CN105712490A - 一种兼养微生物营养转化处理高氨氮废水的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法。本发明所设计的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，按照以下步骤进行：1)兼养微生物的转接与培养；2)在富含有机碳培养基或富含机碳废水中高密度培养；3)兼养微生物异养细胞的收获；4)转接到高氨氮废水进行自养培养，吸收高浓度氨氮并净化废水。本发明引入了改变兼养非生物营养代谢途径的方法，用来处理高氨氮废水，处理完的废水又可以回收利用，满足了微藻工业化处理废水应用的要求，是一条经济、高效地制微藻污水处理的新途径。收获的微藻细胞可以进一步处理用于生物能源和动物饲料等的制备。

Description

一种兼养微生物营养转化处理高氨氮废水的方法
技术领域
本发明涉及高氨氮废水的处理方法，具体地指一种兼养微生物营养转化处理高氨氮废水的方法。
背景技术
水资源危机是21世纪人类面临的重大挑战。随着全球工业化、现代化的迅猛发展，人类社会对于水资源的需求与日俱增。然而，由于人类的活动导致水环境的严重污染，制约甚至阻碍了社会发展与进步的势头。
高氨氮(NH4 +-N)废水的处理净化是全球废水处理的一大难题，许多工农业生产部门如畜牧业、化肥业、***业、垃圾填埋场等，均有大量高氨氮废水排放。若不加以有效处理，该类废水会造成水体富营养化、恶臭、土壤退化、地下水污染等一系列严重环境问题。NH4 +-N可通过多种物理、化学、生物方法去除，生物法由于成本较低且对环境副作用较小，近几十年来成为业内热点。目前为止，通过硝化-反硝化过程脱氮的活性污泥法应用最为广泛，但该法的建设成本以及曝气设备的建设和运营都需投入大量成本，此外，该类废水的C/N比一般远低于活性污泥法的最适处理范围，不额外投加有机碳氨氮去除无法达标，投加碳源又会增加废水的处理成本。
国内外研究表明，采用兼养微生物如微藻处理废水可克服上述缺陷。由于NH4 +-N是最易被大多数微藻利用的氮源形式，因此以微藻为主体的污水处理***在氨氮去除上比以细菌为主体的活性污泥法有明显优势。菌藻***或单纯微藻***的引入，近年来成为解决传统活性污泥处理高高氨氮废水局限的新思路。以微藻为主体的处理***对氨氮的去除途径包括：(1)微藻光合作用产生氧气促进硝化-反硝化进程；(2)微藻在光合作用过程中引起废水pH值升高，使NH4 +-N以自由氨的形式挥发；(3)***搅拌、混合导致自由氨进一步挥发(也称强化吹脱效应)；(4)NH4 +-N被微藻细胞吸附、吸收。然而上述***中，被微藻细胞吸附、吸收的氨氮通常仅占微藻处理***的一小部分，大量氨逸散到大气中会造成潜在的大气污染。为检测高NH4 +-N废水处理时，被微藻细胞实际吸附、吸收的NH4 +-N量，需采用灭菌且调控pH值的配水，以排除细菌硝化-反硝化作用、pH值升高、搅拌混合引起的自由氨挥发吹脱以及细菌等其他微生物的影响。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有技术所存在的不足，提供一种兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法。
为实现上述目的，本发明所设计的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，按照以下步骤进行：
1)兼养微生物的转接与培养：于-70℃冰箱中接种兼养微生物菌株并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照自养、混养或异养培养；
所述自养培养条件如下：温度为20～45℃，以28℃为最佳；光照培养氮源的初始浓度为1～15g/L，优选4g/L，氮源为甘氨酸或酵母提取物；通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50～300L/h，优选80～120L/h，CO2浓度0.9～3％；培养过程中采用10～200μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50～400小时，优选120～200小时；
所述混养和异养培养条件如下：通入空气，通气量100～400L/h，优选150～250L/h；培养过程中采用5～40μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72～200小时，优选100～150小时；其中，异养培养在培养基中加入不同有机碳源至初始还原糖浓度为0.1～200g/L，优选为15～20g/L；混养培养在培养基中加入不同有机碳源和无机碳源，有机碳源至初始还原糖浓度为0.1～200g/L，优选为15～20g/L，无机碳源为质量分数0.001％～100％CO2，最优2％，或浓度为0.1～100g/L的NaHCO3或Na2CO3或两者的混合，最优0.2g/L；
