CN102533944B - 用于甲基化dna的富集和测序的半甲基化接头及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于分析样品DNA的甲基化状况的半甲基化接头，包含此类半甲基化接头的试剂盒，此类半甲基化接头和试剂盒的用途，以及使用此类半甲基化接头分析样品DNA的甲基化状况的方法。

Description

用于甲基化DNA的富集和测序的半甲基化接头及其用途

发明领域

本发明属于分子生物学领域。特别地，本发明提供了用于分析样品DNA的甲基化状况的半甲基化接头，包含此类半甲基化接头的试剂盒，此类半甲基化接头和试剂盒的用途，以及使用此类半甲基化接头分析样品DNA的甲基化状况的方法。

发明背景

DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，因此，DNA甲基化已成为目前新的研究热点之一^[1-3]。

目前研究DNA甲基化的方法主要包括以下几种。

一种方法通过用重亚硫酸盐(Bisulfite)处理DNA并进行测序来进行DNA甲基化的研究。该方法是研究甲基化最常用也是最准确的方法，其在完成大规模测序分析后可对一些特异位点进行甲基化特异性PCR(MSP&BSP)验证。该方法的缺陷是，对于一些大基因组而言(例如，对于人类基因组3G，测序需要至少100G以上的数据)，测序规模庞大，成本过高，不适宜大样本量的比较性研究^[4]。

另一种方法利用全基因组芯片杂交技术来研究全基因组甲基化状况。该方法包括：对DNA进行重亚硫酸盐处理；将处理后的DNA与设计好的全基因组甲基化芯片杂交，从而通过杂交的结果来体现甲基化和非甲基化信息；并且杂交得到的DNA序列可通过测序或PCR来验证。该方法的主要问题在于，由于杂交技术本身的缺陷而导致的实验的灵敏度和重复性不好，不能用于进行精确的甲基化研究和大样本量样本的比较性研究^[1-3]。

另外一种方法将甲基化敏感(非敏感)类限制性内切酶与重亚硫酸盐分析法结合起来，通过比较酶切位点信息来研究DNA的甲基化(RRBS、MMSDK)。此类方法规模小且易操作，但其只能对全基因组范围内能够被所用的限制性内切酶识别的位点进行甲基化研究，因此该方法同样不能用于进行全基因组范围的精确甲基化研究。

另一种方法利用甲基化DNA特异性结合抗体或甲基化特异性结合蛋白对全基因组范围的甲基化DNA进行富集，然后通过高通量测序(MeDIP-SEQ、MBD-SEQ)来研究甲基化信息。此类方法能够对全基因组范围的甲基化DNA进行选择性研究，但是由于蛋白和DNA的相互作用受到很多未知因素的影响，因此，该方法的重复性不好。另外，由于免疫反应得到的DNA没有进行重亚硫酸盐处理，因此，该方法不能实现对单个碱基进行精确甲基化研究^[4]。

因此，迫切需要开发新的DNA甲基化分析方法，以帮助快速、全面和精确地分析全基因组的DNA甲基化状态。

发明内容

除非另有定义，否则本文中所使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为了更好的理解本发明，特别提供了下列术语的定义。

如本文中所使用的，“接头”通常是双链核酸分子，其长度可以为至少20个碱基，至少30个碱基，至少40个碱基，至少50个碱基，至少60个碱基，至少70个碱基，至少80个碱基或更多个碱基。

如本文中所使用的，术语“半甲基化的接头”是指这样的接头，所述接头的正链的胞嘧啶(C)全部被甲基化修饰，而负链的胞嘧啶全部未被甲基化修饰。

如本文中所使用的，术语“接头的正链”是指接头中在连接反应后连接至目的DNA片段的核苷酸链的5′端的那条链，术语“接头的负链”是指接头中在连接反应后连接至目的DNA片段的核苷酸链的3′端的那条链。

在一个方面，本发明提供了半甲基化的接头，其中，接头的正链的胞嘧啶(C)全部被甲基化修饰，而负链的胞嘧啶全部未被甲基化修饰。

在一个优选实施方案中，半甲基化的接头的正链的5′端序列与其负链的3′端序列不互补，并且正链的3′端序列与负链的5′端序列互补(即，半甲基化的接头是“分叉的”)，优选，互补部分的长度可以为例如至少10个碱基，至少20个碱基，至少30个碱基，至少40个碱基或至少50个碱基。在另一个实施方案中，半甲基化的接头的正链和负链完全互补。不受任何理论束缚，现认为，“分叉的”半甲基化接头有利于控制接头与DNA片段连接的方向，避免不必要的错连。

