CN110408544A

CN110408544A - 利用水产养殖废水培养微藻的方法

Info

Publication number: CN110408544A
Application number: CN201910823455.6A
Authority: CN
Inventors: 高锋; 李晨; 杨红丽
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2019-11-05

Abstract

本发明提供利用水产养殖废水培养微藻的方法，属于微藻养殖领域，该方法包括微藻的扩大培养；水产养殖废水的预处理；在处理后的废水中加入烷基聚葡糖苷至浓度为1‑3g/L后培养微藻，所用微藻为小球藻。本发明能够抑制亚硝酸细菌的生长，抑制氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再转化为硝氮，提高小球藻的氨氮去除率及溶解氮去除率；能够促进accD基因的表达，保证小球藻较高的生物量的同时提高小球藻的脂质积累量。

Description

利用水产养殖废水培养微藻的方法

技术领域

本发明属于微藻养殖领域，具体涉及利用水产养殖废水培养微藻的方法。

背景技术

随着经济的发展，由于人们对水产品的需求日益增加，但捕捞量却不能满足市场需求，因此水产养殖业得到了迅猛的发展，在养殖业迅速发展的同时，也带来了相应的环境问题。大量养殖废水直接排放至水环境中，使得养殖厂周边的水体环境恶劣，危害水生生物，也给我国渔业经济带来了巨大损失。由此看来，对于水产养殖废水处理剂应用技术的探索就变得尤为重要了。利用微藻处理水产养殖废水是一项污水资源化生物技术，目前，主要发展的微藻水质处理技术，包括藻类塘、活性塘、固定化藻类、光生物反应器等。Bogan等次提出并研究集约化培养微藻用于处理废水的方法。Bosman等在南非进行大规模的研究时，考虑到高效藻类塘可去除工业中的含氮废水，由此认为，要充分发挥藻类除氮的潜力，必须采用多级藻类***。这也表明了利用微藻净化水产养殖废水的可行性，由于水产养殖***大多由一个或多个浅水池塘组成，阳光易透入水体至池底，气质交换便利，有利于微藻的生长，降低培养微藻的成本。

现有技术如授权公告号为CN 102732425 B的中国发明专利，该发明公开了一种利用畜禽粪便初级废水生产微藻的方法，包括如下步骤：1)废水处理：对畜禽粪便初级废水进行絮凝处理，取上清液，加水稀释至COD为1000mg/L以下，通入臭氧曝气灭菌，然后静置；2)微藻培养：将藻种接种到步骤1)所得液体中，进行光照培养，培养过程中通入空气，并通入CO2以维持液体pH值在5-7。该发明的初级畜禽粪便废水的预处理方法，可以在不具备废水厌氧消化的情况下，用初级废水养殖微藻，臭氧灭菌可以除去废水中复杂的菌群，使养殖***运行稳定，降低微藻的培养成本，提高了微藻的生物量，有利于实现微藻的规模培养和畜禽粪便废水的资源化。

发明内容

本发明的目的在于提供利用水产养殖废水培养微藻的方法，该方法能够抑制亚硝酸细菌的生长，抑制氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再转化为硝氮，提高小球藻的氨氮去除率及溶解氮去除率；能够促进accD基因的表达，保证小球藻较高生物量的同时提高小球藻的脂质积累量。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种利用水产养殖废水培养微藻的方法，包括：

水产养殖废水的预处理；

微藻的活化培养；

用处理后的废水培养微藻；

其中，微藻为小球藻，处理后的废水中加入烷基聚葡糖苷至浓度为1-3g/L。小球藻对废水中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的去除效果不显著，主要以氨态氮为主来吸收无机态氮，在用小球藻处理水产养殖废水时，硝氮和亚硝氮的浓度在初期的变化幅度呈均匀波动状态，随后硝氮大幅增加，亚硝氮的变化趋势与硝氮保持一致，这是由于小球藻在吸收氮元素时，水中的亚硝酸细菌会率先吸收NH4⁺-N，并将一部分氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再由硝酸细菌转化为硝氮，进行硝化反应。烷基聚葡糖苷绿色无毒，能够完全被生物降解，加入废水中后能对亚硝酸细菌的生长进行抑制，抑制氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再转化为硝氮，减轻亚硝氮对细菌和小球藻的毒害作用，提高小球藻的氨氮去除率及溶解氮去除率，从而提高水产养殖废水的净化效果。