2)在富含有机碳培养基或富含机碳废水中高密度培养：将平板培养物接种至生物反应装置在富含有机碳培养基或富含机碳废水中高密度异养培养，直到细胞对数生长期细胞密度达到106～1010；异养培养条件如下：在培养基中加入不同有机碳源至初始还原糖浓度为0.1～200g/L，通入空气，通气量100～400L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5～40μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72～200小时，优选100～150小时；
3)兼养微生物异养细胞的收获：取对数生长后期或稳定期的异养细胞，在2000～8000r/min的低转速下离心收获，收获的兼养微生物异养细胞用无菌水冲洗两次，然后再次收获；
4)转接到高氨氮废水进行自养培养，吸收高浓度氨氮并净化废水：将收获的兼养微生物异养细胞加入高氨氮废水中进行自养培养，兼养微生物异养细胞与高氨氮废水的体积比为1:1～1:100，营养转化过程中需要吸收大量的高氨氮营养物用于合成叶绿体相关组件和各种与光合作用有关的酶，从而达到净化废水的目的；
所述自养培养条件如下：温度为20～45℃，以28℃为最佳；光照培养氮源为氨氮，通过加入不同量的NH4Cl调节高氨氮废水中氨氮初始浓度，使氨氮初始浓度在40mg/L～160mg/L之间，其中NH4Cl的浓度为40mg/L、80mg/L和160mg/L；通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50～300L/h，优选80～120L/h；CO2浓度0.1～15％；培养过程中采用10～200μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于4～400小时，优选12-48小时；
所述高氨氮废水配方如下：NaCl0.007g/L、MgSO4·7H2O0.002g/L、CaCl2·2H2O0.004g/L、KH2PO40.0085g/L、K2HPO40.0217g/L、Na2HPO40.025g/L、微量金属溶液0.1ml/L，其中微量金属溶液组成：H3BO35.7g/L、MnCl2·4H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O11g/L、FeSO4·7H2O2.5g/L、Na2MoO4·2H2O0.15g/L、Na2EDTA25g/L和CoCl2·6H2O0.8g/L。
本发明步骤1)中，所述兼养微生物优选为微藻或光合细菌。
本发明步骤2)中，所述有机碳源优选为葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、糖蜜、核糖、脱氧核糖、核酮糖、乙酸、丙酸、丁酸或甘油。所述有机碳源初始还原糖浓度为1～20g/L。
本发明步骤2)中，所述富含有机碳废水优选为生活废水、造纸厂废水、糖蜜废水、啤酒厂废水，奶制品加工厂废水、沼气发酵废水或动物粪便废水。
本发明中，所述微藻优选为小球藻属、筒柱藻属、硅藻、菱形藻、裂壶藻、杜氏藻属、栅藻、微绿球藻、衣藻属、扁藻或空球藻属。
本发明中，所述微藻包括但不限于小球藻属(Chlorellasp.)、筒柱藻属(Cylindrothecasp.)、硅藻(Diatom)、菱形藻(Nitzschiasp.)、裂壶藻(schizochytriumsp.)、杜氏藻属(dunaliella)、栅藻(Scenedesmussp.)、微绿球藻(Nannochlorissp.)、衣藻属(chlamydomonassp.)、扁藻(Tetraselmissp.)、空球藻属(Eudorinasp.)。
本发明中，所述光合细菌包括但不限于蓝细菌(Cyanobacteria)和紫色细菌，所述蓝细菌(Cyanobacteria)选自聚球蓝细菌属(Synechococcus)或大颤蓝菌属(Oscillatoria)，所述紫色细菌选自红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或红微菌属(Rhodomicrobium)。