在另一个实施方案中，本发明的半甲基化的接头的正链的3′端或负链的5′端具有悬突，所述悬突的长度可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个或更多个碱基。在一个优选实施方案中，本发明的半甲基化接头的正链的3′端具有单个碱基(例如，碱基T)的悬突。

在一个实施方案中，本发明的半甲基化接头的正链和负链分别以单链形式单独存在，并且在使用前，所述正链和负链通过退火而形成双链的接头。在另一个实施方案中，本发明的半甲基化接头以双链(即，退火在一起的正链和负链)形式存在。

在一个优选实施方案中，甲基化修饰的胞嘧啶包括但不限于，5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

在另一个方面，本发明提供了分析样品DNA的甲基化状况的方法，其包括以下步骤：

1)将本发明的半甲基化的接头连接至待分析的样品DNA的两端，从而得到连接产物；

2)用重亚硫酸盐处理步骤1)中的连接产物，以将非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；

3)以重亚硫酸盐处理后的产物为模板，用能够与经重亚硫酸盐处理的半甲基化接头的负链退火的引物进行第一次互补链合成，从而得到第一次互补链合成产物；

4)用尿嘧啶糖基化酶处理步骤3)中的第一次互补链合成产物，以除去含有尿嘧啶的DNA链；

5)以尿嘧啶糖基化酶处理后的产物为模板，加入dTTP、dATP、dGTP以及经第一分子实体修饰的dCTP，并使用能够与半甲基化接头的正链的互补链退火的引物，进行第二次互补链合成，从而得到第二次互补链合成产物；

6)使用能够与第一分子实体特异性结合的第二分子实体，富集并分离掺入了经第一分子实体修饰的dCTP的第二次互补链合成产物，从而得到分离产物；

7)对步骤6)中的分离产物进行测序分析，其中，除了所使用的接头序列外，分离产物中的胞嘧啶即为所述样品DNA中被甲基化的胞嘧啶。

在一个优选实施方案中，待分析的样品DNA包括但不限于，文库DNA和基因组DNA，例如细菌，病毒，植物或动物的基因组DNA，优选哺乳动物的基因组DNA，特别是人的基因组DNA。一般而言，待分析的样品DNA通常是双链核酸分子。

在一个优选实施方案中，任选地在步骤1)之前，对待分析的样品DNA进行片段化。用于片段化DNA的方法包括但不限于，雾化法、超声片段化法、HydroShear法或酶切处理法，并且优选是超声片段化法。在一个优选实施方案中，使用超声片段化法将样品DNA打断为200-400bp的片段。

在一个优选实施方案中，使用本领域已知的连接方法将本发明的半甲基化的接头连接到样品DNA的两端，并且连接到样品DNA的两端的半甲基化的接头可以是相同的或不同的。可使用的连接方法包括但不限于，平端连接法，TA连接法，粘性末端连接法等，并且优选是TA连接法。

例如，在一个实施方案中，将样品DNA片段化，然后利用聚合酶如klenow DNA酶、T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶补平片段化的DNA的末端，然后使用聚合酶在补平了末端的DNA片段的3′末端加上碱基‘A’，然后使用T4DNA连接酶将3′末端添加了碱基‘A’的DNA片段连接至半甲基化的接头。

在一个优选实施方案中，第一分子实体和特异性结合第一分子实体的第二分子实体可以是本领域熟知的彼此特异性结合的成对的分子实体，例如，抗原和抗体或抗原结合片段，配体和受体，生物素和亲和素等等。在一个实施方案中，第一分子实体是抗原(或抗体)，第二分子实体是特异性结合所述抗原(或抗体)的抗体(或抗原)。在一个实施方案中，第一分子实体是配体(或受体)，第二分子实体是特异性结合所述配体(或受体)的受体(或配体)。在一个实施方案中，第一分子实体是生物素(或亲和素)，第二分子实体是特异性结合生物素(或亲和素)的亲和素(或生物素)。