作为优选，微藻对废水中氨氮的去除率﹥85％，溶解氮的去除率﹥84％。微藻对不同形态的氮的吸收具有选择性，优选氨氮，通过抑制氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再转化为硝氮，提高氨氮的去除率，提高总氮的去除率。

作为优选，扩大培养用培养基为TAP培养基；微藻的扩大培养温度为26-30℃，光照强度为400-800Lux，培养时间为18-20d。TAP培养基中营养丰富并且营养配比均匀，使小球藻能快速适应环境，所以藻细胞增长较快，在提供的培养条件下，微藻生物量的积累量较高。

作为优选，废水预处理的方法为：先用0.45μm滤膜过滤，再稀释2-3倍。用0.45μm滤膜过滤，能够去除养殖废水中的浮游动植物和悬浮颗粒，对废水进行稀释能够使废水中的营养成分迅速得到降低，有利于微藻的生长和脂质的积累。

作为优选，水产养殖废水预处理后，其氨氮浓度为350-420mg/L、亚硝氮浓度为0.09-1.8mg/L、硝氮浓度为6-15mg/L、溶解性磷浓度为20-30mg/L、化学需氧量为400-800mg/L。通过预处理对废水中营养盐的浓度进行控制，可以避免污染性营养物胁迫微藻的生长或对藻细胞产生毒害作用。

作为优选，处理后的废水中补加三甲基甘氨酸。微藻在不利的环境因素下，如氮、磷等必要的营养元素缺乏而不缺乏碳源的情况下，可以在细胞内积累大量的脂质，但同时也会抑制微藻的生物量。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸合成过程中的关键限速酶。植物体中催化脂肪酸合成的主要是原核类型ACCase，小球藻质体中存在原核类型的ACCase，它具有四个亚基，其中只有β亚基(accD)是在质体中合成，其它三个亚基都是在胞质溶胶中合成转运到质体中完成组装，在小球藻营养条件充分的条件下添加三甲基甘氨酸，能够促进accD基因的表达，accD表达量的提高有利于脂肪酸的合成，从而在保证小球藻较高生物量的同时提高小球藻的脂质积累量。

作为优选，废水中微藻accD基因表达量的增加量≧5.5倍。小球藻accD基因的表达明显增加能够促进脂肪酸的合成，从而提高小球藻的脂质积累量。

作为优选，处理后的废水中补加FeCl₃·6H₂O至浓度为4-5mg/L。废水中缺铁导致微藻细胞中光合作用相关酶和电子传递受阻，影响微藻的正常生长和代谢，微藻生物量及脂质含量均为最低；而当补加的Fe³⁺浓度过高时，微藻生物量开始降低，表现出高浓度抑制的现象。适宜浓度的Fe³⁺对微藻生物量及脂质含量都有很好的促进作用。

作为优选，处理后的废水中补加MgSO₄·7H₂O至浓度为40-50mg/L。镁是叶绿素的组成成分，在叶绿素合成和光合作用中起重要作用，适宜的Mg²⁺浓度能够很好的促进微藻生物量及脂质的积累。

作为优选，废水培养微藻的培养条件为：温度26-28℃，光照强度为4000-5000Lux，初始pH为6.5-7.5，培养时间为16-18d。本发明提供的培养温度、光照强度和初始pH有利于增加废水中培养的微藻的生物量，且培养16-18d时微藻对废水的净化能力、微藻的生物量和脂质积累量均较好。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过水产养殖废水预处理，对废水中营养盐的浓度进行控制，可以避免污染性营养物胁迫微藻的生长或对藻细胞产生毒害作用；

2)本发明通过对环境条件和营养盐条件的优化，提高小球藻的生物量和脂质累积量；通过向废水中补加三甲基甘氨酸，促进accD基因的表达，促进脂肪酸的合成，在保证小球藻较高生物量的同时提高小球藻的脂质积累量；

3)本发明通过向废水添加烷基聚葡糖苷，抑制亚硝酸细菌的生长，抑制氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再转化为硝氮，减轻亚硝氮对细菌和小球藻的毒害作用，提高小球藻的氨氮去除率及溶解氮去除率，提高水产养殖废水的净化效果。