本发明中，高密度培养混养或异养培养基配方为：K2HPO4·3H2O0.04g/L、MgSO4·7H2O0.075g/L、CaCl2·2H2O0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001g/L、NaNO31.5g/L、Na2CO30.02g/L和A5微量元素液1.5ml/L；其中，A5微量元素液组成：H3BO32.86g/L、MnCl2·4H2O1.81g/L、ZnSO4·7H2O0.222g/L、NaMoO4·2H2O0.39g/L、CuSO4·5H2O0.079g/L和CoCl2·6H2O0.05g/L。
自养、兼养、异养是微藻的三种营养模式。绝大多数微藻只能自养，部分可进行兼养和异养。自养微藻以光能为能源，无机碳为碳源，异养微藻只能以有机物为能源和碳源，兼养微藻则可同时进行自养与异养两种营养模式，即：既以光能为能源，又以有机物为能源；既以无机碳为碳源，又以有机物为碳源。与传统自养模式相比，异养、兼养模式通常能在相对较短时间内实现生物量的显著增加，而光能的利用又使兼养模式的产量近于或高于异养模式。因此，将异养、兼养微藻用于接种处理高氨氮废水，均有益于提高***效率。
本发明涉及的兼养微生物属于既能在光照条件下进行光合作用又能在黑暗条件下进行化能作用、体积微小的微生物，由于兼养微生物在异养转自养过程中，需要大量的氨氮合成叶绿素及其他光合作用需要的组件如各种蛋白质和酶等，从而能去除废水中的高浓度氨氮，达到净化废水的目的。
本发明的有益效果在于：本发明通过兼养微生物营养代谢途径开发一种简单高效、成本低廉的生物高浓度氨氮废水处理方法。该工艺可以用来进一步满足大规模工业化废水处理并大大降低成本。
本发明引入了改变兼养非生物营养代谢途径的方法，用来处理高氨氮废水。处理完的废水又可以回收利用，满足了微藻工业化处理废水应用的要求，是一条经济、高效地制微藻污水处理的新途径。收获的微藻细胞可以进一步处理用于生物能源和动物饲料等的制备。
附图说明
图1a为小球藻在自养和混养培养基中生长曲线图。
图1b为小球藻在异养培养基中的生长曲线图。
图2为小球藻的显微形态观察。
图3a、3b、3c、3d为兼养微生物处理高氨氮废水效果图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。
实施例1
高氨氮耐受藻株—小球藻(Cholorellasorokiniana)本地筛选，该藻株既能在光合作用的自养生长，又能在黑暗条件下异养生长，还能同时在上述条件下混养生长。从图2可知该小球藻是圆形，细胞大小为2～5μm的真核兼养微生物。其自养、异养和混养培养下的生长特性如图1a、图1b所示。
图1a代表小球藻在自养和混养培养基中生长曲线图，P代表自养培养，M代表混养培养，M1-M50代表混养培养时有机碳浓度(即，有机碳初始还原糖浓度)。从图1a可以看出，相同时间内混养细胞生物量远远高于自养培养生物量；且有机碳浓度与混养生物量成正比。
图1b代表小球藻在异养培养基中的生长曲线图。其中H代表异养培养，H1-H50代表异养培养时有机碳浓度。从图1b可以看出，相同时间内异养细胞生物量远远高于自养培养生物量，与混养生物量相当；有机碳浓度与自养生物量成正比。
因此，采用混养和异养高密度培养快速积累微藻生物量用于下一步实验是非常可行的。
1)兼养微生物的转接与培养：于-70℃冰箱中接种小球藻细胞，并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照异养培养活化藻株，异养条件如下：葡萄糖浓度20g/L；通入空气，通气量200L/h；培养过程中采用30μmol/m2/s的日光照射，pH值为7；总培养时间为120小时；
2)在富含有机碳培养基中高密度培养：将生长在固体培养基上的小球藻单菌落接种至250mL摇瓶中摇床培养，温度控制在28℃±5℃；当细胞进入对数生长末期后，接入富含有机碳培养基在生物反应装置中进行高密度异养培养，生物反应装置包括摇瓶、通气瓶、各种光生物反应器、发酵罐和开放培养池等，异养培养条件如下：在培养基中加入葡萄糖至初始还原糖浓度为20g/L，通入空气，通气量220L/h；培养过程中采用28μmol/m2/s的日光照射，pH值为7；总培养时间为130小时，直到细胞对数生长期，细胞密度达到109；
3)兼养微生物异养细胞的收获：取对数生长后期或稳定期的高密度异养培养的细胞，6000r/min低转速离心收获，收获的兼养微生物异养细胞用无菌水冲洗两次，然后再次收获；
4)转接到高氨氮废水进行自养培养，吸收高浓度氨氮并净化废水：将收获的兼养微生物异养细胞加入高氨氮废水中进行自养培养，兼养微生物异养细胞与高氨氮废水的体积比为1：30，营养转化过程中需要吸收大量的高氨氮营养物用于合成叶绿体相关组件和各种与光合作用有关的酶，从而达到净化废水的目的；
