团粒上对杂交瘤上清液和抗体克隆测试IHC反应性。如图2所示，根据IHC反应性，抗体49G5识别高，中等，和低水平的hRSPO2表达(D-F)，但不识别hRSPO3(A-C)，hRSPO1(G)，hRSPO4(H)，或非hRSPO1-4(I)。下文表4显示了测试的所有抗体的结果的汇总。抗体4H1，4D4，5C2，5D6，5E11，21C2特异性识别hRSPO3。抗体1A1，36D2，49G5特异性识别hRSPO2。抗体6E9和26E11识别hRSPO2和hRSPO3。
表4：一组抗RSPO抗体的IHC反应性
Figure BDA0000990669020001041
Figure BDA0000990669020001051
-，+，++，+++指示相对强度，其中-为无显著染色且+++为最高水平的染色；
百分比指示细胞染色的相对百分比
抗RSPO抗体的表位分仓
为了进一步表征抗RSPO抗体，使用OCTET RED测定法测定了抗体所落入的独特表位仓的数目。首先将抗体的亲和力排序。将具有最高亲和力的抗体结合至结合有hRSPO2或hRSPO3的生物传感器至饱和。然后评估第二抗体的结合。所测试的抗RSPO2抗体落入通过与1A1或11F11任一竞争的能力而定义的两个独特表位仓。第一独特表位仓包括1A1，49G5，和36D2，而第二独特表位仓包括11F11。所测试的抗RSPO3抗体落入通过与26E11，4H1，或21C2竞争的能力而定义的三个独特表位仓。第一独特表位仓包括26E11，5D6，5E11，和6E9，第二独特表位仓包括4H1，而第三独特表位仓包括5C2和21C2。
抗RSPO抗体的结合特异性和亲和力
为了进一步表征抗RSPO抗体，针对小鼠RSPO2(R&D Systems)和食蟹猴RSPO2(Genentech)测试了它们的功能阻断活性。一个子集的抗体克隆能阻断WNT报告细胞的hRSPO2，cynoRSPO2，和mRSPO2刺激(图3A-C)。在人群体中鉴定出RSPO2中的位置186处的多态性。为了评估抗RSPO抗体对此多态性的功能阻断活性及在此患者群体中的潜在有用性，首先纯化hRSPO2 L186P蛋白质，然后用于刺激WNT报告细胞。一个子集的抗RSPO抗体能阻断hRSPO2 L186P的功能(图3D)。
另外，对抗RSPO抗体测试了它们阻断小鼠RSPO3(R&D Systems)和食蟹猴RSPO3(Genentech)功能的能力。一个子集的抗体能抑制WNT报告细胞的hRSPO3，cynoRSPO3，mRSPO3刺激(图4A-C)。对抗RSPO抗体另外测试了它们抑制最近在结直肠肿瘤中鉴定的RSPO3融合基因(Seshagiri et al.，Nature 488：660-664(2012))的能力。通过转染编码所鉴定的两种PTPRK-RSPO3融合基因(SEQ ID NO：176和178)的构建物，制备条件化培养基。含有RSPO3或RSPO3融合基因的条件化培养基能刺激WNT报告物活性。一种抗RSPO3抗体能抑制报告细胞的RSPO3融合基因刺激(图4D)。此结果指示该抗RSPO3抗体能抑制RPSO易位介导的wnt信号传导。
使用表面等离振子共振来确认对人，小鼠，和食蟹猴RSPO的结合特异性和亲和力。自抗体克隆消化Fab片段，纯化，然后使用BIAcoreTM-2000仪器测定对重组蛋白的结合。抗体落入三个组：对RSPO2特异性的那些，对RSPO3特异性的那些，和具有一些程度的交叉反应性的那些(图5)。结合亲和力在亚纳摩尔至低纳摩尔的范围中(范围为0.073-80nM)。
抗RSPO抗体的结合特征
先前已经显示了RSPO蛋白能结合两种不同类别的跨膜蛋白：E3-连接酶(RNF43和ZNRF3)和LGR(LGR4和LGR5)(Hao et al.，Nature 485(7397)：195-200(2012))。为了测试抗RSPO抗体是否能抑制与这两类蛋白的结合，开发了一种竞争性结合ELISA测定法。在测试抑制LGR4或LGR5结合hRSPO2和hRSPO3的能力时，抗RSPO抗体落入三个范畴：能抑制的那些，不抑制的那些，和促进LGR4和LGR5的相互作用的一个(图6A-B和未显示的数据)。同样地，抗RSPO抗体组的一个子集抑制RNF43结合hRSPO2或hRSPO3(图7A-B)。下文(表5)显示了抗RSPO结果的汇总。
抗RSPO抗体的人源化