附图说明

图1为培养周期内亚硝氮浓度变化曲线；

图2为培养周期内硝氮浓度变化曲线；

图3为小球藻对氨氮、溶解氮、DIP、COD的去除率；

图4为小球藻生物量标准曲线及线性回归方程；

图5为小球藻的生物量和脂质含量。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种利用水产养殖废水培养微藻的方法，包括：

小球藻的活化：取50mL三角瓶，配制15-20mL TAP培养液，灭菌待用。在无菌条件下从保存藻种的离心管中吸取50μL藻液，并在三角瓶中充分打匀，放置低温、弱光条件下培养，待培养液颜色逐渐变绿时转至恒温光照培养箱，26℃，光照强度5000Lx，光照时长14h/d的条件下继续培养15d，得活化藻种。

小球藻的扩大培养：取10L广口瓶作为反应器，加入7L TAP培养基，将活化的藻种接种于瓶中，匀速通气，瓶口加盖相应大小的海绵以防止外界杂物的进入，同时将瓶置于特定的光照培养架上，培养温度为26℃，光照强度800Lux，光照时长14h/d的条件下培养18d。

甲鱼养殖废水的预处理：经0.45μm滤膜过滤，去除养殖废水中的浮游动植物和悬浮颗粒，再稀释2倍后使用，稀释后的废水的氨氮浓度为362.4mg/L、亚硝氮浓度为0.9mg/L、硝氮浓度为10.59mg/L、溶解性磷浓度为24.93mg/L、化学需氧量为376.67mg/L。

用处理后的废水培养微藻：在预处理后的废水中补加烷基聚葡糖苷至浓度为1.5g/L、三甲基甘氨酸至浓度为0.8g/L、FeCl₃·6H₂O至浓度为4.2mg/L、MgSO₄·7H₂O至浓度为45mg/L，后将废水加入柱式光生物反应器中，将扩大培养得到的小球藻以0.24g/L的浓度接种到废水中，调节初始pH至6.8，通入空气提供无机碳源，并使小球藻处于悬浮状态，然后将该柱式光生物反应器置于温度26-28℃，光照强度5000Lux，光照时间14h/d的条件下培养10d。

对比例1：

预处理后的废水中未补加烷基聚葡糖苷，其余部分和实施例1完全一致。

对比例2：

预处理后的废水中未补加三甲基甘氨酸，其余部分和实施例1完全一致。

试验例1：

亚硝氮、硝氮浓度的测定：

在18d的培养周期内，每隔1d取出10mL水样，离心，取上清a。采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定亚硝氮，采用酚二磺酸分光光度法测定硝氮。亚硝氮、硝氮的浓度测定结果见图1、图2。

微藻净化水产养殖废水能力的测定：

取培养18d的水样，离心，取上清。

采用上述方法测定亚硝氮、硝氮的含量，采用纳氏试剂分光光度法测定氨氮(NH₄ ⁺-N)的含量，采用钼酸铵分光光度法测定溶解磷(DIP)的含量，采用重铬酸钾分光光度法测定化学需氧量(COD)，溶解氮的含量为氨氮、亚硝氮、硝氮的总量。根据测得数据计算小球藻对氨氮、溶解氮、DIP、COD的去除率，结果见图3。

由图1、图2可以看出，与对比例1相比，实施例1的微藻培养过程中，能够抑制氨氮转化为中间状态的亚硝氮，再转化为硝氮。

由图3可以看出，与对比例1相比，实施例1中的氨氮和溶解氮的去除率明显较高，这说明预处理后的废水中补加烷基聚葡糖苷能够减轻亚硝氮对细菌和小球藻的毒害作用，提高小球藻的氨氮去除率及溶解氮去除率，提高水产养殖废水的净化效果。

试验例2：

accD基因表达水平的测定：

从光生物反应器中采收小球藻，参照Promega公司的SV Total RNA IsolationKit操作手册，提取小球藻的总RNA，以随机引物作为反转录引物，反转录反应体系为：100ng/μL的随机引物1.0μL，200ng/μL的总RNA 5.0μL，10mmol/L的dNTP 2.0μL，无RNA酶水5μL，70℃水浴5min，置于冰上冷却3min，短暂低速离心；加入5×反转录Buffer 4μL，RNA酶抑制剂1.0μL，反转录酶1.0μL，缓缓上下吸打至均匀，25℃水浴5min，50℃温育60min，70℃水浴15min，终止反应。