自养培养条件如下：温度为28℃；光照培养氮源为氨氮，通过加入不同量的NH4Cl调节高氨氮废水中氨氮初始浓度，使氨氮初始浓度在40mg/L～160mg/L之间，其中NH4Cl的浓度为40mg/L、80mg/L和160mg/L；通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量120L/h；CO2浓度3％；培养过程中采用150μmol/m2/s的日光照射，pH值为7，总培养时间为200小时；
高氨氮废水配方如下：NaCl0.007g/L、MgSO4·7H2O0.002g/L、CaCl2·2H2O0.004g/L、KH2PO40.0085g/L、K2HPO40.0217g/L、Na2HPO40.025g/L、微量金属溶液0.1ml/L，其中微量金属溶液组成：H3BO35.7g/L、MnCl2·4H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O11g/L、FeSO4·7H2O2.5g/L、Na2MoO4·2H2O0.15g/L、Na2EDTA25g/L和CoCl2·6H2O0.8g/L。
结果显示在氨氮初始浓度为80mg/L的高氨氮废水中氨氮去除率最高可达12.5mg/L/d；在氨氮初始浓度为160mg/L的高氨氮废水中氨氮去除率最高可达11.6mg/L/d利用兼养微生物营养转化策略能高效除高氨氮废水，如图3a、图3b和图3c所示。其中，NS,M为丰氮混养高密度培养；NS,H为丰氮异养高密度培养；NS,P丰氮自养培养；ND,M为限氮混养培养；ND,H为限氮异养培养；ND,P为限氮自养；80,160,240为初始氨氮浓度。
本实施例中，自养培养基配方为：K2HPO4·3H2O0.04g/L、MgSO4·7H2O0.075g/L、CaCl2·2H2O0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001g/L、NaNO31.5g/L、Na2CO30.02g/L和A5微量元素液1.5ml/L；其中，A5微量元素液组成：H3BO32.86g/L、MnCl2·4H2O1.81g/L、ZnSO4·7H2O0.222g/L、NaMoO4·2H2O0.39g/L、CuSO4·5H2O0.079g/L和CoCl2·6H2O0.05g/L。
异养培养基配方同上，并加入不同有机碳至初始还原糖浓度为1～20g/L，最优15g/L。
混养培养基配方同上，并加入不同有机碳和无机碳，有机碳至初始还原糖浓度为1～20g/L，最优15g/L。无机碳为0.001％～100％CO2，最优2％，或无机碳NaHCO3或Na2CO3或两者的混合，浓度为0.1～100g/L，最优0.2g/L。
南昌本地某氨氮工厂收集的高氨氮废水，其总氮浓度在270～280mg/L之间，氨氮浓度在240～260mg/L之间。首先采用本发明的处理方法依次进行高密度培养和收获微藻细胞，然后再转入高氨氮废水中进行自养培养，结果显示采用本发明的利用兼养微生物丰氮转换处理高氨氮废水的方法，在该高氨氮废水中氨氮去除率最高可达12.3mg/L/d，如图3d所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
1)兼养微生物的转接与培养：于-70℃冰箱中接种兼养微生物菌株并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照自养、混养或异养培养；
所述自养培养条件如下：温度为20～45℃；光照培养氮源的初始浓度为1～15g/L，氮源为甘氨酸或酵母提取物；通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50～300L/h，CO2浓度0.9～3％；培养过程中采用10～200μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9之间；总培养时间为50～400小时；
所述混养和异养培养条件如下：通入空气，通气量100～400L/h；培养过程中采用5～40μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9之间；总培养时间为72～200小时；其中，异养培养在培养基中加入不同有机碳源至初始还原糖浓度为0.1～200g/L；混养培养在培养基中加入不同有机碳源和无机碳源，有机碳源至初始还原糖浓度为0.1～200g/L，无机碳源为质量分数0.001％～100％CO2，或浓度为0.1～100g/L的NaHCO3或Na2CO3或两者的混合；