与嵌合5D6比较人源化5D6v1(称作hu5D6v1)抗体的结合亲和力。将hu5D6v1的鼠游标位置转变回人残基以评估鼠游标位置对结合hRSPO3的贡献。四种另外的轻链(L1：v1+Y36(称作v2.1)，v1+L46(称作v2.2)，v1+T69(称作v2.3)，v1+F71(称作v2.4))和四种另外的重链(v1+V71(称作v2.8)，v1+R94(称作v2.10)，v1+W47+I48+F78(称作v3.2)，v1+W47+I48+v67+F78(称作v3.3))。基于上文所述变体抗体的结合亲和力评估，轻链上的F36和T46是关键的小鼠游标残基，而重链上的V71和R94据测定是关键的小鼠游标残基(未显示的数据)。嵌合5D6以3.3E-11M的KD结合，而v1+T69(LC)+W47+I48+V67+F78(HC)(称作hu5D6v4.1)，v1+T69(LC)+W47+I48+F78(HC)(称作hu5D6v4.3)分别以6.3E-11M和7.0E-11M的KD结合。
如上所述，只是用食蟹猴或鼠RSPO3替换结合测定法中的huRSPO3，对hu5D6v4.1和嵌合5D6测试了它们结合食蟹猴和小鼠RSPO3的能力。下文表5显示了人源化抗体的结合特性。
Figure BDA0000990669020001071
在热应力(40℃，pH 5.5，2周)和盐酸2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)(AAPH)分析下测试了人源化抗体hu5D6v4.1。然后对样品施加热应力以模拟产品在保存期里的稳定性。将样品缓冲液交换入20mM组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，pH 5.5中，并稀释至1mg/mL的浓度。对1mL样品施加应力，即40C，2周，并将第二份于-70C保存作为对照。然后使用胰蛋白酶消化这两份样品以创建能使用液体层析(LC)-质谱(MS)分析来分析的肽。对于样品中的每一种肽，获取了保留时间(来自LC)以及高分辨率精确质量和肽离子片段化信息(氨基酸序列信息)(在MS中)。对感兴趣的肽(天然的和经修饰的肽离子)以+-10ppm的窗自数据集取得提取离子层析图(XIC)，并对峰积分以确定面积。为每一份样品计算修饰的相对百分比，即(经修饰肽的面积)/(经修饰肽的面积+天然肽的面积)x 100。
如通过热应力测试测定的，hu5D6v4.1在CDR-H3中具有W100b，它对氧化易感(色氨酸氧化升高11.5％。AAPH应力后自对照中的24.1％升高至35.6％)。构建了F100b(称作hu5D6v5.1)和W100bH(称作hu5D6v5.2)变体以降低潜在氧化。
通过结晶学进行的表位作图
为了进一步表征抗RSPO抗体，如上所述制备RSPO3/Fab(5D6和26E11)复合物的晶体，并测定晶体结构。见图8。表6含有5D6重链(HC)和轻链(LC)与RSPO3(F链)之间的接触的列表。表6的截留为4埃。表7含有26E11重链(HC)和轻链(LC)与RSPO3(F链)之间的接触的列表。表7的截留为4埃。5D6和26E11二者的大多数接触是与RSPO3的弗林蛋白酶1域的。
Figure BDA0000990669020001081
表6：RSPO3和5D6重和轻链的接触残基
Figure BDA0000990669020001091
Figure BDA0000990669020001101
Figure BDA0000990669020001111
Figure BDA0000990669020001121
Figure BDA0000990669020001131
表7：RSPO3和26E11重和轻链的接触残基
Figure BDA0000990669020001141
Figure BDA0000990669020001151
Figure BDA0000990669020001161
Figure BDA0000990669020001171
Figure BDA0000990669020001181
Figure BDA0000990669020001191
体内功效
在结直肠癌PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤模型中测试了抗RSPO3抗体的功效。在PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤模型和/或NSCLC组织中，与用抗RSPO3抗体处理之前的表达水平相比，抗RSPO3抗体(5D6)显著降低肠干细胞标志物的基因表达：Myc，Axin2，LGR5，TERT，BIRC5，和/或Ascl2，而分化标志物的基因表达是升高的，例如CEACAM7，SLC26A3，CA1，SYTl5，CA4，TFF1，和KRT20(未显示的数据)。不希望受任何特定理论束缚，如通过基因表达标志物测定的，这些结果提示抗RSPO3抗体(5D6)能够促进干细胞样标志物概况转变成分化标志物概况。