取上述步骤得到的反转录产物作为RT-PCR的模板，以管家基因18S作为内参，在MJ公司的Option Real–time PCR仪上进行RT-PCR扩增。PCR扩增引物包括：

accD基因扩增引物：

正向引物：

TTGTGTTTCGGCTTGTGCTG

反向引物：

CCACCGAGTTCTTCCAGAA

18S基因扩增引物：

正向引物：

CCTGCGGCTTAATTTGACTC

反向引物：

GCGAACCAACCGTGACTATT

RT-PCR扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，10μmol/L正向引物0.5μL，10μmol/L反向引物0.5μL，cDNA 0.5μL，5×Sybergreen染料0.2μL，补加双蒸水至25μL，95℃变性30s，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。

反应结束，由熔解曲线判定PCR反应的特异性，根据荧光曲线的Ct值以及标准曲线计算定量结果，计算分析accD基因的相对表达量。

从RT-PCR得到目的基因和内标基因的Ct值，见表1，可以通过2^-△△Ct计算出accD基因mRNA丰度的差异。

表1 RT-PCR分析accD基因和18S基因结果

组别	accD基因Ct值	18S基因Ct值
			实施例1	6.02847±0.33245	3.38272±0.56511
对比例2	8.76543±0.44316	3.41368±0.44982

通过表1所得Ct值代入2^-△△Ct可以得出实施例1accD基因mRNA的相对表达量比对比例2增加了5.5倍，这说明，预处理后的废水中补加三甲基甘氨酸能够促进accD基因的表达。

试验例3：

小球藻生物量的测定：

将原藻液稀释0、2、4、8和16倍，利用蒸馏水做参比，测定每份藻液的OD680，并测定出每份藻液烘干至恒重时的质量，绘制标准曲线。小球藻生物量标准曲线及线性回归方程见图4。

测定培养18d的小球藻在680nm处的吸光度，代入线性回归方程计算小球藻生物量。

脂质含量的测定：

取培养18d的藻液，5000rpm离心10min，取沉淀，冷冻真空干燥后，用无菌水悬浮。

超声波细胞破碎：破碎3s，间歇2s，一个周期循环90次，重复3个周期。

氯仿甲醇提取法：将收集的藻泥用5mL无菌水悬浮，用超声波细胞破碎机破碎后,加入体积比为1:2的氯仿和甲醇的混合液，使氯仿：甲醇：水＝1:2:0.8(V/V/V)，充分振荡；加入氯仿，使得氯仿：甲醇：水＝1:1:0.4(V/V/V)，充分振荡，过夜；加入无菌水，使得氯仿：甲醇：水＝1:1:0.9(V/V/V)，后4800rpm下离心15min，静置分层；取下相液体，室温挥发干燥，称重，得粗脂干重。小球藻生物量和脂质含量的测定结果见图5。

由图5可以看出，实施例1与对比例2中小球藻的生物量无明显差别，但实施例1中的脂质含量明显高于对比例2，这说明，预处理后的废水中补加三甲基甘氨酸有利于脂肪酸的合成，在保证小球藻生物量的同时提高小球藻的脂质积累量。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种利用水产养殖废水培养微藻的方法，其特征在于，包括：

1)微藻的扩大培养；

2)水产养殖废水的预处理；

3)用处理后的废水培养微藻；

其中，所述微藻为小球藻，所述步骤3)的废水中加入烷基聚葡糖苷至浓度为1-3g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻对废水中氨氮的去除率﹥85％，溶解氮的去除率﹥84％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中扩大培养用培养基为TAP培养基；所述微藻的扩大培养温度为26-30℃，光照强度为400-800Lux，培养时间为18-20d。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中废水预处理的方法为：先用0.45μm滤膜过滤，再稀释2-3倍。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)水产养殖废水预处理后，其氨氮浓度为350-420mg/L、亚硝氮浓度为0.09-1.8mg/L、硝氮浓度为6-15mg/L、溶解性磷浓度为20-30mg/L、化学需氧量为400-800mg/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)的废水中补加三甲基甘氨酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中微藻accD基因表达量的增加量≧5.5倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)的废水中补加FeCl₃·6H₂O至浓度为4-5mg/L。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)的废水中补加MgSO₄·7H₂O至浓度为40-50mg/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)的培养条件为：温度26-28℃，光照强度为4000-5000Lux，初始pH为6.5-7.5，培养时间为16-18d。