在一个特别优选的实施方案中，第一分子实体是生物素，第二分子实体是链霉亲和素。在一个实施方案中，经第一分子实体修饰的dCTP是生物素修饰的dCTP，例如生物素-11-dCTP，并且第二分子实体是链霉亲和素磁珠。

在一个实施方案中，任选地在对步骤6)中的分离产物进行测序分析之前，使用针对重亚硫酸盐处理后的半甲基化接头而特别设计的引物对分离产物进行PCR扩增。在一个实施方案中，对步骤6)中的分离产物进行高通量测序分析，例如使用SOLEXA、SOLID和Roche 454测序平台进行高通量测序。

在一个实施方案中，任选地，在任意两个相邻步骤之间，进行产物的回收和纯化。优选，在所有步骤之间进行产物的回收与纯化。

在另一个方面，提供了包含本发明的半甲基化接头的试剂盒。在一个优选实施方案中，所述试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况。在一个实施方案中，本发明的试剂盒中的半甲基化接头的正链和负链分别以单链形式单独存在，并且在使用前，所述正链和负链通过退火而形成双链的接头。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒中的半甲基化接头以双链(即，退火在一起的正链和负链)形式存在。

在又一个实施方案中，所述试剂盒还包括其他试剂，例如用于分析样品DNA的甲基化状况的其他试剂，例如，能够与经重亚硫酸盐处理的半甲基化接头的负链退火的引物，能够与半甲基化接头的正链的互补链退火的引物，针对重亚硫酸盐处理后的半甲基化接头而特别设计的引物，经第一分子实体修饰的dCTP，以及与第一分子实体特异性结合的第二分子实体。在一个实施方案中，经第一分子实体修饰的dCTP是生物素修饰的dCTP，例如生物素-11-dCTP，并且第二分子实体是链霉亲和素磁珠。

在另一个方面，提供了本发明的半甲基化接头和/或本发明的试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况的用途。

在另一个方面，提供了本发明的半甲基化接头用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案在重亚硫酸盐处理法的基础上，采用了本发明人设计的半甲基化的接头，并结合了亲和层析技术和高通量测序技术，从而实现对甲基化的DNA的富集和测序，其具有以下显著优点：

1)与目前常规使用的全基因组重亚硫酸盐测序法相比，本发明的技术方案富集了全基因组范围的甲基化DNA，从而大大减少了测序规模，节约了时间和成本；

2)与利用甲基化DNA特异性结合抗体或甲基化DNA特异性结合蛋白对全基因组范围的甲基化DNA进行富集，然后通过高通量测序(MeDIP-SEQ、MBD-SEQ)来研究甲基化信息的方法(该方法由于蛋白(或抗体)和DNA的相互作用受到很多未知因素例如DNA的纯度、浓度、作用时间、温度、效率等的影响而重复性不好，并且由于没有结合重亚硫酸盐处理法而无法对单个碱基进行精确的甲基化研究)相比，本发明的技术方案能够对全基因组范围的甲基化DNA进行全面的、无偏向性的富集，克服了抗体或蛋白反应的不足，并且能够精确地进行单碱基甲基化图谱分析；

3)本发明不仅能够对CpG位点的甲基化进行捕获研究，而且也能够很好的对非CpG位点的甲基化进行捕获分析，克服了以往方法不能对非CpG位点的甲基化进行检测的缺点。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图概述

图1示意性展示了基于生物素和链霉亲和素相互作用的全基因组甲基化DNA高通量测序文库的构建流程图。其中，C^m表示甲基化的胞嘧啶，C^b表示生物素化的胞嘧啶，A、U、T、C和G分别表示腺嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶和鸟嘌呤。

图2是展示炎黄(YH)全基因组甲基化测序数据(40G)中甲基化率与测序深度的关系的图。以之前的YH全基因组甲基化测序数据(40G)(参见Li Y，Zhu J，Tian G，Li N，Li Q，et al.(2010)The DNA Methylomeof Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.PLoS Biol 8(11)：e1000533.doi：10.1371/journal.pbio.1000533，其以其全文通过引用并入本文)为基础，利用覆盖12号染色体的测序数据，以5kbp为区间，统计每个区间内的所有C的平均测序深度以及位点甲基化率(根据全基因组甲基化测序数据判断该位点的甲基化率，其中，甲基化率为支持该位点甲基化的测序条数与该位点所有测序条数的比例)，并针对甲基化率与测序深度的关系作图。