还在结直肠癌PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤模型中测试了用抗RSPO3抗体(5D6)处理后随时间对肿瘤体积的影响(例如肿瘤生长抑制)，如图11A-D所示。用抗RSPO3抗体(5D6)处理该模型显示肿瘤生长的显著降低或肿瘤生长的停滞。在该模型中，消退和/或停滞并非在用抗RSPO3抗体(5D6)处理后立即发生；治疗启动后消退或停滞的发生存在延迟。而且，在用H&E染剂和Alcian Blue染剂对用抗豚草抗体或抗RSPO3抗体(5D6)处理的结直肠癌患者衍生的模型肿瘤染色时，组织病理学存在惊人的差异，如图12A-D所示。在用抗RSPO3(5D6)处理的肿瘤中，肿瘤细胞的数目有显著的减少。大多数剩余细胞的组织学与已分化的，成熟的非增殖的杯形细胞一致。另外，与抗豚草抗体对照相比，粘液有显著的增多，如Alcian Blue染色所示。相应地，测量得到的肿瘤体积可能实际上有显著部分是由粘液而非肿瘤细胞占据的，因此，对肿瘤生长抑制的影响可能实际上是低估的。不希望受任何特定理论束缚，这些功效数据与RSPO3融合阳性肿瘤的等级组织一致：癌干细胞的增殖依赖于RSPO蛋白质，而且在用抗RSPO3抗体(5D6)处理后，癌干细胞死亡或分化成过渡扩增(TA)细胞。在确保它们补给的干细胞源缺失下，后者经历有限次数的细胞***，此后它们终末分化，导致它们的耗尽。因此，TA细胞群体的动力学和总体大小可能决定肿瘤生长抑制的发生。
再次，不希望受任何特定理论束缚，基于所描述的RSPO3融合阳性肿瘤的等级组织的理论，与在PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤模型中单独用该化疗剂治疗相比，通过杀死TA细胞群体和提高功效，与化疗剂的组合治疗应当缩短消退和/或停滞发生的延迟。与此理论一致且如图11D和13A所示，与在CRCD和CRCC结直肠癌PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤模型中单独用伊立替康处理相比，抗RSPO3抗体(5D6)与伊立替康组合显著缩短消退和/或停滞和降低的肿瘤生长发生的延迟。通过施用抗RSPO3抗体与化疗的组合，癌干细胞和TA细胞二者被靶向更早的消退或肿瘤生长停滞。
而且，不希望受任何特定理论束缚，基于上文所述RSPO3融合阳性肿瘤的等级组织的理论以及干细胞隔室负责肿瘤起始的想法，如通过肿瘤移植测定法测量的，用抗RSPO3抗体处理的移植的PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤模型应当具有减少的癌干细胞群体，这应当降低连续PTPRK-RSPO融合患者衍生的肿瘤的建立和肿瘤生长。还有，与此理论一致且如图13B-C所示，在连续移植物实验中，抗RSPO3抗体(5D6)处理导致在连续移植后来自经抗RSPO3处理的碎片的肿瘤建立及生长更少。
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
SEQ ID NO：1＞sp|Q6UXX9|RSPO2_人R-spondin-2 OS＝Homo sapiens GN＝RSPO2MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCD SCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
SEQ ID NO：2＞sp|Q9BXY4|RSPO3_人R-spondin-3 OS＝Homo sapiens GN＝RSPO3MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLS SCP SGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
SEQ ID NO：3＞sp|Q2MKA7|RSPO1_人R-spondin-1 OS＝Homo sapiens GN＝RSPO1MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA
SEQ ID NO：4＞sp|Q2I0M5|RSPO4_人R-spondin-4 OS＝Homo sapiens GN＝RSPO4MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIIC SEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP
Figure BDA0000990669020001211
Figure BDA0000990669020001221
Figure BDA0000990669020001231
Figure BDA0000990669020001241
Figure BDA0000990669020001251
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多核苷酸(SEQ ID NO：173)
GAGCACAGACTCCCTTTTCTTTGGCAAGATGGCGGAGTACGACTTGACTACTCGCATCGCGCACTTTTTGGATCGGCATCTAGTCTTTCCGCTTCTTGAATTTCTCTCTGTAAAGGAGGTTCGTGGCGGAGAGATGCTGATCGCGCTGAACTGACCGGTGCGGCCCGGGGGTGAGTGGCGAGTCTCCCTCTGAGTCCTCCCCAGCAGCGCGGCCGGCGCCGGCTCTTTGGGCGAACCCTCCAGTTCCTAGACTTTGAGAGGCGTCTCTCCCCCGCCCGACCGCCCAGATGCAGTTTCGCCTTTTCTCCTTTGCCCTCATCATTCTGAACTGCATGGATTACAGCCACTGCCAAGGCAACCGATGGAGACGCAGTAAGCGAGCTAGTTATGTATCAAATCCCATTTGCAAGGGTTGTTTGTCTTGTTCAAAGGACAATGGGTGTAGCCGATGTCAACAGAAGTTGTTCTTCTTCCTTCGAAGAGAAGGGATGCGCCAGTATGGAGAGTGCCTGCATTCCTGCCCATCCGGGTACTATGGACACCGAGCCCCAGATATGAACAGATGTGCAAGATGCAGAATAGAAAACTGTGATTCTTGCTTTAGCAAAGACTTTTGTACCAAGTGCAAAGTAGGCTTTTATTTGCATAGAGGCCGTTGCTTTGATGAATGTCCAGATGGTTTTGCACCATTAGAAGAAACCATGGAATGTGTGGAAGGATGTGAAGTTGGTCATTGGAGCGAATGGGGAACTTGTAGCAGAAATAATCGCACATGTGGATTTAAATGGGGTCTGGAAACCAGAACACGGCAAATTGTTAAAAAGCCAGTGAAAGACACAATACTGTGTCCAACCATTGCTGAATCCAGGAGATGCAAGATGACAATGAGGCATTGTCCAGGAGGGAAGAGAACACCAAAGGCGAAGGAGAAGAGGAACAAGAAAAAGAAAAGGAAGCTGATAGAAAGGGCCCAGGAGCAACACAGCGTCTTCCTAGCTACAGACAGAGCTAACCAATAA
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：174)
MAEYDLTTRIAHFLDRHLVFPLLEFLSVKEVRGGEMLIALNMQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)易位融合多核苷酸序列(SEQ ID NO：175)
ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCCTCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGTGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：176)
MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGR
PTPRK(e7)-RSPO3(e2)易位融合多核苷酸序列(SEQ ID NO：177)