2)在富含有机碳培养基或富含机碳废水中高密度培养：将平板培养物接种至生物反应装置在富含有机碳培养基或富含机碳废水中高密度异养培养，直到细胞对数生长期细胞密度达到106～1010；异养培养条件如下：在培养基中加入不同有机碳源至初始还原糖浓度为0.1～200g/L，通入空气，通气量100～400L/h；培养过程中采用5～40μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9；总培养时间为72～200小时；
3)兼养微生物异养细胞的收获：取对数生长后期或稳定期的异养细胞，在2000～8000r/min的低转速下离心收获，收获的兼养微生物异养细胞用无菌水冲洗两次，然后再次收获；
4)转接到高氨氮废水进行自养培养，吸收高浓度氨氮并净化废水：将收获的兼养微生物异养细胞加入高氨氮废水中进行自养培养，兼养微生物异养细胞与高氨氮废水的体积比为1:1～1:100，营养转化过程中需要吸收大量的高氨氮营养物用于合成叶绿体相关组件和各种与光合作用有关的酶，从而达到净化废水的目的；
所述自养培养条件如下：温度为20～45℃；光照培养氮源为氨氮，通过加入不同量的NH4Cl调节高氨氮废水中氨氮初始浓度，使氨氮初始浓度在40mg/L～160mg/L之间，其中NH4Cl的浓度为40mg/L、80mg/L和160mg/L；通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50～300L/h；CO2浓度0.1～15％；培养过程中采用10～200μmol/m2/s的日光照射，pH值控制在5～9，总培养时间为4～400小时；
所述高氨氮废水配方如下：NaCl0.007g/L、MgSO4·7H2O0.002g/L、CaCl2·2H2O0.004g/L、KH2PO40.0085g/L、K2HPO40.0217g/L、Na2HPO40.025g/L、微量金属溶液0.1ml/L，其中微量金属溶液组成：H3BO35.7g/L、MnCl2·4H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O11g/L、FeSO4·7H2O2.5g/L、Na2MoO4·2H2O0.15g/L、Na2EDTA25g/L和CoCl2·6H2O0.8g/L。
2.根据权利要求1所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：所述自养、混养或异养所用培养基配方为：K2HPO4·3H2O0.04g/L、MgSO4·7H2O0.075g/L、CaCl2·2H2O0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001g/L、NaNO31.5g/L、Na2CO30.02g/L和A5微量元素液1.5ml/L；其中，A5微量元素液组成：H3BO32.86g/L、MnCl2·4H2O1.81g/L、ZnSO4·7H2O0.222g/L、NaMoO4·2H2O0.39g/L、CuSO4·5H2O0.079g/L和CoCl2·6H2O0.05g/L。
3.根据权利要求1所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：步骤1)中，所述兼养微生物优选为微藻或光合细菌。
4.根据权利要求1所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：步骤2)中，所述有机碳源优选为葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解物、木薯淀粉水解物、糖蜜、核糖、脱氧核糖、核酮糖、乙酸、丙酸、丁酸或甘油。
5.根据权利要求3所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：步骤2)中，所述有机碳源初始还原糖浓度为1～20g/L。
6.根据权利要求1所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：步骤2)中，所述富含有机碳废水优选为生活废水、造纸厂废水、糖蜜废水、啤酒厂废水，奶制品加工厂废水、沼气发酵废水或动物粪便废水。
7.根据权利要求2所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：所述微藻优选为小球藻属、筒柱藻属、硅藻、菱形藻、裂壶藻、杜氏藻属、栅藻、微绿球藻、衣藻属、扁藻或空球藻属。
8.根据权利要求2所述的兼养微生物营养转化用于高氨氮废水处理的方法，其特征在于：所述光合细菌选自蓝细菌或紫色细菌，所述蓝细菌选自聚球蓝细菌属或大颤蓝菌属，所述紫色细菌选自红螺菌属、红假单胞菌属或红微菌属。
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