图3是展示炎黄(YH)全基因组甲基化测序数据(1.4G)中甲基化率与测序深度的关系的图。以之前的YH全基因组甲基化测序数据(1.4G)(参见Li Y，Zhu J，Tian G，Li N，Li Q，et al.(2010)The DNAMethylome of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.PLoSBiol 8(11)：e1000533.doi：10.1371/journal.pbio.1000533)为基础，利用覆盖12号染色体的测序数据，以5kbp为区间，统计每个区间内的所有C的平均测序深度以及位点甲基化率，并针对甲基化率与测序深度的关系作图。

图4是展示在使用本发明的方法获得的测序数据(1.4G)中甲基化率与测序深度的关系的图。以使用本发明的方法获得的测序数据(1.4G)为基础，利用覆盖12号染色体的测序数据，以5kbp为区间，统计每个区间内的所有C的平均测序深度，并针对甲基化率(以上文所述的根据之前YH全基因组甲基化测序数据获得的甲基化率为标准)与测序深度的关系作图。

具体实施方式

在本发明的实施例中，以一个中国男性的外周血DNA(10μg)(已完成其全基因组甲基化测序，参见，Li Y，Zhu J，Tian G，Li N，LiQ，et al.(2010)The DNA Me thylome of Human Peripheral BloodMononuclear Cells.PLoS Biol 8(11)：e1000533.doi：10.1371/journal.pbio.1000533)为样品，构建了基于生物素和链霉亲和素相互作用的全基因组甲基化DNA高通量测序文库，并利用Illumina Hiseq2000(参见例如，Product preview：Illuminas equencing.Pub.no.7702009-732，其以其全文通过引用合并入本文)对该文库进行了高通量测序。特别地，图1示意性概述了使用本发明的半甲基化接头来构建甲基化DNA高通量测序文库的流程(参见图1)。

1、使用的仪器和试剂

表1：主要实验仪器

表2：主要实验试剂

表3：本发明所使用的引物

2、实验方法

(1)DNA的片段化

使用covaris超声仪将全基因组DNA 10μg(100ng/μL)打断成主带在100-350bp左右的片段。

covaris超声仪的参数设置如下：

打断后的DNA用QI Aquick PCR Purification Kit(QIAGEN)进行纯化，并将经纯化的DNA溶于35μL洗脱缓冲液中。

(2)DNA片段的末端修复

按照下列的配比准备末端修复反应混合物：

打断后的DNA片段             35μL

T4PNK Buffer 10×           50μL

dNTPs mix                   4μL

T4DNA Polymera se           5μL

Klenow DNA Enzyme           1μL

T4 Polynucleotide Kinase    5μL

总体积                      100μL

使用Thermomi xer，将反应混合物在20℃下温育30分钟，然后用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化。纯化后的DNA溶于32μL洗脱缓冲液中。

(3)在DNA片段的3′末端添加‘A’碱基

按照下列的配比准备反应混合物：

末端修复后的DNA                32μL

10x Blue buffer                5μL

dATP(1mM)                      10μL

Klenow exo-(3′-5′exo minus)  3μL

总体积                         50μL

使用Thermomixer，将反应混合物在37℃下温育30分钟，然后用MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN)进行纯化。纯化后的DNA片段溶于10μL洗脱缓冲液中。

(4)半甲基化接头的连接

将10μL的半甲基化接头_负链(100μM)和10μL的半甲基化接头_正链(100μM)混合，并在94℃下温育5分钟，在65℃下温育15分钟，然后自然冷却，从而得到50μM的半甲基化接头。

然后按照下列的配比准备连接反应混合物：

3′末端加‘A’的DNA片段    10μL

T4DNA ligase buffer        25μL

半甲基化接头(50μM)        3μL

T4DNA ligase               5μL

H₂O                        7μL

总体积                     50μL

使用Thermomixer，将反应混合物在20℃下温育15分钟，然后用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化。纯化后的连接产物DNA溶于30μL洗脱缓冲液中。

(5)连接产物的凝胶回收纯化

将连接产物DNA在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分离。选择200-450bp大小的片段，并将目的片段条带切胶转移至1.5mL离心管中。用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)进行凝胶回收纯化，回收产物溶于30μL洗脱缓冲液中。