ATGGATACGACTGCGGCGGCGGCGCTGCCTGCTTTTGTGGCGCTCTTGCTCCTCTCTCCTTGGCCTCTCCTGGGATCGGCCCAAGGCCAGTTCTCCGCAGGTGGCTGTACTTTTGATGATGGTCCAGGGGCCTGTGATTACCACCAGGATCTGTATGATGACTTTGAATGGGTGCATGTTAGTGCTCAAGAGCCTCATTATCTACCACCCGAGATGCCCCAAGGTTCCTATATGATAGTGGACTCTTCAGATCACGACCCTGGAGAAAAAGCCAGACTTCAGCTGCCTACAATGAAGGAGAACGACACTCACTGCATTGATTTCAGTTACCTATTATATAGCCAGAAAGGACTGAATCCTGGCACTTTGAACATATTAGTTAGGGTGAATAAAGGACCTCTTGCCAATCCAATTTGGAATGTGACTGGATTCACGGGTAGAGATTGGCTTCGGGCTGAGCTAGCAGTGAGCACCTTTTGGCCCAATGAATATCAGGTAATATTTGAAGCTGAAGTCTCAGGAGGGAGAAGTGGTTATATTGCCATTGATGACATCCAAGTACTGAGTTATCCTTGTGATAAATCTCCTCATTTCCTCCGTCTAGGGGATGTAGAGGTGAATGCAGGGCAAAACGCTACATTTCAGTGCATTGCCACAGGGAGAGATGCTGTGCATAACAAGTTATGGCTCCAGAGACGAAATGGAGAAGATATACCAGTAGCCCAGACTAAGAACATCAATCATAGAAGGTTTGCCGCTTCCTTCAGATTGCAAGAAGTGACAAAAACTGACCAGGATTTGTATCGCTGTGTAACTCAGTCAGAACGAGGTTCCGGTGTGTCCAATTTTGCTCAACTTATTGTGAGAGAACCGCCAAGACCCATTGCTCCTCCTCAGCTTCTTGGTGTTGGGCCTACATATTTGCTGATCCAACTAAATGCCAACTCGATCATTGGCGATGGTCCTATCATCCTGAAAGAAGTAGAGTACCGAATGACATCAGGATCCTGGACAGAAACCCATGCAGTCAATGCTCCAACTTACAAATTATGGCATTTAGATCCAGATACCGAATATGAGATCCGAGTTCTACTTACAAGACCTGGTGAAGGTGGAACGGGGCTCCCAGGACCTCCACTAATCACCAGAACAAAATGTGCAGTGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG
PTPRK(e7)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：178)
MDTTAAAALPAFVALLLLSPWPLLGSAQGQFSAGGCTFDDGPGACDYHQDLYDDFEWVHVSAQEPHYLPPEMPQGSYMIVDSSDHDPGEKARLQLPTMKENDTHCIDFSYLLYSQKGLNPGTLNILVRVNKGPLANPIWNVTGFTGRDWLRAELAVSTFWPNEYQVIFEAEVSGGRSGYIAIDDIQVLSYPCDKSPHFLRLGDVEVNAGQNATFQCIATGRDAVHNKLWLQRRNGEDIPVAQTKNINHRRFAASFRLQEVTKTDQDLYRCVTQSERGSGVSNFAQLIVREPPRPIAPPQLLGVGPTYLLIQLNANSIIGDGPIILKEVEYRMTSGSWTETHAVNAPTYKLWHLDPDTEYEIRVLLTRPGEGGTGLPGPPLITRTKCAVHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH
Figure IDA0000990669060000011
Figure IDA0000990669060000021
Figure IDA0000990669060000031
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Figure IDA0000990669060000181
Figure IDA0000990669060000191
Figure IDA0000990669060000201
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Claims (34)

1.一种结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体包含：