(6)连接产物的重亚硫酸盐处理

根据制造商的说明书，使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit ^TM(ZYMO RESEARCH，美国)，对步骤(5)中获得的产物进行重亚硫酸盐处理。处理后的DNA溶于30μL洗脱缓冲液中。

(7)第一次互补链合成

按照下列的反应体系制备第一次互补链合成反应混合物：

步骤(6)中获得的产物                    30μL

用于第一次互补链合成的引物(10μM)      1μL

dNTP mix(2.5Mm)                        4μL

JumpStart^TM Taq Buffer(10X)            5μL

JumpStart^TM Taq DNA Polymerase         0.5μL

H₂O                                    9.5μL

总体积                                 50μL

PCR反应条件：95℃，30秒；95℃，2分钟；58℃，2分钟；72℃，5分钟；4℃保存。第一次互补链合成的产物用MiniElute PCRPurification Kit进行凝胶回收纯化，回收产物溶于20.5μL洗脱缓冲液中。

(8)尿嘧啶DNA糖基化酶消化

步骤(7)中获得的产物        20.5μL

10X UDG Reaction Buffer    2.5μL

Uracil-DNA Glyco sylase    2μL

总体积                     25μL

使用Thermomixer，将反应混合物在37℃下温育30分钟。使用MiniElute PCR Purification Kit回收纯化反应体系中的DNA(使用一个离心纯化柱)，将纯化后的DNA溶于20μL的洗脱缓冲液中。

(9)第二次互补链合成

按照下列的反应体系准备第二次互补链合成反应混合物：

步骤(8)中获得的产物                  20μL

用于第二次互补链合成的引物(10μM)    1μL

dATP(10mM)                           0.3μL

dTTP(10mM)                           0.3μL

dGTP(10mM)                           0.3μL

生物素-11-dCTP(1mM)                  3μL

JumpStart^TM Taq Buffer(10X)          5μL

JumpStart ^TM Taq DNA Polymerase      0.5μL

H₂O                                  19.6μL

总体积                               50μL

PCR反应条件：95℃，30秒；95℃，2分钟；58℃，2分钟；72℃，5分钟；4℃保存。第二次互补链合成的产物用MiniElute PCRPurification Kit进行凝胶纯化回收，回收产物溶于50μL洗脱缓冲液中。

(10)甲基化DNA的捕获

通过捕获掺入了生物素-11-dCTP的DNA片段，从而捕获(富集)样品中的甲基化DNA。具体方法如下。

1)振荡重悬链霉亲和素磁珠(Streptavidin Magnetic Beads)，并吸取20μL重悬的磁珠置于1.5ml离心管中。将离心管放置在磁分离架上静置1分钟，小心吸取并弃去上清。

2)用50μL磁珠结合缓冲液(Bead Binding Buffer)洗涤磁珠。小心重悬磁珠，将离心管放置在磁分离架上，静置1分钟，弃去上清。重复此步骤一次。

3)用50μL磁珠结合缓冲液(Bead Binding Buffer)重悬磁珠。加入步骤(9)中的回收产物50μL，并在20℃温育15分钟。每2分钟重悬磁珠一次，混合时应尽可能的轻柔(每2分钟以600rpm震荡15秒)。

4)弃去上清，洗涤磁珠四次，每次洗涤用200μL的磁珠洗涤缓冲液(Bead Wash Buffer)轻轻吹打重悬磁珠五次。

5)弃去上清，加入38.5μL的洗脱缓冲液(EB)重悬磁珠。将磁珠转移至新的1.5ml离心管中。

(11)捕获的DNA产物的PCR扩增

步骤(10)捕获的DNA                  38.5μL

dNTP mix(2.5mM)                    4μL

JumpStart^TM Taq Buffer(10X)        5μL

JumpStart^TM Taq DNA Polymerase     0.5μL

用于PCR扩增捕获的片段的引物_正向   1μL

用于PCR扩增捕获的片段的引物_反向   1μL

总体积                             50μL

PCR反应条件：94℃，30秒；15个循环的94℃，30秒、60℃，30秒、72℃，30秒；72℃，1分钟；4℃保存。扩增后，用PCR PurificationKit对扩增产物进行纯化，并将扩增产物(即，文库)溶于35μL洗脱缓冲液中。

(12)文库的检测与测序

1)分别使用Agilent 2100 Bioanalyzer和QPCR定量来检测文库产量(参见例如，Bernd Buehler，Holly H.Hogrefe，Graham Scott，等人Rapid quantification of DNA libraries for next-generationsequencing.Methods.2010.50：S15-S18)。

Agilent 2100 Bioanalyzer的检测结果表明，文库的质量浓度为5.85ng/μL，摩尔浓度为34.6nM；QPCR的定量结果表明，文库的摩尔浓度为38.2nM。

2)使用Illumina Hiseq 2000，对采用本发明的方法(生物素捕获法)而富集了甲基化DNA的测序文库进行高通量测序(参见例如，Product preview：Illumina sequencing.Pub.no.7702009-732)。测序数据结果及高级比较分析如下。

3、实验结果

(1)基本测序数据结果

根据本发明的方法而构建的测序文库的基本测序结果如表4中所示。

表4：根据本发明的方法而构建的全基因组甲基化DNA文库的高通量测序的基本分析结果

根据表4可知，测序数据的比对率达到95.6％，这表明测序数据基本都是可用的；重复序列比例仅为5.31％，这表明由PCR所产生的重复序列的比例很低，基本不存在测序偏向；重亚硫酸盐处理的转换效率达到99.2％，这表明非甲基化的胞嘧啶位点基本完全转换为尿嘧啶。

(2)测序深度与甲基化率的关系

测序深度与甲基化率之间的关系能很好地反映对甲基化DNA的富集的效果：如果DNA片段的测序深度随着片段的甲基化率的增加而相应增加，则表明，所采用的方法对甲基化DNA起到了很好的富集作用。因此，在本实施例中，首先研究了之前已获得的YH全基因组甲基化测序数据(参见Li Y，Zhu J，Tian G，Li N，Li Q，et al.(2010)The DNAMethylome of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.PLoS Biol8(11)：e1000533.doi：10.1371/journal.pbio.1000533)中测序深度与甲基化率之间的关系。具体而言，采用覆盖12号染色体的测序数据，以5kbp为区间，统计每个区间内的所有C的平均测序深度以及位点甲基化率，并分析二者的关系(参见图2和3)。同时，本实施例还研究了，使用本发明的方法而获得的测序数据中测序深度与甲基化率之间的关系(参见图4)。

图2和3分别展示了YH全基因组甲基化测序数据(40G和1.4G)中甲基化率与测序深度的关系。图2和3显示，在使用常规技术对全基因组甲基化DNA进行测序的情况下，测序深度与甲基化率之间不存在显著的统计学相关性。相比之下，图4显示，在使用本发明的方法获得的测序数据(1.4G)中，测序深度与片段甲基化率之间存在显著的统计学相关性：测序深度随着片段甲基化率的增加而相应增加。由以上分析可知，本发明使用的半甲基化接头和方法显著且有效地富集了甲基化的DNA，为DNA的甲基化研究提供了有力的工具。

参考文献

本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的专利、出版物和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见按下列文献目录提供。

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Claims (36)

1.一种半甲基化的接头，所述接头的正链的胞嘧啶(C)全部被甲基化修饰，而负链的胞嘧啶全部未被甲基化修饰，所述接头的长度为至少20个碱基，所述接头的正链的5′端序列与其负链的3′端序列不互补，并且正链的3′端序列与负链的5′端序列互补，或者所述接头的正链的3′端或负链的5′端具有悬突。

2.权利要求1的半甲基化的接头，所述接头的正链的3′端具有单个碱基的悬突。

3.权利要求2的半甲基化的接头，所述单个碱基为碱基T。

4.包含权利要求1-3任一项的半甲基化的接头的试剂盒。

5.权利要求4的试剂盒，所述接头的正链和负链分别以单链形式单独存在，或，所述接头以双链形式存在。

6.权利要求4的试剂盒，所述试剂盒还包括用于分析样品DNA的甲基化状况的其他试剂。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述其他试剂是指能够与经重亚硫酸盐处理的所述半甲基化接头的负链退火的引物，能够与所述接头的正链的互补链退火的引物，针对重亚硫酸盐处理后的所述接头而特别设计的引物，经第一分子实体修饰的dCTP，或者与第一分子实体特异性结合的第二分子实体。