(a)VL，该VL包含(i)如SEQ ID NO：23的氨基酸序列所示的HVR-L1，(ii)如SEQ ID NO：24的氨基酸序列所示的HVR-L2，和(iii)如SEQ ID NO：25的氨基酸序列所示的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)如SEQ ID NO：26的氨基酸序列所示的HVR-H1，(ii)如SEQ ID NO：27的氨基酸序列所示的HVR-H2，和(iii)如SEQ ID NO：28的氨基酸序列所示的HVR-H3；
(b)VL，该VL包含(i)如SEQ ID NO：23的氨基酸序列所示的HVR-L1，(ii)如SEQ ID NO：24的氨基酸序列所示的HVR-L2，和(iii)如SEQ ID NO：25的氨基酸序列所示的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)如SEQ ID NO：26的氨基酸序列所示的HVR-H1，(ii)如SEQ ID NO：27的氨基酸序列所示的HVR-H2，和(iii)如SEQ ID NO：188的氨基酸序列所示的HVR-H3；或
(c)VL，该VL包含(i)如SEQ ID NO：23的氨基酸序列所示的HVR-L1，(ii)如SEQ ID NO：24的氨基酸序列所示的HVR-L2，和(iii)如SEQ ID NO：25的氨基酸序列所示的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)如SEQ ID NO：26的氨基酸序列所示的HVR-H1，(ii)如SEQ ID NO：27的氨基酸序列所示的HVR-H2，和(iii)如SEQ ID NO：189的氨基酸序列所示的HVR-H3。
2.权利要求1的分离的抗体，其中该抗体包含
(a)如SEQ ID NO：95所示的VL序列和如SEQ ID NO：96所示的VH序列；
(b)如SEQ ID NO：190所示的VL序列和如SEQ ID NO：191所示的VH序列；
(c)如SEQ ID NO：192所示的VL序列和如SEQ ID NO：193所示的VH序列；
(d)如SEQ ID NO：194所示的VL序列和如SEQ ID NO：195所示的VH序列；
(e)如SEQ ID NO：196所示的VL序列和如SEQ ID NO：197所示的VH序列；
(f)如SEQ ID NO：198所示的VL序列和如SEQ ID NO：199所示的VH序列；
(g)如SEQ ID NO：200所示的VL序列和如SEQ ID NO：201所示的VH序列；
(h)如SEQ ID NO：202所示的VL序列和如SEQ ID NO：203所示的VH序列；
(i)如SEQ ID NO：204所示的VL序列和如SEQ ID NO：205所示的VH序列；
(j)如SEQ ID NO：206所示的VL序列和如SEQ ID NO：207所示的VH序列；
(k)如SEQ ID NO：208所示的VL序列和如SEQ ID NO：209所示的VH序列；
(l)如SEQ ID NO：210所示的VL序列和如SEQ ID NO：211所示的VH序列；
(m)如SEQ ID NO：212所示的VL序列和如SEQ ID NO：213所示的VH序列；或
(n)如SEQ ID NO：214所示的VL序列和如SEQ ID NO：215所示的VH序列。
3.一种结合RSPO3的分离的抗体，其中该抗体包含：
(a)VL，该VL包含(i)如SEQ ID NO：77的氨基酸序列所示的HVR-L1，(ii)如SEQ ID NO：78的氨基酸序列所示的HVR-L2，和(iii)如SEQ ID NO：79的氨基酸序列所示的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)如SEQ ID NO：80的氨基酸序列所示的HVR-H1，(ii)如SEQ ID NO：81的氨基酸序列所示的HVR-H2，和(iii)如SEQ ID NO：82的氨基酸序列所示的HVR-H3；或
(b)VL，该VL包含(i)如SEQ ID NO：77的氨基酸序列所示的HVR-L1，(ii)如SEQ ID NO：78的氨基酸序列所示的HVR-L2，和(iii)如SEQ ID NO：79的氨基酸序列所示的HVR-L3；和VH，该VH包含(i)如SEQ ID NO：80的氨基酸序列所示的HVR-H1，(ii)如SEQ ID NO：81的氨基酸序列所示的HVR-H2，和(iii)如SEQ ID NO：216的氨基酸序列所示的HVR-H3。
4.权利要求1-3任一项的分离的抗体，其中该抗体抑制RSPO3与跨膜E3遍在蛋白酶的相互作用。
5.权利要求4的分离的抗体，其中该抗体抑制RSPO3与LGR4，LGR5，和/或LGR6中一项或多项的相互作用。