8.权利要求7的试剂盒，所述第一分子实体和第二分子实体是抗原和抗体或抗原结合片段，或者配体和受体，或者生物素和亲和素。

9.权利要求7的试剂盒，所述经第一分子实体修饰的dCTP是生物素修饰的dCTP，并且第二分子实体是链霉亲和素磁珠。

10.权利要求9的试剂盒，其中所述生物素修饰的dCTP是指生物素-11-dCTP。

11.权利要求4-10任一项的试剂盒，所述试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况。

12.权利要求1-3任一项的半甲基化的接头和／或权利要求4-11任一项的试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况的非诊断或治疗目的的用途。

13.权利要求12的用途，所述样品DNA是文库DNA或基因组DNA。

14.权利要求13的用途，其中所述基因组DNA是指细菌，病毒，植物或动物的基因组DNA。

15.权利要求13的用途，其中所述基因组DNA是指哺乳动物的基因组DNA。

16.权利要求13的用途，其中所述基因组DNA是人的基因组DNA。

17.权利要求1-3任一项的半甲基化的接头用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况。

18.用于分析样品DNA的甲基化状况的非诊断或治疗目的的方法，其包括以下步骤：

1)将权利要求1的半甲基化的接头连接至待分析的样品DNA的两端，从而得到连接产物；

2)用重亚硫酸盐处理步骤1)中的连接产物，以将非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；

3)以重亚硫酸盐处理后的产物为模板，用能够与经重亚硫酸盐处理的半甲基化接头的负链退火的引物进行第一次互补链合成，从而得到第一次互补链合成产物；

4)用尿嘧啶糖基化酶处理步骤3)中的第一次互补链合成产物，以除去含有尿嘧啶的DNA链；

5)以尿嘧啶糖基化酶处理后的产物为模板，加入dTTP、dATP、dGTP以及经第一分子实体修饰的dCTP，并使用能够与半甲基化接头的正链的互补链退火的引物，进行第二次互补链合成，从而得到第二次互补链合成产物；

6)使用能够与第一分子实体特异性结合的第二分子实体，富集并分离掺入了经第一分子实体修饰的dCTP的第二次互补链合成产物，从而得到分离产物；

7)对步骤6)中的分离产物进行测序分析，其中，除了所使用的接头序列外，分离产物中的胞嘧啶即为所述样品DNA中被甲基化的胞嘧啶。

19.权利要求18的方法，所述样品DNA是文库DNA或基因组DNA。

20.权利要求19的方法，所述基因组DNA是指细菌，病毒，植物或动物的基因组DNA。

21.权利要求19的方法，所述基因组DNA是指哺乳动物的基因组DNA。

22.权利要求19的方法，所述基因组DNA是人的基因组DNA。

23.权利要求18的方法，在步骤1)之前，对所述样品DNA进行片段化。

24.权利要求23的方法，通过雾化法、超声片段化法、HydroShear法或酶切处理法将所述样品DNA片段化。

25.权利要求23的方法，通过超声片段化法将所述样品DNA片段化。

26.权利要求18的方法，通过平端连接法，TA连接法，粘性末端连接法将所述接头连接到所述样品DNA的两端。

27.权利要求18的方法，通过TA连接法将所述接头连接到所述样品DNA的两端。

28.权利要求18的方法，所述第一分子实体和第二分子实体是抗原和抗体或抗原结合片段，或者配体和受体，或者生物素和亲和素。

29.权利要求18的方法，所述第一分子实体是生物素，并且第二分子实体是链霉亲和素；

30.权利要求18的方法，所述经第一分子实体修饰的dCTP是生物素修饰的dCTP，并且第二分子实体是链霉亲和素磁珠。

31.权利要求30的方法，所述生物素修饰的dCTP是指生物素-11-dCTP。

32.权利要求18的方法，在对步骤6)中的分离产物进行测序分析之前，使用针对重亚硫酸盐处理后的半甲基化接头而特别设计的引物对分离产物进行PCR扩增。

33.权利要求18的方法，对步骤6)中的分离产物进行高通量测序分析。

34.权利要求33的方法，使用SOLEXA、SOLID和Roche454测序平台进行高通量测序分析。

35.权利要求18的方法，在任意两个相邻步骤之间，进行产物的回收和纯化。

36.权利要求18的方法，在所有步骤之间进行产物的回收与纯化。

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