6.权利要求4或5的分离的抗体，其中所述跨膜E3遍在蛋白酶为ZNRF3和/或RNF43。
7.权利要求1-6任一项的分离的抗体，其中该抗体结合RSPO3的氨基酸47-108内的一个区域。
8.权利要求1-7任一项的分离的抗体，其中该抗体结合包含RSPO3的氨基酸残基：Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94的RSPO3表位。
9.权利要求8的分离的抗体，其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸：Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Lys94，和Lys97。
10.权利要求9的分离的抗体，其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Ser49，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Ile73，Gly74，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，Lys97，和Lys108。
11.权利要求1-6任一项的分离的抗体，其中该抗体结合包含RSPO3的氨基酸：Thr47，Leu55，Gln72，Pro90，Asp91，和Lys94的RSPO3表位。
12.权利要求11的抗体，其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸：Thr47，Asn52，Leu55，Phe63，Gln72，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Lys94，和Lys97。
13.权利要求12的分离的抗体，其中所述RSPO3表位包含RSPO3的氨基酸残基：Thr47，Asn52，Cys54，Leu55，Ser56，Phe63，Leu65，Gln72，Tyr84，Tyr89，Pro90，Asp91，Ile92，Asn93，Lys94，Lys97，和Lys108。
14.权利要求1-13任一项的分离的抗体，其中该抗体抑制RSPO3介导的wnt信号传导。
15.权利要求1-14任一项的抗体，其为结合RSPO3的抗体片段。
16.权利要求1-15任一项的抗体，其为单克隆抗体。
17.权利要求1-16任一项的抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。
18.权利要求1-14任一项的抗体，其为全长IgG1或IgG2a抗体。
19.分离的核酸，其编码权利要求1-18任一项的抗体。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求19的核酸。
21.一种生产抗体的方法，其包括培养权利要求20的宿主细胞使得该抗体生成。
22.权利要求21的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
23.一种免疫缀合物，其包含权利要求1-18任一项的抗体和细胞毒剂。
24.一种药物配制剂，其包含权利要求1-18任一项的抗体和药学可接受载剂。
25.权利要求24的药物配制剂，其进一步包含别的治疗剂。
26.权利要求1-18任一项的抗体，其用作药物。
27.权利要求1-18任一项的抗体，其用于治疗特征在于与参照相比RSPO3表达升高的癌症。
28.权利要求1-18任一项的抗体，其用于治疗特征在于RSPO3易位的癌症。
29.权利要求27或28的抗体，其中所述癌症为胃肠癌，胃癌，结肠癌，结直肠癌，肺癌，或直肠癌。
30.权利要求1-18任一项的抗体，其用于抑制wnt信号传导，抑制血管发生(angiogenesis)和/或血管形成(vasculogenesis)，和/或抑制细胞增殖。
31.权利要求1-18任一项的抗体在制备用于治疗特征在于与参照相比RSPO3表达升高的癌症的药物中的用途。
32.权利要求1-18任一项的抗体在制备用于治疗特征在于RSPO3易位的癌症的药物中的用途。
33.权利要求31或32的用途，其中所述癌症为胃肠癌，胃癌，结肠癌，结直肠癌，肺癌，或直肠癌。
34.权利要求1-18任一项的抗体在制备用于抑制wnt信号传导，抑制血管发生和/或血管形成，和/或抑制细胞增殖的药物中的用途。
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